Summary
न्यूरल ट्यूब से भ्रूण तंत्रिका शिखा के अलगाव के उपयोग की सुविधा
Protocol
1. तैयारी प्लेट्स
- हर समय बाँझ तकनीक का प्रयोग करें.
- है Dulbecco पीबीएस (dPBS) के 3.3 एमएल की अंतिम मात्रा में मानव प्लाज्मा एफ एन स्टॉक के 100 μL कमजोर द्वारा तैयार में fibronectin (एफ एन). अंतिम एकाग्रता 30 μg / एमएल है और इस डिग्री सेल्सियस 4 में 1 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- एक बाँझ टिशू कल्चर चार एफ एन समाधान के साथ अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे कवर और 15 मिनट के लिए बैठते हैं. पूरी सतह को कवर किया है सुनिश्चित करें. (चरण 2 और 3) इस समय के दौरान मीडिया बनाओ.
- समाधान FN और प्लेटों को शुष्क करने की अनुमति निकालें. धीरे 500 μL DMEM हटायें DMEM साथ कुओं कुल्ला, और स्व - नवीकरण के 500 μL (एसआर) मध्यम (नीचे देखें) जोड़ें. एक humidified 5 प्रतिशत युक्त सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 ° C पर सेते हैं. विच्छेदन से पहले यह लगभग एक घंटे के पूरा इतना है कि प्लेटों उपयोग करने से पहले शुष्क हो जाएगा.
2. एसआर मध्यम की तैयारी
- Vagal और ट्रंक नेकां की संस्कृति के लिएदस भ्रूण (लगभग एक लिटिर, माउस लाइन की आनुवंशिक पृष्ठभूमि के आधार पर) से, एसआर मध्यम की 25 एमएल तैयार. 12.5 एमएल कम ग्लूकोज DMEM के, 7.5 एमएल Neurobasal मध्यम, 25 μL retinoic एसिड (117 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता), और 25 μL 2 - mercaptoethanol का (50 मिमी अंतिम एकाग्रता) का मिश्रण. मिश्रण अच्छी तरह से.
- 3.75 एमएल चिकी भ्रूण निकालें, 250 μL एन 2 नमक पूरक, 500 μL B27 पूरक और 250 μL पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (1% अंतिम एकाग्रता) जोड़ें. एक .22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से मध्यम फ़िल्टर.
- 10 μL बाँझ IGF1 (20 μg / एमएल अंतिम एकाग्रता) और 20 μL बाँझ bFGF (20 μg / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़ें. Inverting के द्वारा मिश्रण. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
3. धो मध्यम की तैयारी
- के लिए लगभग 10 भ्रूण धोने के माध्यम के 50 एमएल तैयार करते हैं. 35 एमएल कम ग्लूकोज DMEM, 15 एमएल Neurobasal मध्यम, और 500 μL पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (% 1 अंतिम एकाग्रता) के साथ 50 मिलीग्राम बीएसए का मिश्रण. 0.22 के साथ एक बाँझ फिल्टरमाइक्रोन फिल्टर.
4. Collagenase / dispase तैयारी
- 100 मिलीग्राम / एमएल / Collagenase dispase 5 एमएल dPBS 50 μL जोड़ें. मिश्रण अच्छी तरह से.
- एक 0.2 माइक्रोन के साथ सिरिंज फिल्टर फिल्टर और एक बारह अच्छी तरह से थाली के तीन कुओं में से प्रत्येक में 1.5 एमएल जोड़ने. विंदुक शेष कुओं में लगभग 1 एमएल धोने मध्यम. बर्फ पर पूरी थाली स्टोर विच्छेदित ऊतक को पचाने के लिए तैयार है जब तक.
- एक बाँझ धार के साथ P20 और P1000 विंदुक फिल्टर टिप युक्तियाँ काटें. टिप की beveled बढ़त के ठीक नीचे कट. P1000 बंद कटौती पूरे भ्रूण हस्तांतरण जबकि P20 अलग ऊतक के टुकड़े को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाएगा करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
5. 9.5 डीपीसी भ्रूण से vagal और ट्रंक तंत्रिका ट्यूब अलग
- गर्भधारण के लिए समय पर है, बांधों एक योनि प्लग के साथ दोपहर में 0.5 डीपीसी पर विचार कर रहे हैं सुबह प्लग मनाया जाता है. बलिदान और 9.5 डीपीसी पर गर्भाशय को हटा दें.
- गर्भाशय से पत्या निकालें और धीरे आरआँवल से भ्रूण emove. एक बार इस प्रोटोकॉल के साथ अनुभव है, बाँझ dPBS में एक समय में 3-4 9.5 डीपीसी भ्रूण को अलग. बाँझ तकनीक और निष्फल विच्छेदन उपकरणों का उपयोग करें. उपकरण वाष्पदावी विसंक्रण, गर्मी नसबंदी या इथेनॉल में ऊष्मायन द्वारा निष्फल किया जा सकता है.
- पूर्वकाल vagal नेकां के लिए इंसुलिन सुई का उपयोग करते हुए, मध्य कान placode में न्यूरल ट्यूब में कटौती. 4 वें विखंड के पीछे के किनारे पर फिर से कटौती. तंत्रिका ग्रसनी मेहराब और दिल को हटाने के ट्यूब उदर ऊतक छाँटो.
- में ट्रंक नेकां के लिए: इंसुलिन सुई का उपयोग करते हुए, न्यूरल ट्यूब में 16-22 somites (या पिछले विखंड अगर भ्रूण developmentally 22 विखंड चरण से पहले) के बीच के हिस्से को हटा दें.
- जर्दी थैली और जीनोटाइपिंग के लिए किसी भी शेष भ्रूण ऊतक रखें.
6. गैर तंत्रिका बाहरी झिल्ली और mesoderm का हटाया जाना
- तंत्रिका Collagenase dispase में / क्षेत्रों में 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब युक्त रखेंहै. तुरंत धो मध्यम में धो लो.
- पर बाँझ dPBS ऊतक लौटें. बाँझ इंसुलिन सुई का प्रयोग, धीरे से ऊतकों से गैर - तंत्रिका बाहरी झिल्ली को हटा दें और somites न्यूरल ट्यूब से दूर अलग है. विखंड ऊतक से mesoderm के अंतिम शेष भागों धीरे triturating एक कट नीचे P20 टिप का उपयोग करके हटाया जा सकता है. न्यूरल ट्यूब को नुकसान नहीं सावधान रहो. इस बारीकी से निरीक्षण विचूर्णन दौरान.
- एक दूसरे और तीसरे धोने के माध्यम के 30 सेकंड धोने के माध्यम से अलग न्यूरल ट्यूब रखें.
- एसआर मध्यम में एक बार धो, और एक अच्छी तरह से FN-लेपित है कि पहले से तैयार किया गया था (1.3 चरण) के केंद्र में अलग न्यूरल ट्यूब जगह. Hypoxia के कक्ष बाँझ पानी की एक डिश के साथ गीला करना. Hypoxia के कक्ष में पकवान प्लेस और मिश्रित गैस के साथ 3% 2 हे (1% 2 हे, 6% सीओ 2, 93% N 2 का एक मिश्रण युक्त टैंक का उपयोग करें) के लिए कक्ष फ्लश.
- हमेशा कक्ष अत्यंत सावधानी से संभाल करने के लिए था सुनिश्चितटी explants undisturbed हैं और कुओं के केंद्र में रहते हैं.
- 37 में सेते हैं डिग्री सेल्सियस 5-6 कदम के सारांश चित्र 1 में दिखाया गया है.
7. तंत्रिका ट्यूब निकालना
- ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, धीरे से पलायन एक बाँझ इंसुलिन सुई का उपयोग करने कोशिकाओं से दूर तंत्रिका ट्यूब के किनारे चिढ़ा से न्यूरल ट्यूब को हटा दें. निकालें और मध्यम से न्यूरल ट्यूब के रूप में 6.2 चरण में एक बाँझ P20 कटौती का उपयोग त्यागने मध्यम और ताजा एसआर मध्यम (चित्रा 2) के साथ की जगह. यह सबसे आसानी से एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है.
8. प्रतिनिधि परिणाम
ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद 37 ° hypoxic स्थितियों में सी, नेकां कोशिकाओं को न्यूरल ट्यूब से दूर एक लगभग शुद्ध जनसंख्या (चित्र 3a) में चले गए. कभी कभी, कम से कम आदर्श संस्कृतियों मजबूत outgrowths नहीं निकलेगा. उदाहरण के लिए, यह संभव है कि 24 घंटे के बादवह न्यूरल ट्यूब खुद पर उठ curled किया जाएगा और नेकां न्यूरल ट्यूब (3b चित्रा) से दूर विस्थापित नहीं होगा. कभी कभी न्यूरल ट्यूब fibronectin लेपित प्लेट को नहीं देते हैं जाएगा.
हमारे अनुभव में, उप इष्टतम नेकां प्रवास या न्यूरल ट्यूब के अनुलग्नक के साथ समस्याओं पर प्रतिकूल normoxia शर्तों या fibronectin के एकाग्रता द्वारा किया जा सकता है क्रमशः प्रभावित,. Collagenase / dispase के enzymatic गतिविधि बैच और पाचन समय से थोड़ा भिन्न होता है उचित रूप से समायोजित किया जाना चाहिए, तथापि, पन्द्रह मिनट से अब ऊतक हजम नहीं करते हैं. तंत्रिका ऊतक Collagenase / dispase में युक्त ट्यूब की overdigestion भी कमी outgrowths में परिणाम होगा. यदि विखंड ऊतक Collagenase / dispase में ऊष्मायन के बाद आसानी से न्यूरल ट्यूब से निकाल दिया जाता है, न्यूरल ट्यूब को दस मिनट से अधिक समय के लिए incubated जा सकता है. कभी कभी न्यूरल ट्यूब सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न नहीं होगा. यदि यह मामला है, fibronec दोहरी जांचटिन एकाग्रता और hypoxia शर्तों.
जबकि normoxic शर्तों संस्कृति जंगली प्रकार नेकां के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, hypoxic शर्तों के अधिक निकट vivo में 29,30 वातावरण में नकल. हमारे अनुभव में, में hypoxic शर्तों महत्वपूर्ण संवर्धन उत्परिवर्ती नेकां जब हो गया. उदाहरण के लिए, जब Foxd3 उत्परिवर्ती नेकां normoxic शर्तों में संवर्धन किया गया, ट्रंक नेकां नियंत्रण की तुलना में बहुत कम सेल परिणाम था. परिणाम के आकार में यह असमानता जब explants hypoxic शर्तों (चित्रा 4) में सभ्य थे हटा दिया गया था. इसके अलावा, जब जंगली प्रकार न्यूरल ट्यूब explants normoxia में सुसंस्कृत थे, कस्पासे पॉजिटिव कोशिकाओं की संख्या तो अधिक से अधिक समान hypoxia में सभ्य explants की कि (नहीं दिखाया डेटा) था. Hypoxia में सभी नेकां संस्कृति को बनाए रखने, तुलना और अधिक आसानी से नियंत्रण की गतिशीलता और उत्परिवर्ती संस्कृतियों के बीच बनाया जा सकता है.
चित्रा 2 explant से न्यूरल ट्यूब की stepwise हटाने. न्यूरल ट्यूब 24-48 घंटे के बाद हटा दिया जाना चाहिए गैर नेकां कोशिकाओं के साथ प्रदूषण को रोकने के लिए. ए) न्यूरल ट्यूब और नेकां परिणाम (ठोस लाइन) के बीच की सीमा पर ध्यान दें. बी) के साथ एक इंसुलिन सुई के साथ न्यूरल ट्यूब के किनारे कट. सी) न्यूरल ट्यूब त्यागें और ताजा आत्म नवीकरण के माध्यम से मध्यम की जगह. डैश्ड लाइन परिणाम की हद तक इंगित करता है. संक्षिप्त: NT, न्यूरल ट्यूब.
चित्रा 3 प्रतिनिधि परिणाम के उदाहरण हैं. ए) hypoxic स्थितियों में आत्म नवीकरण के माध्यम में 24 घंटे के ऊष्मायन के बाद ठेठ explant परिणाम (धराशायी लाइन परिणाम की हद तक इंगित करता है). बी) संस्कृति में 48 घंटे के बाद नेकां परिणाम को देखते बढ़ाया. सी) कम परिणाम उपज के साथ कम आदर्श संस्कृति. ए और सी ही परिस्थितियों में संवर्धन किया गया. छवियाँ संस्कृति मजबूती में प्राकृतिक सीमा प्रदर्शित करता है. यह न्यूरल ट्यूब अलगाव, एफ एन की एकाग्रता, hypoxic शर्तों, और Collagenase / dispase digestions में समय की क्षमता से प्रभावित किया जा सकता है.
4 नेकां में normoxia बनाम hypoxia के explant संस्कृतियों की इन विट्रो विश्लेषण में आंकड़ा. नियंत्रण (जंगली प्रकार) नेकां normoxic संस्कृति की स्थिति में 48 घंटे के बाद न्यूरल ट्यूब explants से चले कोशिकाओं. इसके विपरीत, Foxd3 उत्परिवर्तीनेकां बहुत normoxia में सेल outgrowths (नेकां outgrowths की रूपरेखा लाल निशान किनारों) कम था. जब तुलनीय explants hypoxic शर्तों के अधीन हो गया को उत्परिवर्ती Foxd3, नेकां explants नियंत्रण करने के लिए तुलना की वृद्धि हुई है, बाद में विश्लेषण की अनुमति. नोट करें, यह व्यवहार vivo में Foxd3 उत्परिवर्ती नेकां के व्यवहार के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध.
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Discussion
भ्रूण के विकास के चरण के लिए सावधान ध्यान दिया जाना चाहिए इस दृष्टिकोण की सफलता सुनिश्चित करने के. जल्दी माउस भ्रूण की somites गिनती दोनों एक कूड़े के भीतर भ्रूण मिलान और अलगाव के लिए न्यूरल ट्यूब की सही क्षेत्रों का निर्धारण चरण के लिए महत्वपूर्ण है. भ्रूण के बीच एक या दो somites के एक बदलाव के विकास के समय का एक उचित सीमा के भीतर है, किए गए प्रयोग के संकल्प पर निर्भर करता है. 9 और 9.5 डीपीसी के बीच एक भ्रूण के 17 और 25 somites के बीच होगा. यदि भ्रूण 25 अधिक somites के है, नेकां के आगे विकास के समय में उन्नत है, और नेकां outgrowths संस्कृति में कम मजबूत हो जाएगा. विखंड संख्या के आधार पर भ्रूण मचान प्रयोगों में सटीक सुविधा जब भ्रूण, और इसलिए नेकां, विकास मंच प्रयोगों के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. एक 9.5 डीपीसी भ्रूण में, vagal नेकां परिभाषित पूर्वकाल पीछे सीमा में पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब से उत्प्रवासित: मध्य कान का placode से 7 विखंड के लिए.इसी तरह, ट्रंक नेकां 8 विखंड स्तर पर न्यूरल ट्यूब से उत्प्रवासित करने के लिए 24 विखंड. नेकां progenitors के अलग आबादी के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित अलग, उन डोमेन में से प्रत्येक के भीतर असतत उप क्षेत्रों से अलग कर रहे हैं. न्यूरल ट्यूब के क्षेत्र में इस्तेमाल के प्रयोग के डिजाइन और अध्ययन किया जा रहा है नेकां क्षेत्र पूर्वकाल पीछे पर आधारित अलग अलग होंगे.
संस्कृति शर्तों के ऊपर वर्णित सहित मध्यम और ऊष्मायन की स्थिति, विशेष रूप से के murine नेकां की संस्कृति के लिए अनुकूलित,. समान एसआर मध्यम पहले चूहा नेकां 11 की संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया था. हमारे हाथ में Neurobasal मध्यम के अलावा के साथ इस चूहा, मध्यम, murine नेकां progenitors के एक मजबूत परिणाम पैदा करता है. इसके अलावा, पिछले काम संवर्धन एवियन नेकां कोशिकाओं के विपरीत, एक फीडर परत के स्तनधारी इस विधि का उपयोग कर 11,13,21,22 नेकां की संस्कृति के लिए अनावश्यक है. जबकि वहाँ कई प्रोटोकॉल normoxic conditi में दोनों एवियन और स्तनधारी नेकां संस्कृति का ब्यौरा 9,22 ons है, हम 23 (चित्रा 4), 20 क्षेत्र में अन्य लोगों के साथ साथ पाया है कि संवर्धन के रूप में, hypoxic शर्तों में murine नेकां कोशिकाओं यहाँ बहुत एड्स अस्तित्व और आत्म नवीकरण का वर्णन, शायद क्योंकि hypoxia के और अधिक निकट से शारीरिक ऑक्सीजन का स्तर mimics के 20,29,30 भ्रूण के भीतर.
आणविक मार्करों की अभिव्यक्ति का मूल्यांकन बहुत नेकां कोशिकाओं और अपने विभेदित डेरिवेटिव के पहचान की सुविधा. इन Foxd3 की अभिव्यक्ति, p75, है और Sox10 नेकां स्टेम कोशिकाओं के लिए शामिल हैं. विभेदित नेकां की मार्करों चिकनी पेशी अल्फा myofibroblasts के लिए (SMA) के actin glia, microphthalmia जुड़े melanocytes के लिए प्रतिलेखन कारक (MITF) glial सूक्ष्मतंतु सम्बन्धी अम्लीय प्रोटीन (GFAP), और बीटा III ट्यूबिलिन, प्रोटीन जीन 9.5 उत्पाद (PGP9.5 के शामिल ), न्यूरॉन्स के लिए peripherin और. इन मार्करों explant दक्षता और नेकां progenitors के भेदभाव का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
"सामग्री> एक बार इस तकनीक में महारत हासिल है, सुसंस्कृत नेकां प्रसार की मात्रा का ठहराव, कोशिका मृत्यु, प्रवास गतिशीलता, और / या भेदभाव की स्थिति सहित assays के एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है नेकां भी clonally से सुसंस्कृत होना करने के लिए आत्म नवीकरण या multipotency की जाँच कर सकते हैं. व्यक्ति नेकां न्यूरल ट्यूब के बाद 23 progenitors. संस्कृतियों से निकाल दिया जाता है, वास्तव में 5 मिनट के लिए 37 पर 100 μl trypsin EDTA (0.25%) में नेकां कोशिकाओं ° अलग कर देना सी. अतिरिक्त धोने मध्यम में में trypsin - EDTA बुझाना (8-10 ) MLS के 800 μl प्रति अच्छी तरह से जोड़ने और व्यक्ति 15 एमएल. धोने मध्यम युक्त ट्यूब को स्थानांतरित करके धीरे से 3 मिनट के लिए 150 XG में कोशिकाओं, अपकेंद्रित्र 1 एमएल एसआर मध्यम में सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल गोली हटाने गणना में एक hemocytometer और उन्हें थाली का उपयोग कोशिकाओं. 25 कोशिकाओं / 2 सेमी की एक घनत्व इन कालोनियों. serially आत्म नवीकरण परख के लिए passaged किया जा सकता है है परख multipotency करने के लिए., 6 दिनों के लिए एसआर माध्यम clonal घनत्व पर नेकां कोशिकाओं को बनाए रखने और फिर भेदभाव के लिए स्विचमध्यम (10 एनजी / एमएल bFGF और 1% लड़की भ्रूण निकालने). संस्कृति hypoxia के तहत भेदभाव माध्यम 8 दिन के लिए 11 से ऊपर के रूप में आणविक मार्कर के साथ कॉलोनी संरचना का विश्लेषण करने से पहले कोशिकाओं.निष्कर्ष में, माउस भ्रूण से नेकां कोशिकाओं को अलग करने के लिए इस विधि FACS के उपयोग के बिना premigratory नेकां कोशिकाओं के एक फीडर मुक्त पक्षपाती संस्कृति पैदा करता है. इन कोशिकाओं का उपयोग प्रयोगों का विश्लेषण आसानी से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. हालांकि इस तकनीक सरल है, स्थानांतरण, आत्म नवीकरण भेदभाव, और नेकां विशेषताओं के अध्ययन के लिए अपने आवेदन विशाल कर रहे हैं. इसके अलावा, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस भ्रूण से नेकां अलग करने के नेकां प्रवास, अस्तित्व, और / या भेदभाव के संदर्भ में विशेष जीनों और रास्ते के प्रत्यक्ष अध्ययन के लिए अनुमति देता है.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम वीडियो सहायता के लिए मार्क Wozniak स्वीकार करना होगा. हम भी UT दक्षिण में संवर्धन चूहा नेकां कोशिकाओं के लिए मूल प्रोटोकॉल के लिए शॉन मॉरिसन स्वीकार करना होगा. इस काम के Vanderbilt विश्वविद्यालय के मेडिकल सेंटर शैक्षिक कार्यक्रम समर्थन समर्थित किया गया था और (. HD36720 और HD036720-11S109) NIH और अहा पाल 11GRNT7690040, गुटनिरपेक्ष आंदोलन के लिए अहा (0615209B) के और एनआईएच (NS065604) के से predoctoral फैलोशिप, और ईआरपी से अनुदान द्वारा किया गया था एक NIH प्रशिक्षण अनुदान T32HD007502 द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (low glucose) | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912-10G | |
| dPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots |
| Fibronectin | GIBCO, by Life Technologies | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | D-5637 | |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche Group | 269 638 | Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots. |
| Insulin needles (29 ½ gage) | BD Biosciences | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. |
References
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