Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) üzerine Hücre yapışma Nanotopology

Summary

Bir substrat üzerindeki hücre adezyon Topolojisi değişken açılı toplam iç yansıma floresan mikroskobu (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle ölçülür.

Abstract

Yüzey topoloji, bir substrat üzerinde büyüyen hücrelerin örneğin, Değişken Açılı Toplam İç Yansıma Floresan Mikroskopi (VA-TIRFM) tarafından nanometre hassasiyetle belirlenir. Hücreler şeffaf slaytlar üzerinde ekili ve homojen onların plazma membranında dağıtılan bir floresan işaretleyici ile inkübe edilir. Aydınlatma yiten elektromanyetik alanın farklı nüfuz etme derinliği olan toplam iç yansıma (TIR) ​​değişken açılı altında paralel bir lazer ışını ile gerçekleşir. Yaklaşık 10 farklı açılarda ışınlaması üzerine floresans görüntülerinin kaydedilmesi birkaç nanometre hassasiyetle hücre yüzey mesafeleri hesaplamak için izin verir. Çeşitli hücre çizgileri, örneğin, kanser hücreleri ve daha az habis hücreleri arasında yapışma farklılıkları, bu şekilde tespit edilmektedir. Buna ek olarak, kimyasal ya da fotodinamik tedavi bağlı hücre yapışmasının olası değişiklikleri kontrol edilebilir. Süper-çözünürlük diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında mikroskopi ışığa maruz tutulurcanlı hücreler, çok küçük, ve herhangi bir hasar meydana beklenmektedir.

Introduction

Kırılma indisi n, ₁ arasında bir ortam içinden ilerleyen bir ışık ışını kırılma indisi n, _2, ikinci bir ortam bir ara yüz karşılaştığında <n _1, toplam iç yansıma kritik açı daha büyük olan oran Θ tüm açılar meydana gelir Θ _c = arcsin (n = ₂ / n _1). Tamamen yansıyan olmasına rağmen olay ışık demeti ben göre ikinci orta ve arabirimden dik mesafe z'nin katlanarak çürüklerini giren bir fani elektromanyetik alan çağrıştırıyor (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) olarak verilen, dalga boyu λ da penetrasyon derinliği ile elektromanyetik alan ve d (Θ) yoğunluğunu tekabül

d (Θ) = (λ/4π) (n ₁ ² sin ² Θ - n ₂ ^{2) -1 / 2}

Literatürde ^1,2 bildirildiği kadarıyla, ben ₀ e iletim faktörü T (Θ) ve oranı n ₂ / n ₁ ile çarpılır olayla ışık yoğunluğuna karşılık gelir. Bu, ışının elektrik alan vektörü geliş düzlemine (olay ve yansıyan ışın tarafından yayılmış düzlemi yani) için polarize dik ise, bu iletim faktörü tarafından verilir

T (Θ) = 4 cos ² Θ / [1 - (n = ₂ / nL ₁₎ ^2]

TIRFM ölçümleri de tespit edilen floresans yoğunluğu, ışık emme numune, tüm tabakaları üzerine entegre edilmiş ve ilgili boya floresans kuantum verimi ile η yanısıra algılama Ω katı açı ile çarpılarak gerekmektedir. ^3. Daha önce belirtildiği gibi, bu yoğunluk ile tanımlanabilir

Ben _F (Θ) = (Θ) OC (z) AT ^{E-z / d (Θ)} dz

Eğer bağımsız f tüm faktörler florofor konsantrasyon c (Z) hemen hemen sabit olduğu için kabul edilir ise ROM geliş açısı Θ ve koordinat z deneysel sabit A. Denklem 3 içinde yer alır, analitik olarak çözülebilir

- Ya da bütün koordinatlar z ≥ Δ de arayüzünden bir mesafe Δ sahip olan hücrelerinin sitoplazması içinde, örn. Bu durumda, tamamlayıcı z = Δ kadar z = ∞ elde olarak hesaplanmalıdır

Ben _F = A c T (Θ) d (Θ) ^{e-Δ / d (Θ)}

- Ya da z arasında = Δ - t / 2 ve z = Δ + T / 2, kalınlığı t, ince bir tabaka içinde, yani, örneğin, arayüz Δ bir mesafede bulunan bir hücre membranıdır. Bu durumda, floresan yoğunluğu olarak hesaplanabilir;

Ben _F = A c T (Θ) ^{te-Δ / d (Θ),}

t Δ ile karşılaştırıldığında küçük ise.

floresans yoğunluğunu _{I, F} görüntü değişken açılı için kaydedilir ise Eşitlik (4) ve (5) hücre-yüzey mesafeleri ent "> Δ, hesaplanabilir Θ, ve eğer ln (I _F / T d) (denklem 4) ya da ln (I _F / T) (denklem 5) bu açılar için 1 / d'lik bir fonksiyonu olarak değerlendirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan zar işaretleyici laurdan (s. altında) için değerlendirme Denk. 5'e göre yapıldı.

Daha önce ^3, görüntü elde bildirdi ve değerlendirme gerektirdiğinden dolayı
- Numune üzerinde uyarma ışık homojen dağılımı,
- 2-katmanlı model (yüzey ve sitoplazma için kırılma indisleri n ₁ ve n ₂ ile, sırasıyla) geçerlilik. Plazma zar çok ince ise, bu, tutar, ve hücre dışı ortamda (hücre ile alt tabaka arasında) tabaka gelen ışığın dalga boyu ile karşılaştırıldığında küçük ise.

Buna ek olarak, bir orta açıklık sayısal(Tipik olarak A ≤ 0.90) mikroskop objektif lens dielektrik arayüz yakın alanına radyasyon anizotropi dolayı parlaklık sapmaları engellemek için avantajlıdır.

Protocol

1. Hücre Ekici ve Kuluçka

1. Tohum tek tek hücreler, örneğin, U373-MG-251 ya da U-MG, glioblastoma hücrelerinin bir cam slayt üzerinde 100 hücre / mm ^{2 'tipik} bir yoğunlukta ve (örneğin RPMI 1640 ve% 10 fetal dana serumu ile takviye kültür ortamı 4872 saat süreyle büyümelerini ve 37 bir inkübatör kullanarak antibiyotikler) ° C ve% 5 CO _2.
2. Bir zar işaretleyici, örneğin 6-Dodekanoil-2-dimetilamino 8 uM (kültür ortamı, ⁴⁾ ya da bir işaretleyici sitoplazma 'lik bir konsantrasyonda 60 dakika için uygulanan naftalen (laurdan), örneğin, kalsein acetomethlyester bir 40 dakika boyunca uygulanmış olan hücreler inkübe ^4,5, 5 uM ^3, ışığa ya da ilişkili bir zar konsantrasyonu, örneğin, protoporfirin IX, öncülü olan 5-aminolevulinik asit (1 mM 5-ALA) ile 4 saat kuluçka üzerine indüklenen.
3. Kültür ortamı veya fosfat ile yıkayın hücrelerini salin (PBS) floresan mikroskobu önce tamponlu. </ Li>

2. VA-TIRFM

1. Dik bir mikroskop, örneğin, Zeiss Axioplan kullanımı ve Ref de tarif edildiği gibi, bir aydınlatma cihazı tarafından kondansatör değiştirin. Hemi-küresel veya optik (bkz. Şekil 1) nesnenin slayt birleştiğinde hemi-silindirik cam prizma ile 3.
2. Paralel collimated Lazer ışını kullanarak hangi cam prizma ve tekrar ileri optik bileşenlerin (örn. içbükey ayna) numune yüzeyi (telesentrik öğrenci ışını) üzerinde paralel bir ışın sonuçlar tarafından görüntüleme sonra. Elektrik alan vektörü geliş düzlemine dik polarize olmasına özen gösterin.
3. Örnek düzleminde görüntülenmiş ve sıklığı değişken açılı (nesne ışını) altında örnek yanar kondenser içinde bulunan ayarlanabilir bir ayna kullanın. Her bir pozisyon sıklığı iyi tanımlanmış bir açı karşılık geldiği goniometrik ölçümler ³ tarafından belirlendiği gibi ayarlanabilir ayna, bir adım motoru tarafından tahrik edilebilir
4. Kritik açısı kullanılarak ayarlanabilir ayna açısal konumunun kalibre Θ _c = 61.3 °, sabit bir değer olarak bir su-cam geçiş için. Θ _c floresan boya (örneğin 1 mM flavin mononükleotid, FMN) suda çözülür Θ değişimi üzerine canlandırılabilir. De ayna pozisyon Θ = Θ _c ayna pozisyonlama programında depolanır.
5. Sıcaklık, kazanç, kayıt süresi ve vardiya hız dahil kameranın parametrelerini (arka aydınlatmalı Andor Ixon EMCCD, DV887DC, ANDOR Teknoloji, Belfast, UK ⁶⁾ ayarlayın.
6. Uygun büyütme ve tercihen orta sayısal diyafram (örneğin 40 × / 0,75 ya da 63 × / 0.90 suya daldırma) bir objektif lens kullanın ve mikroskop nesne slayt yerelleştirilmesine. Cam prizma ile numunenin optik bağlantıyı sağlamak için immersiyon yağı kullanın. Değişimi üzerine özdeş örnekleri floresans görüntüleri kaydedinaydınlatma açısı (Θ ≥ Θ Θ _c ile _c hücre cam arayüzü için 64,5 ° karşılık gelen). 0.5 ° veya 1 ° adımlarla 66 ° -74 ° arasında bir açı aralığı önerilir. Floresans saptama için uygun bir uzun pas veya band geçiren filtre kullanın.

3. Veri Analizi

1. Değişik açılardan Θ yanı sıra kamera ayarlarını (arka plan ayrımcılık), dalgaboyu ve cam kırılma endeksi (= 1.52 n + ₁₎ ve hücreler de kaydedilen görüntüleri (ASCII formatında örneğin) (n ₂ = 1.37) okuyun değerlendirme programı içine (LabView; NanoCell). Için parametreler penetrasyon derinliği d (Θ) ve iletim faktörü T (Θ) her set otomatik olarak hesaplanır.
2. Denklem 5 (membran belirteci) veya Denklem 4 (sitoplazma işaretleyici), homojen olmayan ile bireysel görüntülere göre Δ hücre-substrat mesafeleri değerlendirilmesinde kullanılan görüntüleri seçinaydınlatma (açığa e, g. çizgili) hariç tutulabilir.
3. Hücre-yüzey topolojisi görüntüleri hesaplama ve görüntüleme için uygun bir renk kodu belirleyin. Şekil 2 'de gösterildiği gibi tek tek piksel değerlendirilmesi profilleri boyunca, görüntülenebilir. Bu profilleri uygun kalitesi için bir gösterge olarak kullanılabilir.
4. Değerlendirme protokolü saklayın.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Örnek deneyler nazik Prof Oca Mollenhauer, Moleküler Onkoloji Bölümü, Güney Danimarka Üniversitesi, Odense tarafından verilen genetiği U251-MG glioblastoma hücreleri ile yürütülmektedir. Bu U251 hücreleri iki yola çıkılarak alt klonlar olarak tümör baskılayıcı genler TP53 veya PTEN kullanarak aşırı ifade edilir bir Tet-On indüklenebilir ifade sistemi, bu hücrelerin azalması tümörojenik potansiyeli sergilemek ve daha az malign olarak kabul edilebilir böyle. Supresör geni olmadan son derece malign U251-MG hücreleri kontrol grubu olarak kullanıldı ve U251-edilirMG vahşi tip hücrelerin bir başka karşılaştırma için hizmet vermektedir. Pikosaniye bakliyat, yarı sürekli bir dizi (;: 391 nm; darbe enerjisi: 12 PJ; tekrarlama oranı: dalgaboyu sürücüsü PDL 800-B, Picoquant, Berlin, Almanya ile LDH400 40 MHz) yayan bir lazer diyot bir uyarım kaynağı olarak kullanılır.

Şekil olarak bir aktif TP53 tümör baskılayıcı gen ve laurdan (8 uM; 60 dk) ile inkübe U251-MG glioblastoma hücreleri 3 TIRFM görüntüleri 66.0 ° insidansı açıları, 69.0 ° ve 73.0 ° ve penetrasyon derinlikleri karşılık için tasvir edilmiştir yaklaşık 140 nm yiten elektromanyetik alan, 75 nm ve 60 nm, sırasıyla. Penetrasyon derinliği floresans azalması ile yoğunluğu azalır (terazi bakın) ve hücrelerin daha yüzeysel siteleri (üzerlerine kenarları örneğin odak kişileri) kaynaklanmaktadır. Hücre-substrat mesafeleri (0-600 nm arasında değişen bir renk kodu ile Şekil 3d görüntülenmiştir) kuvvetle üzerine arasındaki hücreleri üzerinde değişiklikly birkaç nanometre (beyaz-sarı) ve 250-300 nm (koyu kırmızı), yani odak kişileri ve daha büyük hücre-substrat mesafeleri yakın çevresinde bulunmaktadır. Şekil 4b, hücre-substrat mesafeleri U251-MG kontrolü ve 80-100 nm tipik değerleri ile vahşi tip hücreleri (sarı için oldukça sabit iken aynı bir aktifleştirilmiş baskılayıcı gen PTEN (Şekil 4d) ile U251-MG glioblastoma hücreleri için geçerlidir ) ve 150-200 nm (turuncu-kırmızı; Şekil 4a).

Şekil 1. Dik mikroskop VA-TIRFM için aydınlatma cihazı. Bir adım motoru tarafından tahrik edilen bir ayarlanabilir ayna ± 0.25 ° 'lik bir açısal izin vermektedir.

Bir PIX için Şekil 2. Değerlendirilmesi profiliel (şematik). Ne ln [I _F / T (Θ)] 1 / d (Θ) bir fonksiyonu olarak çizilir, yamaç hücre-substrat mesafe Δ temsil eder. Bu eğim, genellikle yaklaşık bir hassasiyet ±% 10 ile tespit edilir. Bir değer - homojen aydınlatma kaynaklanan - işaretlenir ve değerlendirme dışında tutulmuştur.

Şekil 3 laurdan (8 uM, 60 dk) ile inkübasyondan sonra, aktif TP53 baskılayıcı gen ile U251-MG, glioblastoma hücrelerinin TIRFM görüntüler. Aydınlatma çeşitli açılardan (AC) de kaydedilir; 0-600 nm aralığında hücre-yüzey mesafeleri gösterildiği 391 nm, algılama: ≥ 420 nm; resim boyutu: dalgaboyu, bir renk kodu (d). 210 mikron × 210 mikron büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4, bir renk kodu ile gösterilen 0-600 nm aralığında U251-MG glioblatoma hücreleri hücre-yüzey mesafeleri;. (A) vahşi tip (B), kontrol, aktive baskılayıcı gen TP53 (c) hücreleri, (d) aktive supresör geni PTEN olan hücreler; dalgaboyu: 391 nm, algılama: ≥ 420 nm; resim boyutu:. 210 mikron × 210 mikron büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Discussion

Bir yöntem olup nanometre hassas hücre-yüzey uzunluk ölçmek için açıklanmıştır. Halen, süper-çözünürlük mikroskopi yöntemleri, örneğin yapılandırılmış aydınlatma ⁷ veya tek molekül saptama ^8-10 yanı sıra uyarılmış emisyon azalması (STED) mikroskopi ¹¹ hatırı sayılır bir ilgi vardır dayanmaktadır. Bu teknikler hiçbiri, yine de, 50 nm altındaki bir eksenel çözünürlüğe izin vermektedir. Buna ek olarak, 50100 arasında oldukça yüksek ışınım W / cm ² STED mikroskopi için tek bir molekül yöntem ve 3.000 W / cm ² için gereklidir. Bu olasılığı yüksektir birkaç büyüklük, canlı hücreler için böylece hızlı hasar (mW / cm 100 ²⁾ güneş ışınımı aşıyor. VA-TIRFM deneylerde ise, ışınım, hücreler ¹² yaşama zarar vermeden birkaç dakika hatta saat pozlama süreleri, izin, en az 20 mW / cm ² ile sınırlı böylece mul ile uzun süreli deneylertiplemeleriyle maruziyetler de mümkün görülmektedir. Her deney için Ana önkoşulları iyi açısal kalibrasyon ve temiz nesnenin slayt homojen ışıklandırma vardır.

VA-TIRFM teknik ya da biyolojik yüzeyler, bir saydam tabaka için hücre yapışma örneğin ölçümleri ile ilgili çok sayıda konu ile uygulanabilir. Hücre büyümesi, hücre göçü veya hücre ölümü (apoptozisi örn.), bu yüzden, daha detaylı olarak ele alınabilir. Son zamanlarda, hücre yapışması ile ilgili hücre içi kolesterol rolü ⁴ incelenmiştir. Özellikle de, hücre-yüzey temas sayısını en sonunda kendi substrat hücreleri daha büyük bir sayı ayrılması yol açan,% 3050 ile kolesterol üzerine boşalması üzerine, azaldığını ortaya çıktı. Hücre adezyon aynı zamanda yaygın kanser ve diğer hastalıkların ¹³ fotodinamik terapi (PDT) kullanılan ışığa başvurusu üzerine çalışılmıştır. Meğer olmayan fototoksik ışık dozlarda hücre-substrat mesafeleri ile ışınlama üzerineodak adezyon ^4,5 muhafaza ederken hafifçe, (muhtemelen bazı hücre şişmesi nedeniyle) azaltılmıştır. Bu nedenle, PDT dolayı metastaz oluşumunun ortaya çıkması muhtemel değildir. Mevcut deneylerde tümör (glioblastoma) ve daha az malign hücreler arasındaki hücre yapışmasının farklılıklar göstermektedir. Sadece gelecekteki deneyler bu farklı davranış teşhis, farmakolojik ve terapötik uygulamalar için kullanılabilir olup olmadığını ispat edecektir.

Bu hücre-yüzey temas ölçümleri TIRF mikroskopi ¹⁴ başlangıcına kadar uzanmaktadır vurgulanmalıdır. Açısal çözünürlük, ancak oldukça kompleks ekipmanlar ^15, bugüne kadar, ve hücre-substrat topoloji değişken açılı TIRFM ³ izin rutin ölçümler için kompakt bir aydınlatma cihazı sadece gelişim gerekli. Bu prizma-tip TIRFM ek olarak, minyatürleştirme, tek bir nokta (ya da halka) kenarına yakın objektif-tipi TIRFM ^16,17, tarafından tanıtılanmikroskop objektif lens diyafram düzlemi aydınlatılır, böylece ışığın bir açı altında örnek üzerine düşebilir Θ ≥ Θ _C. Bu nedenle, yaklaşık 66-75 ° 'lik bir açısal aralık müsait üst açıklık objektif lens gereklidir. Açı Θ akort Bununla birlikte, hatta bir ticari TIRFM mikroskop içinde gerçekleştirmek zordur az 100 mikron, bir mesafe içinde lazer odak tanımlanmış bir değişim gerektirir. Yüksek diyafram (ve yüksek büyütme) objektif lens Ayrıntılı dezavantajları yakın alan anizotropi ve oldukça sınırlı nesne alanlardır. Bu nedenle, bu makalede açıklandığı gibi hedef türü TIRFM deney düzeneği ile karşılaştırıldığında, hücre-yüzey topoloji ölçmek için tercih edilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubator	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Laminar flow	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10%FCS + 1 % Penicillin / Streptomycin	BIOCHROM		Cultivation medium
Glass object slides	Marienfeld	Pure white glass	Special cleaning procedure used
6-dodecanoyl-2-dimethylamino naphthalene (laurdan)	Molecular Probes		Fluorescent marker (Stock solution: 2 mM in ethanol)
Microscope	Carl Zeiss	Axioplan 1
Laser diode	PicoQuant	LDH 400 with driver PDL 800-B	Wavelength: 391 nm
Single mode fiber system	Point Source	kineFlex	Used with collimating optics
EMCCD camera	Andor	DV887DC	Back illuminated camera