Summary
Aislamiento de cresta neural embrionario del tubo neural facilita el uso de
Abstract
El embrión de la cresta neural (NC) es una población de progenitores multipotentes que se origina en la cara dorsal del tubo neural, se somete a un epiteliales de transición mesénquima (TEM) y migra a través del embrión, dando lugar a diversos tipos de células de 1-3. CN también tiene la capacidad única para influir en la diferenciación y maduración de los órganos diana 4-6. Cuando explantado in vitro, los progenitores NC someterse a la auto-renovación, migrar y diferenciarse en una variedad de tipos de tejidos incluyendo las neuronas y células gliales, células del músculo liso, cartílago y hueso.
Multipotencia Carolina del Norte fue descrita por primera vez a partir de explantes del tubo neural aviar 7-9. En el aislamiento in vitro de células NC facilita el estudio de la dinámica de Carolina del Norte, incluyendo la proliferación, migración y multipotencia. Seguir trabajando en los sistemas de aves y ratas demostraron que las células explantados NC conservar su potencial de Carolina del Norte cuando se trasplantan de nuevo en el embrión de 10-13. Debido a estas propiedades inherentes celulares se conservan en explantados progenitores NC, el tubo de ensayo explante neuronal proporciona una opción atractiva para el estudio de la NC in vitro.
Para lograr una mejor comprensión de los mamíferos NC, muchos métodos han sido empleados para aislar poblaciones NC. NC-derivados de los progenitores puede ser cultivado a partir de post-migratorias lugares, tanto en el embrión y el adulto para estudiar la dinámica de la post-migratorias progenitores NC 11,14-20, sin embargo el aislamiento de progenitores de Carolina del Norte, ya que emigran del tubo neural proporciona una conservación óptima de NC potencial de la pila y propiedades migratorias 13,21,22. Algunos protocolos emplear fluorescencia de células activadas clasificación (FACS) para aislar una población NC enriquecido para progenitores particulares 11,13,14,17. Sin embargo, cuando se inicia con embriones en fase inicial, el número de células adecuadas para el análisis son difíciles de obtener con FACS, lo que complica el aislamiento de principios populatio NCns a partir de embriones individuales. A continuación, describimos un método que no depende de la FACS y los resultados en una población de aproximadamente el 96% pura Carolina del Norte sobre la base de un reportero Wnt1-Cre activado linaje 23.
El método que aquí se presenta es una adaptación de los protocolos optimizados para el cultivo de ratas NC 11,13. Las ventajas de este protocolo en comparación con los métodos anteriores son que: 1) las células no se cultivan en una capa alimentadora, 2) FACS no se requiere para obtener una población NC relativamente puro, 3) premigratorias células aisladas se NC y 4) resultados son fácilmente cuantificados. Además, este protocolo se puede utilizar para el aislamiento de NC de cualquier modelo de ratón mutante, lo que facilita el estudio de las características de NC con diferentes manipulaciones genéticas. La limitación de este enfoque es que el CN se retira del contexto del embrión, que se sabe que influyen en la supervivencia, la migración y la diferenciación del CN 2,24-28.
Protocol
1. Preparación de las placas
- Utilizar una técnica estéril en todo momento.
- Preparar fibronectina (FN) por dilución de 100 l de plasma humano de stock FN en un volumen final de 3,3 ml en PBS de Dulbecco (DPBS). La concentración final es de 30 mcg / ml y esto se puede almacenar a 4 ° C durante 1 semana.
- Cubrir el fondo de cada pocillo de una cultura estéril del tejido cuatro pocillos con solución de FN y deje reposar durante 15 minutos. Asegúrese de que toda la superficie está cubierta. Hacer medios durante este tiempo (pasos 2 y 3).
- Quitar FN solución y permita que las placas que se seque. Enjuague suavemente los pocillos con 500 L DMEM, DMEM quitar y añadir 500 l de auto-renovación (SR) medio (ver más abajo). Se incuba a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5 por ciento de CO 2. Complete esta hora aproximadamente un antes de la disección de modo que las placas se seca antes de su uso.
2. Preparación de Medio SR
- Para la cultura de vago y tronco Carolina del Nortede diez embriones (aproximadamente una camada, en función de los antecedentes genéticos de la línea de ratón), preparar 25 ml de medio de SR. Combinar 12,5 ml de DMEM bajo de glucosa, 7,5 ml de medio Neurobasal, 25 l de ácido retinoico (117 mM concentración final), y 25 l de 2-mercaptoetanol (50 mM concentración final). Mezclar bien.
- Añadir 3,75 ml de extracto de embrión del polluelo, 250 l de N 2 suplemento de sal, 500 l suplemento de B27 y 250 l de penicilina-estreptomicina (1% concentración final). Filtrar el medio a través de un filtro de 0,22 micras.
- Añadir 10 l estéril IGF1 (20 ug / ml de concentración final) y 20 l bFGF estéril (20 mg / ml de concentración final). Mezclar por inversión. Almacenar a 4 ° C.
3. Preparación de medio de lavado
- Durante aproximadamente 10 embriones preparar 50 ml de medio de lavado. Combinar 50 mg de BSA con 35 ml de glucosa bajo DMEM, 15 ml de medio Neurobasal, y 500 l de penicilina-estreptomicina (1% de concentración final). Filtro estéril con un 0,22filtro micras.
4. Preparación de colagenasa / dispasa
- Añadir 50 l de 100 mg / ml de colagenasa / dispasa a 5 DPBS mL. Mezclar bien.
- Jeringa filtro con un 0,2 micras filtrar y añadir 1,5 ml en cada uno de los tres pocillos de una placa de doce también. Pipeta aproximadamente 1 ml de medio de lavado en los pocillos restantes. Guarde toda la placa de hielo hasta que esté listo para digerir los tejidos disecados.
- Cortar la punta de una punta de pipeta P20 y P1000 filtro con una hoja de afeitar estéril. Cortar justo debajo del borde biselado de la punta. El corte p1000 se utiliza para transferir todo el embrión mientras que el p20 se utiliza para transferir piezas de tejido aislado.
5. Aislar vagal y el tubo neural del tronco de 9,5 embriones DPC
- Para los embarazos programados, las presas con un tapón vaginal se consideran 0,5 dpc al mediodía por la mañana el tapón que se observa. El sacrificio y extirpar el útero en el 9,5 dpc.
- Retire la decidua del útero y suavemente reMove el embrión de la decidua. Una vez experimentado con este protocolo, aislar 3-4 9,5 embriones DPC en un momento en DPBS estériles. Utilice una técnica estéril y esterilizados los instrumentos de disección. Los instrumentos pueden ser esterilizados mediante esterilización por calor autoclave, o por incubación en etanol.
- Para vagal anterior, Carolina del Norte: el uso de agujas de insulina, cortar el tubo neural en la placoda ótica medio. Corta de nuevo en el borde posterior de la somite 4 º. Recorte el tejido ventral a la del tubo neural para quitar los arcos faríngeos y el corazón.
- Para NC tronco: el uso de agujas de insulina, retire la parte del tubo neural entre 16-22 somitas (o la última somite si los embriones son de desarrollo anterior a la somite etapa 22).
- Mantenga el saco vitelino y cualquier resto de tejido embrionario para la genotipificación.
6. La eliminación de los nervios no ectodermo y mesodermo
- Coloque el tubo neural que contiene segmentos en colagenasa / dispasa a temperatura ambiente durante 10 minutoss. Lavar inmediatamente en el medio de lavado.
- Volver a tejido DPBS estériles. El uso de agujas estériles de insulina, retire suavemente el ectodermo no neural de los tejidos y separar los somitas lejos del tubo neural. Las últimas partes restantes del mesodermo a partir de tejido somito se puede quitar por trituración suavemente usando un corte hacia abajo p20 punta. Tenga cuidado de no dañar el tubo neural. Observe esto muy de cerca durante la trituración.
- Se coloca el tubo neural aislado a través de una segunda y tercera de lavado 30 segundos de medio de lavado.
- Lavar una vez en un medio de SR, y colocar el tubo neural aislado en el centro de un pozo FN-revestido que se preparó previamente (Paso 1,3). Humedezca el ambiente de la cámara de hipoxia con un plato de agua estéril. Poner la cápsula en la cámara de hipoxia y vaciar la cámara con gas mixto a 3% de O 2 (usar un tanque que contiene una mezcla de 1% de O 2, 6% de CO 2, 93% de N 2).
- Siempre maneje la cámara con sumo cuidado para asegurarse de Thaexplantes son t tranquila y permanecen en el centro de los pocillos.
- Se incuba a 37 ° C. Resumen de los pasos 5-6 se muestra en la Figura 1.
7. La eliminación del tubo neural
- Después de 24 horas de incubación, retirar el tubo neural suavemente burlas el borde del tubo neural lejos de las células que migran utilizando una aguja de insulina estéril. Retirar y desechar el tubo neural del medio utilizando un corte de p20 estéril como en el paso 6,2 y reemplazar el medio con medio fresco SR (Figura 2). Esto es más fácil hacerlo mediante un microscopio invertido.
8. Los resultados representativos
Tras 24 horas de incubación a 37 ° C en condiciones hipóxicas, las células NC han migrado lejos del tubo neural en una población casi puro (Figura 3a). A veces, menos que los cultivos ideales no va a ceder crecimientos robustos. Por ejemplo, es posible que después de 24 horas tque el tubo neural se han enroscado sobre sí mismo y el CN no se migran fuera del tubo neural (Figura 3b). De vez en cuando el tubo neural no se adhieren a las placas recubiertas de fibronectina.
En nuestra experiencia, sub-óptimo de migración Carolina del Norte o problemas con la conexión del tubo neural pueden ser afectados adversamente por las condiciones de normoxia o de concentración de la fibronectina, respectivamente. La actividad enzimática de la colagenasa / dispasa varía ligeramente por lote y el tiempo de digestión se debe ajustar apropiadamente, sin embargo, no digieren el tejido más de quince minutos. Overdigestion del tubo neural que contiene tejido en colagenasa / dispasa también dará lugar a crecimientos deficientes. Si el tejido somite no se elimina fácilmente del tubo neural después de la incubación en la colagenasa / dispasa, el tubo neural puede ser incubado durante más de diez minutos. A veces el tubo neural no se adherirá al sustrato. Si este es el caso, compruebe la fibronecestaño concentración y las condiciones de hipoxia.
Aunque las condiciones normoxic se puede utilizar para cultivo de tipo salvaje NC, las condiciones hipóxicas más estrechamente imitar el entorno in vivo 29,30. En nuestra experiencia, las condiciones de hipoxia se tornó crítica cuando se cultiva mutante Carolina del Norte. Por ejemplo, cuando Foxd3 mutante NC se cultivaron en condiciones normoxic, NC tronco tenía una excrecencia celular reduce considerablemente en comparación con los controles. Esta disparidad en tamaño consecuencia se eliminó cuando los explantes se cultivaron en condiciones hipóxicas (Figura 4). Además, cuando los explantes de tipo salvaje del tubo neural se cultivaron en normoxia, el número de células positivas caspasa fue mayor que a continuación de explantes similares cultivadas en hipoxia (datos no presentados). Al mantener toda la cultura Carolina del Norte en la hipoxia, las comparaciones pueden ser más fácilmente entre la dinámica de control y culturas mutantes.
Figura 2. La eliminación gradual del tubo neural del explante. El tubo neural deben ser removidos después de 24-48 horas para evitar la contaminación con los no-NC células. A) una notificación de la frontera entre el tubo neural y la consecuencia Carolina del Norte (línea continua). B) Cortar a lo largo del borde del tubo neural con una aguja de insulina. C) Se desecha el tubo neural y reemplazar con un nuevo medio a medio auto-renovación. La línea de puntos indica el alcance de la consecuencia. Abreviatura: NT, del tubo neural.
Figura 3. Ejemplos de resultados representativos. A) fruto típico explante después de 24 horas de incubación en un medio de auto-renovación en condiciones de hipoxia (línea punteada indica el alcance de la consecuencia). B) Vista ampliada de la consecuencia Carolina del Norte después de 48 horas en la cultura. C) Menos de la cultura ideal, con rendimiento de fruto baja. A y C se cultivaron en las mismas condiciones. Imágenes demuestran la solidez en el área de distribución natural la cultura. Esto puede verse afectada por la eficiencia de aislamiento del tubo neural, la concentración de FN, las condiciones hipóxicas, y el tiempo en digestiones colagenasa / dispasa.
Figura 4. En los análisis in vitro de cultivos de explantes NC en normoxia frente a la hipoxia. De control (tipo salvaje) NC células migraron a partir de explantes de tubo neural después de 48 horas en condiciones de cultivo normoxic. En contraste, Foxd3 mutanteCarolina del Norte se había reducido en gran medida crecimientos celulares en normoxia (de color rojo marca los contornos de los bordes de las derivaciones NC). Cuando los explantes comparables fueron cultivadas bajo condiciones de hipoxia, Foxd3 mutantes explantes de Carolina del Norte creció de forma comparable a los controles, lo que permite su posterior análisis. Tenga en cuenta que este comportamiento una buena correlación con el comportamiento de Foxd3 mutante Carolina del Norte en vivo.
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Discussion
Debe prestarse cuidadosa atención a la etapa de desarrollo del embrión para asegurar el éxito de este enfoque. Contando somitos de embriones tempranos de ratón es fundamental tanto para la etapa correspondiente embriones dentro de una camada y la determinación de las regiones correctas del tubo neural para el aislamiento. Una variación de uno o dos somitas entre embriones está dentro de una gama razonable de tiempo de desarrollo, dependiendo de la resolución del experimento llevado a cabo. Un embrión entre el 9 y el 9,5 dpc tendrá entre 17 y 25 somitas. Si el embrión tiene más de 25 somitas, el Carolina del Norte está más avanzado en el tiempo de desarrollo y crecimientos NC va a ser menos robusto en la cultura. La estadificación basada en el número de embriones somite facilita la precisión en experimentos cuando la etapa de desarrollo del embrión, y por lo tanto, Carolina del Norte, puede influir en el resultado de los experimentos. En un embrión de 9,5 dpc, el CN vagal migra desde el tubo neural en los dorsales definidos anterior-posterior límites: desde la placoda ótica a mediados de somite 7.Del mismo modo, el tronco Carolina del Norte migra desde el tubo neural en los niveles somite 8 a 24 somite. Para aislar distintas poblaciones de progenitores NC como se describe en este protocolo, discreto sub-regiones dentro de cada uno de esos dominios están aislados. La región del tubo neural usado variará basado en el diseño del experimento y la región antero-posterior del CN se está estudiando.
Las condiciones de cultivo se ha descrito anteriormente, incluyendo el medio y las condiciones de incubación, están especialmente adaptados para el cultivo de Carolina del Norte murino. Similar medio de SR fue utilizado por primera vez para el cultivo de ratas NC 11. En nuestras manos, este medio de rata, con la adición de medio Neurobasal, produce un resultado robusto de murinos progenitores NC. Además, a diferencia de anteriores trabajos el cultivo de células aviares NC, una capa de alimentación no es necesaria para el cultivo de la NC de mamíferos utilizando este método 11,13,21,22. Si bien existen numerosos protocolos que detallan la cultura Carolina del Norte, tanto de aves y mamíferos en normoxic conditi Complementos 9,22, que 23 (Figura 4), junto con otros en el campo 20, han encontrado que el cultivo de células murinas NC en condiciones de hipoxia como se describe aquí la supervivencia en gran medida las ayudas y auto-renovación, presumiblemente debido a la hipoxia mímico más de cerca los niveles fisiológicos de oxígeno dentro del embrión 20,29,30.
Evaluación de la expresión de marcadores moleculares facilita enormemente la identificación de células NC y sus derivados diferenciados. Estos incluyen la expresión de Foxd3, p75, y Sox10 para las células madre NC. Los marcadores de Carolina del Norte incluyen diferenciada de músculo liso alfa actina (SMA) para miofibroblastos, proteína ácida glial fibrilar (GFAP) para la glía, microftalmía asociada a factores de transcripción (MITF) de los melanocitos, y beta tubulina-III, proteína producto del gen 9,5 (PGP9.5 ), y periferina para las neuronas. Estos marcadores pueden ser utilizados para determinar la eficiencia de explante y la diferenciación de los progenitores NC.
contenido "> Una vez que esta técnica se domina, cultivadas NC puede ser utilizado en una variedad de ensayos, incluyendo la cuantificación de la proliferación, la muerte celular, la dinámica de la migración, y el estado / o diferenciación. NC también puede ser clonalmente cultivadas para investigar la auto-renovación o multipotencia de individuales progenitores NC 23. Después de que el tubo neural se retira de las culturas, se disocian las células NC en 100 l de tripsina-EDTA (0,25%) durante exactamente 5 minutos a 37 ° C. Quench tripsina-EDTA en exceso de medio de lavado (8-10 mL) mediante la adición de 800 l por pocillo y transferir a los distintos tubos de 15 ml que contienen medio de lavado. suavemente centrifugar las células a 150 xg durante 3 minutos, eliminar células sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de medio SR. células contar usando un hemocitómetro y la placa de ellos a una densidad de 25 células / cm 2. Estas colonias pueden ser de serie pasaron a la prueba de auto-renovación. Para multipotencia ensayo, mantener las células en la densidad de NC clonal en un medio de SR durante 6 días y luego cambiar a la diferenciaciónmedio (10 ng / ml bFGF y 1% de extracto de embrión de pollo). Cultivar las células en medio de diferenciación bajo hipoxia durante 8 días antes de analizar la composición colonia con marcadores moleculares como por encima de 11.En conclusión, este método para aislar células NC a partir de embriones de ratón produce un alimentador de cultivo libre de células adherentes de premigratorias NC sin el uso de FACS. Análisis de experimentos utilizando estas células pueden ser fácilmente cuantificados. Si bien esta técnica es sencilla, sus aplicaciones para el estudio de las características del NC de la migración, la auto-renovación y diferenciación son muy amplias. Por otra parte, el aislamiento Carolina del Norte a partir de embriones de ratón modificados genéticamente permite el estudio directo de determinados genes y las vías en el contexto de la migración Carolina del Norte, la supervivencia y / o diferenciación.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Marc Wozniak para la asistencia de vídeo. También queremos agradecer a Sean Morrison de UT Southwestern para el protocolo original para el cultivo de células de rata NC. Este trabajo fue apoyado Vanderbilt University Medical Centro de Soporte del Programa Académico y fue por las subvenciones del NIH (HD36720 y HD036720 11S109-) y la AHA 11GRNT7690040 a PAL, las becas predoctorales de la AHA (0615209B) y el NIH (NS065604) a Nam, y el ERP con el apoyo de una formación T32HD007502 NIH subvención.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (low glucose) | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912-10G | |
| dPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots |
| Fibronectin | GIBCO, by Life Technologies | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | D-5637 | |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche Group | 269 638 | Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots. |
| Insulin needles (29 ½ gage) | BD Biosciences | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. |
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