Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube

doi: 10.3791/4134 Published: June 2, 2012

Summary

Isolering af embryoniske crista neuralis fra neuralrøret letter anvendelsen af

Abstract

Den embryoniske crista neuralis (NC) er en multipotent progenitorcelle population, der stammer fra den dorsale aspekt af neuralrøret, undergår en epitelcelle til mesenchymal overgang (EMT) og migrerer gennem embryo, hvilket giver anledning til forskellige celletyper 1-3. NC har også den unikke evne til at påvirke differentiering og modning af målorganer 4-6. Når eksplanteret in vitro, NC progenitorer undergår selvfornyelse, migrerer og differentierer til en række forskellige vævstyper, herunder neuroner og glia, glatte muskelceller, brusk og knogler.

NC multipotency blev først beskrevet af eksplantater af aviær neuralrøret 7-9. In vitro isolering af NC-celler letter undersøgelsen af NC dynamik, herunder proliferation, migration og multipotency. Det videre arbejde i de fugle og rotter systemer viste, at eksplanterede NC-celler bevarer deres NC potentiale, når transplanteres tilbage til fosteret 10-13. Fordi disse iboende cellulære egenskaber er bevaret i eksplanterede NC stamfædre, neuralrøret explantet analysen forsyner en attraktiv mulighed for at studere NC in vitro.

At opnå en bedre forståelse af den mammale NC, er mange metoder blevet anvendt til at isolere NC populationer. NC-afledte progenitorceller kan dyrkes fra post-migrerende steder i både embryo og voksne at studere dynamikken af post-migrerende NC progenitorer 11,14-20 imidlertid isolering af NC progenitorer, da de emigrere fra neuralrøret tilvejebringer optimal konservering af NC celle potentiale og migrerende egenskaber 13,21,22. Nogle protokoller anvender fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at isolere en NC population er beriget for bestemte progenitorer 11,13,14,17. Imidlertid, når der startes med tidlige embryoer, celleantal passende for analyser er vanskeligt at opnå med FACS, komplicerer isolering af tidlige NC populations fra individuelle embryoer. Her beskriver vi en tilgang, som ikke er afhængig af FACS og resultater i en ca 96% ren NC befolkning baseret på en Wnt1-Cre aktiveret slægt reporter 23.

Fremgangsmåden fremlagt her, er tilpasset fra protokoller optimeret til dyrkning af rotte-NC 11,13. Fordelene ved denne protokol i forhold til tidligere metoder er, at 1) at cellerne ikke dyrkes på et fødelag, 2) FACS ikke nødvendig for at opnå en relativt ren population NC, 3) premigratory NC celler isoleres og 4) resultaterne er let kvantificeret. Endvidere kan denne protokol kan anvendes til isolering af NC fra enhver mutant musemodel, letter undersøgelsen af ​​NC egenskaber med forskellige genetiske manipulationer. Begrænsning ved denne fremgangsmåde er, at NC fjernes fra rammerne af embryo, som vides at påvirke overlevelse, migration og differentiering af NC 2,24-28.

Protocol

1. Forbereder Plader

  1. Anvendelse af steril teknik til enhver tid.
  2. Forberede fibronectin (FN) ved at fortynde 100 pi humant plasma FN lager til et slutvolumen på 3,3 ml i Dulbeccos PBS (DPBS). Endelige koncentration 30 ug / ml, og dette kan opbevares ved 4 ° C i 1 uge.
  3. Omfatter bunden af ​​hver brønd i en steril vævskulturplade fire brønde med FN-opløsning og lad henstå i 15 minutter. Sørg for, at hele overfladen er dækket. Gør mediet i denne periode (trin 2 og 3).
  4. Fjerne Fn opløsningen og tillade plader tørre. Forsigtigt skylles brønde med 500 uL DMEM, fjern DMEM, og tilsæt 500 pi selvfornyelse (SR) medium (se nedenfor). Inkuber ved 37 ° C i en befugtet inkubator indeholdende 5 procent CO2. Fuldføre denne cirka en time før dissektion, således at pladerne vil være tør før brug.

2. Forberedelse SR Medium

  1. For kultur vagal og bagagerum NCfra ti embryoer (ca. et kuld, afhængigt genetiske baggrund af muse linie), fremstilles 25 ml SR medium. Kombinere 12,5 ml lav glucose DMEM, 7,5 ml Neurobasal medium, 25 uL retinsyre (117 uM slutkoncentration), og 25 uL 2-mercaptoethanol (50 mM slutkoncentration). Bland godt.
  2. Tilsæt 3,75 mL Chick Embryo Extract, 250 uL N 2 salt supplement, 500 uL B27 supplement og 250 uL penicillin-streptomycin (1% slutkoncentration). Filtreres mediet gennem et 0,22 um filter.
  3. Tilsættes 10 uL steril IGF1 (20 ug / ml slutkoncentration) og 20 ul sterilt bFGF (20 ug / ml slutkoncentration). Bland ved at vende. Opbevares ved 4 ° C.

3. Forberedelse Wash Medium

  1. I omkring 10 embryoer fremstille 50 ml vaskemedium. Kombinere 50 mg BSA i 35 ml lav glucose DMEM, 15 ml Neurobasal medium, og 500 uL penicillin-streptomycin (1% slutkoncentration). Sterilt filter med en 0,22um filter.

4. Forberedelse collagenase / dispase

  1. Tilsættes 50 pi 100 mg / ml collagenase / dispase til 5 ml DPBS. Bland godt.
  2. Sprøjtefilter med et 0,2 um filter, og der tilsættes 1,5 ml i hver af tre brønde i en tolv brønde. Pipetten cirka 1 ml vaskemedium i de resterende brønde. Opbevar hel plade på is, indtil klar til at fordøje dissekeret væv.
  3. Skær spidser af en p20-og P1000 pipette filtermundstykket med en steril barberblad. Skåret lige under den skrå kant på spidsen. Cut off P1000 vil blive anvendt til at overføre hele embryo medens p20 vil blive anvendt til at overføre stykker af isolerede væv.

5. Isolering vagus og Trunk neuralrøret fra 9,5 dpc Embryoner

  1. For tidsindstillede graviditeter, er dæmninger med en vaginal prop betragtes 0,5 dpc ved middagstid om morgenen stikket overholdes. Sacrifice og fjerne livmoderen på 9,5 DPC.
  2. Fjern decidua fra livmoderen og forsigtigt rjern embryonet fra decidua. Når erfaring med denne protokol, isolere 3-4 9,5 dpc embryoner på et tidspunkt i sterile DPBS. Anvende steril teknik og steriliseret dissektion instrumenter. Instrumenter kan steriliseres ved autoklavering, varmesterilisering eller ved inkubering i ethanol.
  3. For anterior vagus NC: ved hjælp af insulin nåle, klippe neuralrøret på midten otisk placode. Skåret igen ved den bageste kant 4. somit. Trim væv ventral til neuralrøret at fjerne svælg buer og hjerte.
  4. For trunk NC: ved hjælp af insulin nåle, fjerne den del af neuralrøret mellem somitter 16-22 (eller den sidste somit hvis embryoner er udviklingshæmmede tidligere end 22 somit scenen).
  5. Holde blommesækken og eventuelt tilbageværende embryonisk væv til genotypebestemmelse.

6. Fjernelse af ikke-neurale ektoderm og mesoderm

  1. Anbring neurale rør indeholdende segmenter i collagenase / dispase ved stuetemperatur i 10 minuttersek. Straks vaskes i vaskemedium.
  2. Tilbage væv til sterile DPBS. Ved hjælp af sterile insulin nåle forsigtigt at fjerne ikke-neurale ectoderm fra vævet og adskille somitter væk fra neuralrøret. De sidste dele af mesoderm fra somit væv kan fjernes ved triturering forsigtigt under anvendelse af en cut-down P20 spids. Vær omhyggelig med ikke at beskadige neuralrøret. Overhold denne nøje under triturering.
  3. Anbring det isolerede neurale rør gennem en anden og tredje 30 sekunder vask af vaskemedium.
  4. Vaskes én gang i SR medium og anbringe det isolerede neurale rør ind i midten af ​​et Fn-coatet brønd, der blev fremstillet tidligere (trin 1.3). Befugte hypoxi kammer med en skål sterilt vand. Placere fadet ind i hypoxia kammer og skylles kammeret med blandede gas til 3% O2 (anvende en tank indeholdende en blanding af 1% O2, 6% CO2, 93% N2).
  5. Altid håndtere kammeret meget omhyggeligt for at sikre that eksplantater er uforstyrret, og forbliver i midten af ​​brøndene.
  6. Inkuber ved 37 ° C. Resumé af trin 5-6 er vist i fig 1.

7. Fjernelse af neuralrøret

  1. Efter 24 timers inkubation fjernes neuralrøret ved forsigtigt drille kanten af ​​neuralrøret fra de migrerende celler under anvendelse af en steril insulin nål. Fjern og kassér neuralrøret fra mediet ved hjælp af en steril p20 snit som i trin 6,2 og erstatte mediet med frisk SR medium (figur 2). Dette gøres nemmest ved hjælp af et inverteret mikroskop.

8. Repræsentative resultater

Efter 24 timers inkubation ved 37 ° C i hypoxiske betingelser, der NC celler migreret væk fra neuralrøret i en næsten ren population (figur 3a). Nogle gange, vil mindre end ideelle kulturer ikke giver robuste udvækster. For eksempel er det muligt, at efter 24 timer tHan neuralrøret vil have oprullet på sig selv og NC ikke migrere væk fra neuralrøret (figur 3b). Lejlighedsvis neuralrøret ikke tillægger de fibronectin-coatede plader.

Det er vores erfaring, kan sub-optimale NC migration eller problemer med fastgørelse af neuralrøret blive negativt påvirket af normoxi betingelser eller koncentration af fibronectin, hhv. Enzymatiske aktivitet af collagenase / dispase varierer svagt med parti og fordøjelse tid skal justeres passende, men ikke fordøje vævet længere end femten minutter. Overdigestion af neuralrøret, som indeholder vævet i collagenase / dispase vil også resultere i mangel udvækster. Hvis somit væv ikke let fjernes fra neuralrøret efter inkubation i collagenase / dispase kan neuralrøret inkuberes i mere end ti minutter. Undertiden neuralrøret ikke fastgøres den til substratet. Hvis dette er tilfældet, dobbelttjekke fibronectin koncentration og hypoksi betingelser.

Mens normoxiske betingelser kan anvendes til dyrkning vildtype NC, hypoxiske betingelser mere nøje efterligner in vivo-miljø 29,30. Det er vores erfaring, blev hypoxisk betingelser kritisk, når dyrkning af mutant NC. For eksempel, når Foxd3 mutant NC blev dyrket i normoxiske betingelser stammen NC havde en stærkt reduceret celleudgroning sammenlignet med kontroller. Denne forskel i udvækst størrelse blev fjernet, når eksplantaterne dyrket i hypoxiske betingelser (figur 4). Endvidere, når vildtype neurale rør eksplantater blev dyrket i normoxi, antallet af caspase-positive celler var større end for lignende eksplantater dyrket i hypoksi (data ikke vist). Ved at fastholde alle NC kultur i hypoxi, kan sammenligninger lettere skelne mellem dynamik kontrol og mutant kulturer.

Figur 1
3% O2 hypoxiske betingelser.

Figur 2
Figur 2. Trinvis fjernelse af neuralrøret fra eksplantatet. Neuralrøret skal fjernes efter 24-48 timer for at forhindre kontaminering med ikke-NC celler. A) Meddelelse grænsen mellem neuralrøret og NC udvækst (optrukket linie). B) Skær langs kanten af ​​neuralrøret med en insulin nål. C) kasseres neuralrøret og erstatte mediet med frisk selvfornyelse medium. Stiplede linje angiver omfanget af udvækst. Forkortelse: NT, neuralrør.


Figur 3. Eksempler på repræsentative resultater. A) Typisk eksplantatet udvækst efter 24 timers inkubation i selvfornyelse medium i hypoxiske betingelser (stiplede linje angiver omfanget af udvæksten). B) forstørrelse af NC udvækst efter 48 timer i kultur. C) Mindre ideel kultur med lav aksoner udbytte. A og C blev dyrket under de samme betingelser. Billeder viser naturlige udbredelsesområde i kultur robusthed. Dette kan blive påvirket af effektiviteten af ​​neuralrøret isolation, koncentration af FN, hypoxiske betingelser, og tiden i collagenase / dispase fordøjelser.

Figur 4
Figur 4. In vitro analyser af NC eksplantatkulturer i normoxi versus hypoxi. Kontrol (vildtype) NC-celler migreret fra neurale rør eksplantater efter 48 timer i normoxiske dyrkningsbetingelser. I modsætning hertil mutant Foxd3NC havde kraftigt reduceret celle udvækster i normoxi (røde konturer mærke kanter af NC udvækster). Når sammenlignelige eksplantaterne blev dyrket under hypoxiske betingelser, Foxd3 mutant NC eksplantaterne voksede sammenligneligt kontrol, så de efterfølgende analyser. Bemærk, denne adfærd korrelerede godt med den adfærd, Foxd3 mutant NC in vivo.

Discussion

Omhyggelig bør man være opmærksom på udviklingsstadiet af embryo for at sikre succes for denne tilgang. Optælling somitter af tidlige museembryoer er kritisk for både fase matche embryoner inden for et kuld hvalpe og bestemme de korrekte områder af neuralrøret for isolation. En variation af en eller to somitter mellem embryoer er inden for et rimeligt udvalg af udviklingsmæssige timing, afhængigt af opløsningen af ​​den gennemførte forsøget. Et embryo mellem 9 og 9,5 DPC vil have mellem 17 og 25 somitter. Hvis fosteret har mere end 25 somitter, er NC længere fremme i udviklingspsykologi tid, og NC udvækster vil være mindre robuste i kultur. Iscenesættelse embryoner baseret på somit nummer letter præcision i eksperimenter, hvor udviklingsstadiet af embryo, og derfor NC, kan påvirke udfaldet af forsøgene. I en 9,5 DPC embryo, vandrer det vagale NC fra dorsale neuralrøret i definerede anterior-posterior grænser: fra midten af ​​øret placode til somit 7.Tilsvarende trunk NC migrerer fra neuralrøret ved niveauer somit 8 til somit 24. For at isolere forskellige populationer af NC forfædre som beskrevet i denne protokol, er diskret sub-regioner inden for hver af disse domæner isoleret. Det område af neuralrøret anvendes, vil variere baseret på udformning af eksperimentet og den anteriore-posteriore region af NC blev undersøgt.

Dyrkningsbetingelserne er beskrevet ovenfor, herunder medium og inkubationsbetingelser er specifikt tilpasset til dyrkning af murin NC. Lignende SR medium blev først anvendt til dyrkning af rotte-NC 11. I vores hænder, frembringer dette rotte medium med tilsætning af Neurobasal medium, en robust udvækst af murine NC progenitorer. Endvidere, i modsætning til tidligere arbejde dyrkning aviære NC celler, er et fødelag unødvendig til dyrkning af mammale NC ved hjælp af denne metode 11,13,21,22. Mens der er mange protokoller der beskriver både fugle og pattedyr NC kultur i normoxisk conditi ons 9,22, vi 23 (Figur 4), sammen med andre i området 20, fandt have, at dyrkning af murine NC-celler i hypoxisk betingelser, som beskrevet her i høj grad hjælpemidler overlevelse og selv-fornyelse, formentlig fordi hypoxi mere nøje efterligner fysiologiske iltindholdet i embryoet 20,29,30.

Evaluering af ekspressionen af ​​molekylære markører i høj grad letter identifikationen af ​​NC-celler og deres differentierede derivater. Disse omfatter udtryk for Foxd3, p75, og Sox10 for NC stamceller. Markører for differentieret NC omfatter glat muskel-alpha-actin (SMA) for myofibroblaster, glial fibrillært surt protein (GFAP) for glia, microphthalmia-associeret transkriptionsfaktor (MITF) for melanocytter, og beta-III tubulin, protein genprodukt 9,5 (PGP9.5 ) og peripherin for neuroner. Disse markører kan anvendes til at bestemme eksplantat effektivitet og differentiering af NC progenitorer.

indhold "> Når denne teknik beherskes, kan dyrkes NC anvendes i en række assays, herunder kvantificering af proliferation, celledød, migrering dynamik, og / eller differentiering status. NC kan også være klonalt dyrkes at undersøge selvfornyelse eller multipotency af individuelle NC progenitorer 23. Efter neuralrøret fjernes fra kulturerne, dissociere NC celler i 100 pi Trypsin-EDTA (0,25%) i nøjagtigt 5 minutter ved 37 ° C. Stands Trypsin-EDTA på over vaskemedium (8-10 ml) ved tilsætning af 800 pi pr brønd og overførsel til individuelle 15 ml rør indeholdende vaskemedium. forsigtigt centrifugeres cellerne ved 150 x g i 3 minutter, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml SR medium. tælle celler under anvendelse af et hæmocytometer og plade dem en densitet på 25 celler / cm 2. Disse kolonier kan serielt passeret til assay selvfornyelse. Til assay multipotency, opretholde NC cellerne ved klonal densitet i SR medium i 6 dage og derefter skifte til differentieringmedium (10 ng / ml bFGF og 1% hønseembryo ekstrakt). Kultur cellerne i differentiering medium under hypoxi til 8 dage før analysere koloni sammensætning med molekylære markører som ovenfor 11.

Sammenfattende frembringer denne fremgangsmåde til isolering af NC-celler fra museembryoer en feeder fri vedhængende kultur af premigratory NC celler uden anvendelse af FACS. Analyse af eksperimenter som benytter disse celler nemt kan kvantificeres. Mens denne teknik er ligetil, deres ansøgninger om undersøgelse af NC egenskaber migration, selv-fornyelse og differentiering er enorme. Endvidere isoleres NC fra genetisk modificerede museembryoer giver mulighed for direkte undersøgelse af bestemte gener og veje i forbindelse med NC migration, overlevelse og / eller differentiering.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende Marc Wozniak til video assistance. Vi vil også gerne takke Sean Morrison på UT Southwestern for den oprindelige protokol for dyrkning af rotte NC celler. Dette arbejde blev støttet Vanderbilt University Medical Center Akademisk Program Support og ved tilskud fra NIH (HD36720 og HD036720-11S109) og AHA 11GRNT7690040 til PAL, predoctoral stipendier fra AHA (0615209B) og NIH (NS065604) til NAM, og ERP var understøttet af en NIH træning tilskud T32HD007502.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (low glucose) GIBCO, by Life Technologies 11885
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103
BSA Sigma-Aldrich A3912-10G
dPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-144
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots
Fibronectin GIBCO, by Life Technologies 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625 Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots
2-mercapt–thanol Sigma-Aldrich D-5637
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
Steriflip 0.22 μm filters EMD Millipore SCGP00525
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
0.20 μm filters Corning 431219
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604
Four well plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 176740
Collagenase/Dispase Roche Group 269 638 Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots.
Insulin needles (29 ½ gage) BD Biosciences 309306
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg, Inc.
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg, Inc.
Forceps #5 Fine Science Tools For removing uterus and decidua.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
  2. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
  3. Saint-Jeannet, J. -P. Neural crest induction and differentiation. Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).
  4. Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
  5. Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
  6. Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
  7. Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
  8. Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
  9. Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
  10. White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
  11. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  12. Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
  13. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  14. Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
  15. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
  16. Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
  17. Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
  18. Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. 126-3781 (1999).
  19. Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
  20. Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
  21. Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
  22. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
  23. Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
  24. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
  25. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
  26. Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
  27. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
  28. Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
  29. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
  30. Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).
Isolering og dyrkning af neurale kamceller fra embryonale Murin Neural Tube
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).More

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter