Summary
신경 튜브의 배아 신경 능선의 분리가의 사용을 용이하게
Abstract
배아 신경 능선 (NC)는 신경 튜브 등의 측면에서 유래 multipotent 전구 인구 mesenchymal 전이 (EMT)로 상피를 겪습 다양한 세포 유형에 1-3로 상승을주는, 태아에 걸쳐 마이 그 레이션합니다. NC는 또한 표적 장기 4-6의 분화와 성숙에 영향을주는 독특한 능력이있다. 체외에서 explanted 때, 노스캐롤라이나의 progenitors 자기 갱신을 받다, 마이 그 레이션과 뉴런, glia, 평활근 세포, 연골 및 뼈 포함하여 조직 유형의 다양한으로 차별화.
NC의 multipotency 처음. 조류 신경 튜브 7-9의 explants에서 설명한 NC 세포의 체외 절연에서 증식, 이주 및 multipotency 포함하여 노스캐롤라이나 역학 연구를 용이하게되었다. 조류 및 쥐의 시스템의 추가 작업은 배아 10에 다시 이식하면 explanted 노스캐롤라이나 세포들이 노스캐롤라이나 잠재력을 유지 것을 증명-13. 이러한 고유 셀룰러 속성 explanted NC의 progenitors에 보존되기 때문에 신경 튜브 explant 분석은 체외에서 노스캐롤라이나를 공부를위한 매력적인 옵션을 제공합니다.
포유류의 노스캐롤라이나의 더 나은 이해를 달성하기 위해 여러 방법은 NC의 인구를 분리하기 위해 고용되었다. NC-파생 progenitors이 포스트 철새 NC의 progenitors 11,14-20의 역학을 연구하는 배아와 성인 모두에서 사후 철새 위치에서 배양해 수있다 그러나 그들은 신경 튜브에서 이민으로 노스캐롤라이나의 progenitors의 고립은 최적의 보존을 제공 NC 잠재력 전지 및 철새 속성 13,21,22. 일부 프로토콜은 특정 progenitors 11,13,14,17위한 풍부한 NC 인구를 분리하는 형광 활성화된 셀 정렬 (FACS) 채용. 그러나, 초기 단계의 배아로 시작하는 경우, 분석을위한 적절한 셀 번호는 초기 노스캐롤라 populatio의 절연 복잡 FACS로 취득하기가 어렵습니다각각의 배아에서 NS. 여기서는 Wnt1-Cre 활성화 혈통 기자 23 일 기준으로 약 96% 순수 노스캐롤라이나 인구에 FACS 및 결과에 의존하지 않는 방식을 설명합니다.
여기에 제시된 방법은 쥐의 노스캐롤라 11,13의 문화에 최적화된 프로토콜에서 적응하고 있습니다. 이 프로토콜 이전 방법에 비해의 장점은 1) 세포는 FACS)가) 비교적 순수한 노스캐롤라이나 인구, 3을 얻기 위해 필요하지 않습니다 premigratory 노스캐롤라이나 세포가 격리되고 4) 피더 레이어 2에서 재배되지 않는 결과를 쉽게임을 있습니다 계량. 또한이 프로토콜은 서로 다른 유전자 조작과 노스캐롤라이나 특성의 학습을 촉진, 모든 돌연변이 마우스 모델에서 NC의 분리에 사용될 수 있습니다. 이 방법의 한계는 노스캐롤라이 노스캐롤라이나 2,24-28의 생존, 이주 및 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 배아의 맥락에서 제거되는 것입니다.
Protocol
1. 준비 플레이트
- 항상 무균 기술을 사용합니다.
- Dulbecco의 PBS (dPBS)에서 3.3 ML의 최종 볼륨으로 인간의 플라즈마 FN 주식의 100 μL를 diluting하여 fibronectin (FN)를 준비합니다. 최종 농도가 30 μg / ML이며이는 1 주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
- FN 솔루션 무균 조직 배양 네 잘 접시의 각 우물의 바닥을 커버하고 15 분 동안 앉아 보자. 전체 표면이 덮여 있는지 확인하십시오. 이 시간 (2 단계와 3 단계) 동안 미디어를 확인합니다.
- 솔루션을 FN과 접시가 건조하도록 제거합니다. 부드럽게 500 μL DMEM, 제거 DMEM으로 우물 린스, 그리고 자기 갱신 500 μL (SR) 매체 (아래 참조)에 추가합니다. CO 2 5 %를 포함한 humidified 배양기에서 37 ° C에서 품어. 접시는 사용하기 전에 건조되도록 해부하기 전에이 약 한 시간을 완료합니다.
2. SR 매체를 준비
- vagal 및 트렁크 노스캐롤라이나의 문화에 대한열 배아 (약 쓰레기, 마우스 라인의 유전적 배경에 따라)에서, SR 매체의 25 ML을 준비합니다. 12.5 ML 낮은 포도당 DMEM, 7.5 ML Neurobasal 중간, 25 μL retinoic 산성 (117 μm의 최종 농도), 25 μL 2 - 메르 캅 토 에탄올 (50 MM 최종 농도)를 결합. 잘 섞는다.
- 3.75 ML 여자는 배아 엑기스, 250 μL N이 소금 보충, 500 μL B27 보충제 250 μL 페니실린 - 스트렙토 마이신 (1 % 최종 농도)를 추가합니다. 0.22 μm의 필터를 통해 매체를 필터링합니다.
- 10 μL 멸균 IGF1 (20 μg / ML 최종 농도)와 20 μL 멸균 bFGF (20 μg / ML 최종 농도)를 추가합니다. 반전으로 섞는다. 4 ° C.에 저장
3. 워시 매체를 준비
- 의 경우 약 10 배아는 세척 매체의 50 ML을 준비합니다. 35 ML 낮은 포도당 DMEM, 15 ML Neurobasal 매체, 500 μL 페니실린 - 스트렙토 마이신 (1 % 최종 농도)와 50 밀리그램 BSA이 결합되어 있습니다. 0.22과 무균 필터μm의 필터.
4. Collagenase / dispase 준비
- 100 MG / ML collagenase / dispase 5 ML의 dPBS 50 μL를 추가합니다. 잘 섞는다.
- 0.2 μm의과 주사기 필터는 12 잘 접시 세 우물 각각에 1.5 ML을 필터링하고 추가합니다. 나머지 우물에 피펫 약 1 ML 세척 매체. 해부 조직을 소화 준비 때까지 얼음 전체 접시를 보관합니다.
- 멸균 면도날과 p20 및 P1000 피펫 팁 필터의 조언을 자르고. 끝에만의 beveled 가장자리 아래 잘라. P1000 오프 절단은 p20이 고립된 조직의 조각을 전송하는 데 사용됩니다 동안 전체 배아를 전송하는 데 사용됩니다.
5. 9.5 dpc의 태아에서 Vagal 및 간선 신경 튜브를 분리
- 시간이 초과 임신의 경우 질 플러그 댐은 아침 플러그가 관찰되고 정오에 0.5 dpc로 간주됩니다. 9.5 dpc에서 자궁을 희생하고 제거합니다.
- 자궁에서 decidua를 제거하고 부드럽게 Rdecidua에서 배아를 emove. 일단이 프로토콜과 경험, 멸균 dPBS에서 한 번에 3-4 9.5 dpc의 배아를 분리. 멸균 기술과 소독을 해부 장비를 사용하십시오. 악기 autoclaving, 열 살균 또는 에탄올에 부화하여 소독 수 있습니다.
- 앞부분은 vagal 노스캐롤라이나의 경우 : 인슐린 바늘을 사용 중반 귀의 placode에 신경 튜브를 잘라. 4 번째 체절의 후부 가장자리에 다시 잘라. pharyngeal 아치와 가슴을 제거하는 신경 튜브로 복부 조직을 손질.
- 트렁크 NC의 경우 : 인슐린 바늘을 사용하여 somites 16-22 (또는 배아 이전 22 체절 무대보다 발달면 마지막 체절) 사이 신경 튜브의 부분을 제거합니다.
- 난황 및 genotyping에 대한 남은 배아 조직을 유지.
6. 비 신경 Ectoderm 및 Mesoderm 제거
- 십분 동안 상온에서 collagenase / dispase로 세그먼트를 포함하는 신경 튜브를 배치의. 즉시 세탁 매체에 씻는다.
- 멸균 dPBS로 조직을 반환합니다. 멸균 인슐린 바늘을 사용하여 부드럽게 조직에서 비 신경 ectoderm를 제거하고 멀리 신경 튜브에서 somites을 분리. 체절 조직에서 mesoderm의 마지막 남은 부분 잘라내기 다운 p20 팁을 사용하여 부드럽게 triturating하여 제거할 수 있습니다. 신경 튜브를 손상하지 않도록주의하십시오. 가루약 중에 밀접하게 이것을 관찰.
- 세차 매체의 두 번째 및 세 번째 삼십초 세차를 통해 고립된 신경 튜브를 놓습니다.
- SR 매체에 한 번 씻어, 그리고 (단계 1.3) 이전에 준비되었다 FN-코팅도의 중심에 격리된 신경 튜브를 넣습니다. 멸균 물을 접시와 hypoxia 실 ...을 축이다. hypoxia 챔버로 접시를 놓고 3 % O 2 (1 % 혼합 O 2, 6퍼센트 CO 2, 93% N 2를 포함하는 탱크를 사용)로 혼합 가스와 함께 챔버를 플러시.
- 항상 THA을 보장하기 위해 매우 신중 챔버 처리하지마 explants은 그대로이며, 우물의 중심에 남아 있습니다.
- 37 품어 ° C. 단계 5-6 개요는 그림 1에 표시됩니다.
7. 신경 튜브의 제거
- 부화 후 24 시간 후, 부드럽게 떨어져 불임이 인슐린 바늘을 사용하여 마이 그 세포로부터 신경 튜브의 가장자리를 괴롭히고하여 신경 튜브를 제거합니다. 제거하고 단계 6.2에서와 같이 멸균 p20 인하를 사용하여 매체에서 신경 튜브를 버리고 신선한 SR 매체 (그림 2)와 매체를 교체하십시오. 이것은 가장 쉽게 거꾸로 현미경을 사용하여 수행됩니다.
8. 대표 결과
hypoxic 조건에서 ° C, NC 세포는 거의 순수한 인구 (그림 3A)에서 신경 튜브에서 떨어져 마이그레이션한 37에서 부화 후 24 시간에 따라. 때로는 이상적인 문화보다 강력한 outgrowths를 얻을 수 없습니다. 예를 들어, 그 24 시간 이내에 t 가능그는 신경 튜브 자체적으로 웅크리고있다되며 엔씨는 신경 튜브 (그림 3B)에서 떨어져 마이 그 레이션되지 않습니다. 간혹 신경 튜브 fibronectin 코팅 접시에 부착하지 않습니다.
우리의 경험에서는, 하위 최적의 NC 마이 그 레이션 또는 신경 튜브의 부착에 문제가 악영향 각각 normoxia 조건이나 fibronectin의 농도에 의해 영향을받을 수 있습니다. collagenase / dispase의 효소 활동이 배치 및 소화 시간에 따라 약간의 차이가 적절하게 조정해야하지만 15 분 이상 조직을 소화하지 않습니다. collagenase / dispase의 조직을 포함하는 신경 튜브 Overdigestion 또한 결함 outgrowths집니다. 체절 조직이 쉽게 collagenase / dispase에서 부화 후 신경 튜브에서 제거되지 않은 경우 신경 튜브는 열명 분 이상 동안 incubated 수 있습니다. 때로는 신경 튜브 기판에 연결되지 않습니다. 이 경우 fibronec을 두 번 확인주석 농도와 hypoxia 조건.
normoxic 조건은 문화, 야생 형 노스캐롤라이나에 사용할 수 있지만, hypoxic 조건보다 밀접하게 생체내 환경 29,30 년을 모방. 우리의 경험에서, hypoxic 조건이 때 culturing 돌연변 노스캐롤라이나 중요했다. 예를 들어, Foxd3 돌연변 노스캐롤라이 normoxic 조건에서 배양해 때, 트렁크 노스캐롤라이 컨트롤에 비해 크게 감소 셀 파생물했다. explants은 hypoxic 조건 (그림 4)에서 배양해 때 가지 크기의이 불균형이 제거되었습니다. 또한, 야생 형 신경 튜브 explants가 normoxia에서 배양해 때, caspase-긍정 세포의 숫자 (데이터가 표시되지 않음) hypoxia에서 배양해 유사한 explants의 사실을 늘어납니다. hypoxia에있는 모든 NC 문화를 유지함으로써, 비교가보다 쉽게 컨트롤의 역학과 돌연변이의 문화 사이에 만들 수 있습니다.
그림 2. explant에서 신경 튜브의 Stepwise 제거. 신경 튜브가 아닌 노스캐롤라이나 세포와 오염을 방지하기 위해 후 24 ~ 48 시간 제거해야합니다. ) 신경 튜브와 NC의 파생물 (실선) 사이의 경계를 확인할 수 있습니다. B) 인슐린 바늘로 신경 튜브의 가장자리를 따라 잘라. C) 신경 튜브를 취소하고 새로운 자기 갱신 매체와 매체를 교체하십시오. 점선은 자연적인 진전의 정도를 나타냅니다. 약어 : NT, 신경 튜브.
그림 3. 대표적인 결과의 예. hypoxic 조건에서 자기 갱신 배지에서 24 시간 배양 후) 일반 explant의 파생물은 (점선)은 자연적인 진전의 정도를 나타냅니다. 나) 문화의 48 시간 후 노스캐롤라이나의 파생물의보기를 확대했습니다. 낮은 가지 수율과 C) 덜 이상적인 문화. A와 C는 동일한 조건에서 배양해되었다. 이미지는 문화 견고에서 자연 범위를 보여줍니다. 이것은 collagenase / dispase digestions에 신경 튜브 절연, FN의 농도, hypoxic 조건과 시간의 효율성에 의해 영향을받을 수 있습니다.
그림 4. normoxia 대 hypoxia에서 NC의 explant 문화의 체외 분석합니다. normoxic 문화 조건에서 48 시간 후 신경 튜브 explants에서 마이 그 레이션 컨트롤 (야생 타입) 노스캐롤라이나 세포. 대조적으로, Foxd3 돌연변이노스캐롤라이나 크게 normoxia의 세포 outgrowths을 (NC의 outgrowths의 붉은 외곽선 표시 에지) 감소했다. 비교 explants은 hypoxic 조건 하에서 재배 때, Foxd3 돌연변이 노스캐롤라이나의 explants는 후속 분석을 수 있도록 컨트롤 comparably되었다. 참고이 문제는 생체내의 Foxd3 돌연변이 노스캐롤라이나의 동작과 잘 상호.
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Discussion
주의이 방법의 성공을 보장하기 위해 태아의 발달 단계에 납부하여야한다. 초기 마우스 배아의 somites을 계산하는 것은 쓰레기 내에서 배아와 일치하고 격리를 위해 신경 튜브의 정확한 영역을 결정하는 단계에 대해 모두 중요합니다. 배아 사이에 하나 또는 두 개의 somites의 변형 실시한 실험의 해상도에 따라 개발시기의 합리적인 범위 내에 있습니다. 9 9.5 dpc 사이의 태아 17 및 25 somites 사이가됩니다. 배아가 25 개 이상 somites있다면, 노스캐롤라이나 추가적인 개발 시간에 승진하고, 노스캐롤라이나의 outgrowths는 문화에 덜 견고한 될 것입니다. 배아, 따라서 노스캐롤라이나의 발달 단계는 실험의 결과에 영향을 미칠 수있을 때 체절 수에 따라 배아를 준비하는 것이 실험에서 정밀도를 용이하게합니다. 9.5 dpc의 배아에서 vagal 노스캐롤라이 정의 앞부분 - 후부 한계의 지느러미 신경 튜브에서 마이 그 레이션 : 중반 귀의 placode에서 체절 7.마찬가지로, 트렁크 NC는 24 체절하는 수준 체절 8 시에 신경 튜브에서 마이 그 레이션합니다. 이 프로토콜에 설명된 NC의 progenitors의 독특한 인구를 분리하려면 해당 도메인의 각 내에서 하위 지역 이산은 고립됩니다. 사용되는 신경 튜브의 지역은 실험 설계 및 연구중인 노스캐롤라이나의 앞부분 - 후부 지역에 따라 다를 수 있습니다.
문화 조건 매체 및 배양 조건, 특히 murine 노스캐롤라이나의 문화에 대한 적응을 포함, 위에서 설명한. 비슷한 SR 매체가 먼저 쥐의 노스캐롤라 11 문화를 위해 사용되었다. 우리 손으로 Neurobasal 매체의 또한이 쥐의 매체, murine NC의 progenitors의 강력한 자연적인 진전을 생산하고 있습니다. 또한, 이전 직장 culturing 조류 NC 세포와는 달리, 피더 계층이 방법 11,13,21,22을 사용하여 포유류의 노스캐롤라이나 문화에 대한 필요가 없습니다. normoxic conditi에서 조류와 포유류의 양쪽 NC 문화를 자세히 여러 프로토콜이 있지만 부가 기능 9,22, 우리는 23 일 (그림 4), 필드에 20 다른 사람과 함께 hypoxia 더 밀접 생리적 산소 수준을 모방한 것이었 아마도 때문에 같은 hypoxic 조건에서 culturing murine 노스캐롤라이나 세포, 여기 크게 에이즈 생존과 자기 갱신을 설명하는 것으로 나타났습니다 배아 20,29,30 이내.
분자 마커의 표현의 평가는 크게 노스캐롤라이나 세포와 그들의 차별화된 파생 상품의 식별을 용이하게합니다. 이들은 Foxd3 표현, p75 및 NC의 줄기 세포에 대한 Sox10을 포함합니다. 차별화된 NC의 마커 myofibroblasts위한 평활근 알파 actin (SMA), melanocytes위한 glia, microphthalmia - 관련 전사 인자 (MITF)에 대한 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP) 및 베타-III의 tubulin, 단백질 유전자 산물 9.5 (PGP9.5 포함 뉴런) 및 peripherin. 이러한 마커는 노스캐롤라이나의 progenitors의 explant 효율과 분화를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
컨텐츠 ">이 기술이 마스터되면 교양 노스캐롤라이 확산 부량, 세포 죽음, 이주 역학 및 / 또는 분화 상태를 포함한 assays 다양한에서 사용할 수 있습니다. 노스캐롤라이나도 자기 갱신 또는 multipotency를 조사하기 위해 clonally 교양이 될 수 개별 NC의 progenitors 23. 신경 튜브 후에이 문화권에서 제거되고, 37 시에 정확히 5 분 100 μl 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (0.25 %)에서 노스캐롤라이나 세포를 떼어 놓다 ° C. 초과 세탁 매체에 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 끄다 (8-10 당도 800 μl를 추가하고 세차 미디어를. 포함된 개별 15 ML 튜브로 전송하여 MLS)는 부드럽게 3 분 150 XG에 세포를 원심 분리기 1 ML SR 매체에 뜨는 및 resuspend 세포 펠렛을 제거합니다.에서 hemocytometer와 플레이트를 사용하는 카운트 전지는 25 세포 / ㎝ 2의 밀도.이 식민지가 순차적으로 분석 자기 갱신에 passaged 수 있습니다. 분석 multipotency로, 6 일 동안 SR 매체의 clonal 밀도에서 노스캐롤라이나 세포를 유지하고 차별화로 전환중간 (10 NG / ML bFGF와 1 %의 여자들이 배아 추출물). 11 위와 같이 분자 마커와 식민지 조성을 분석하기 전에 팔일위한 hypoxia 하에서 차별화 매체의 문화가 세포.결론적으로, 마우스 배아에서 NC 세포를 격리를위한이 방법은 FACS를 사용하지 않고 premigratory NC 전지의 피더 무료 자기편 문화를 생산하고 있습니다. 이러한 세포를 이용한 실험 분석은 쉽게 계량 할 수 있습니다. 이 기법은 간단하지만, 마이 그 레이션, 자기 갱신과 차별화의 노스캐롤라이나 특성에 관한 연구 대한 응용 프로그램은 광대한 있습니다. 또한, 유전자 변형 마우스 배아에서 NC를 분리한다는 노스캐롤라이나 마이 그 레이션, 생존 및 / 또는 차별화의 맥락에서 특정 유전자 및 경로의 직접적인 연구를 허용합니다.
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Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
우리는 비디오 지원 마크 워즈 니 악을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 culturing 쥐 NC 세포의 원래 프로토콜 UT 남서에서 숀 모리슨을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 밴더빌트 대학 메디컬 센터 아카데미 프로그램 지원을 지원하고 NIH (HD36720과 HD036720-11S109)와 PAL에 AHA 11GRNT7690040 남구로 AHA (0615209B)와 NIH (NS065604)에서 predoctoral 장학금 및 ERP에서 교부금에 의해 있었다 NIH 연수 보조금 T32HD007502에 의해 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (low glucose) | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912-10G | |
| dPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots |
| Fibronectin | GIBCO, by Life Technologies | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | D-5637 | |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche Group | 269 638 | Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots. |
| Insulin needles (29 ½ gage) | BD Biosciences | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. |
References
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