Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

doi: 10.3791/4134 Published: June 2, 2012

Summary

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik van

Abstract

De embryonale neurale lijst (NC) is een multipotente voorlopercellen bevolking die afkomstig zijn van de dorsale aspect van de neurale buis, ondergaat een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) en migreert in het embryo, die aanleiding geven tot verschillende celtypen 1-3. NC heeft ook de unieke mogelijkheid om de differentiatie en rijping van de doelorganen 4-6 te beïnvloeden. Wanneer geëxplanteerd in vitro, NC voorouders zelfvernieuwing ondergaan, migreren en differentiëren in een verscheidenheid van het weefsel vormen, met inbegrip neuronen, glia, gladde spiercellen, kraakbeen en bot.

NC multipotent werd voor het eerst beschreven vanuit explantaten van de aviaire neurale buis 7-9. In vitro isolatie van NC cellen vergemakkelijkt de studie van de NC-dynamiek met inbegrip van proliferatie, migratie en multipotent. Verdere werkzaamheden in de vogelgriep en ratten hebben aangetoond dat geëxplanteerd NC cellen hun NC potentieel behouden wanneer weer getransplanteerd in het embryo 10-13. Omdat deze inherente cellulaire eigenschappen zijn bewaard gebleven in geëxplanteerd NC voorouders, de neurale buis explant test biedt een aantrekkelijke optie voor het bestuderen van de NC in vitro.

Om een ​​beter begrip van de zoogdieren NC te realiseren, hebben vele methoden zijn gebruikt om NC bevolking te isoleren. NC-afgeleide voorlopercellen kan gekweekt worden uit post-trekkende locaties in zowel het embryo en volwassenen om de dynamiek van de post-trekkende NC voorouders 11,14-20 te bestuderen, maar de isolatie van NC voorouders als ze emigreren van de neurale buis zorgt voor een optimale bewaring van NC cel potentieel en trekkende eigenschappen 13,21,22. Sommige protocollen gebruiken fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) een NC populatie verrijkt bijzonder voorlopers 11,13,14,17 isoleren. Echter, bij de start met een vroeg stadium embryo's celaantallen geschikt voor analyse moeilijk te verkrijgen met FACS bemoeilijkt de isolatie van de eerste NC populations van individuele embryo's. Hier beschrijven we een benadering die niet op de FACS en de resultaten vertrouwen in een ongeveer 96% zuiver NC bevolking op basis van een Wnt1-Cre geactiveerde lijn reporter 23.

De methode hier gepresenteerde is een bewerking van protocollen geoptimaliseerd voor de cultuur van de rat NC 11,13. De voordelen van dit protocol dan eerdere methoden zijn dat 1) de cellen niet gekweekt op een voedingsbodem, 2) FACS is niet vereist om een ​​relatief zuivere NC populatie, 3 verkrijgen) premigratory NC cellen geïsoleerd en 4) verloopt gemakkelijk worden gekwantificeerd. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt voor de isolatie van NC van een mutant muismodel de studie van het NC eigenschappen met verschillende genetische manipulaties. De beperking van deze benadering is dat de NC wordt verwijderd uit de context van de embryo, waarvan bekend is dat de overleving migratie en differentiatie van de NC 2,24-28 beïnvloeden.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Voorbereiding van Platen

  1. Gebruik steriele techniek allen tijde.
  2. Bereid fibronectine (FN) door verdunning 100 pl van menselijk plasma FN bouillon in een eindvolume van 3,3 ml in PBS van Dulbecco (DPBS). Uiteindelijke concentratie 30 pg / ml en kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 week.
  3. Bedek bodem van elk putje van een steriele weefselkweek vier goed plaat met FN-oplossing en laten zitten voor 15 minuten. Zorg ervoor dat het hele oppervlak is bedekt. Merk media tijdens deze periode (stap 2 en 3).
  4. Verwijder FN oplossing en laat platen drogen. Voorzichtig spoelen putten met 500 pL DMEM, verwijderen DMEM, en voeg 500 ul van Self-Renewal (SR) medium (zie hieronder). Incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5 procent CO2. Vul dit ongeveer een uur vóór versnijding, zodat de platen droog voor gebruik.

2. Voorbereiden SR Medium

  1. Voor de cultuur van de vagale en romp NCvan tien embryo (ongeveer een nest, afhankelijk genetische achtergrond van de muis lijn), bereid 25 ml SR medium. Meng 12,5 ml laag glucose DMEM, 7,5 ml Neurobasal Medium 25 pi retinoïnezuur (117 uM eindconcentratie) en 25 pi 2-mercaptoethanol (50 mM eindconcentratie). Meng goed.
  2. Voeg 3,75 ml Chick Embryo Extract, 250 ul N 2 extra zout, 500 pL B27 supplement en 250 ul penicilline-streptomycine (1% eindconcentratie). Filter het medium door een 0,22 pm filter.
  3. Voeg 10 ul steriel IGF1 (20 ug / ml eindconcentratie) en 20 pi steriel bFGF (20 ug / ml eindconcentratie). Meng door het omkeren. Bewaar bij 4 ° C.

3. Voorbereiden Wash Medium

  1. Voor ongeveer 10 embryo's voor te bereiden 50 ml wassen medium. Combineer 50 mg BSA met 35 ml lage glucose DMEM, 15 ml Neurobasal Medium, en 500 ul penicilline-streptomycine (1% eindconcentratie). Steriel filter met een 0,22urn gefiltreerd.

4. Voorbereiden Collagenase / Dispase

  1. Voeg 50 pi van 100 mg / ml collagenase / Dispase tot 5 ml DPBS. Meng goed.
  2. Spuit filter met een 0,2 um filter en 1,5 ml toe te voegen in elk van de drie putten van een twaalf goed plaat. Pipetteer ongeveer 1 ml wasmedium in de overige wells. Bewaar gehele plaat op ijs totdat u ze gaat ontleed weefsel verteren.
  3. Snijd tips van een P20 en P1000 pipet filtertip met een steriel scheermesje. Juist onder de schuine rand van de tip. De afgesneden P1000 worden gebruikt om de gehele embryo dragen terwijl de p20 wordt gebruikt om stukjes geïsoleerde weefsel te brengen.

5. Isoleren Vagale en Trunk Neural Tube van 9,5 dpc embryo's

  1. Voor de timing van zwangerschappen, worden dammen met een vaginale plug beschouwd 0,5 dpc 's middags' s ochtends de stekker wordt waargenomen. Offer en verwijder de baarmoeder van 9,5 dpc.
  2. Verwijder de decidua van baarmoeder en voorzichtig rchrap het embryo uit de decidua. Na ervaring met dit protocol, te isoleren 3-4 9.5 dpc embryo's op een moment in een steriele DPBS. Gebruik steriele techniek en gesteriliseerd dissectie-instrumenten. Instrumenten kunnen worden gesteriliseerd door autoclaveren, warmte sterilisatie of door incubatie in ethanol.
  3. Voor anterior vagale NC: het gebruik van insuline naalden, snijd de neurale buis in het midden otic placode. Snijd weer op de achterste rand van het 4 e somiet. Trim weefsel ventraal van de neurale buis om de faryngeale bogen en het hart te verwijderen.
  4. Voor de romp NC: het gebruik van insuline naalden, verwijder dan het gedeelte van de neurale buis tussen somieten 16 tot 22 (of de laatste somiet als embryo's op ontwikkelingsgebied ouder zijn dan de 22 somiet stadium).
  5. Houd de dooierzak en de eventuele resterende embryonaal weefsel voor genotypering.

6. Verwijdering van niet-neurale ectoderm en mesoderm

  1. Plaats neurale buis met segmenten in collagenase / Dispase bij kamertemperatuur 10 minutens. Onmiddellijk in het wassen medium.
  2. Keer terug weefsel tot steriele DPBS. Met behulp van steriele naalden insuline, verwijder voorzichtig de niet-neurale ectoderm uit het weefsel en scheid de somieten uit de buurt van de neurale buis. De laatste resterende delen van het mesoderm van somiet weefsel kan worden verwijderd door tritureren zachtjes met een cut-down P20 tip. Wees voorzichtig om geen schade aan de neurale buis. Observeer dit tijdens tritureren.
  3. Plaats de geïsoleerde neurale buis door een tweede en derde 30 seconden wassen van het wasgoed medium.
  4. Was eenmaal in SR medium, en plaats de geïsoleerde neurale buis in het midden van een FN-coating goed, dat eerder werd bereid (Stap 1.3). Dompel de hypoxie kamer met een schotel van steriel water. Plaats de schaal in de kamer hypoxie en spoel kamer met gasmengsel tot 3% O 2 (met een tank met een mengsel van 1% O 2, 6% CO2, 93% N2).
  5. Ga altijd voorzichtig de kamer zeer zorgvuldig to tha zorgent explantaten geen storingen zijn en in het midden van de putten.
  6. Incuberen bij 37 ° C. Samenvatting van de stappen 5-6 is weergegeven in figuur 1.

7. Verwijdering van de neurale buis

  1. Na 24 uur incubatie, verwijder de neurale buis door voorzichtig plagen de rand van de neurale buis uit de buurt van de migrerende cellen met behulp van een steriele naald insuline. Verwijder de neurale buis van het medium met een steriele p20 gesneden als in stap 6.2 en vervangen door het medium met vers SR medium (figuur 2). Dit wordt het gemakkelijkst uitgevoerd met een omgekeerde microscoop.

8. Representatieve resultaten

Na 24 uur incubatie bij 37 ° C in hypoxische omstandigheden NC cellen gemigreerd van de neurale buis in een nagenoeg zuivere populatie (figuur 3a). Soms zal minder dan ideale culturen niet leveren robuuste uitwassen. Zo is het mogelijk dat na 24 uur tHij neurale buis zal hebben opgerold op zichzelf en het NC zal niet weg te stappen van de neurale buis (figuur 3b). Af en toe de neurale buis niet zal hechten aan de fibronectine gecoate platen.

In onze ervaring, kunnen sub-optimale NC migratie of problemen met de bevestiging van de neurale buis nadelig beïnvloed worden door normoxia voorwaarden of concentratie van de fibronectine, respectievelijk. Enzymatische activiteit van de collagenase / Dispase verschilt enigszins per partij en de spijsvertering tijd moeten behoren afgesteld, echter niet verteren het weefsel langer dan vijftien minuten. Overdigestion van de neurale buis die weefsel in collagenase / Dispase zal ook leiden tot een onvoldoende uitwassen. Als somiet weefsel wordt niet gemakkelijk uit de neurale buis na incubatie in collagenase / Dispase, kan de neurale buis worden geïncubeerd langer dan tien minuten. Soms neurale buis niet aan op het substraat. Indien dit het geval is, controleert de fibronectin concentratie en de hypoxia.

Hoewel normoxie kan worden cultuur wild-type NC, hypoxische omstandigheden nauwer na te bootsen de in vivo omgeving 29,30. Onze ervaring is dat hypoxische condities werd kritisch bij het kweken van mutant NC. Wanneer bijvoorbeeld Foxd3 mutant NC werden gekweekt in normoxie, romp NC had een sterk verminderde cel uitgroei in vergelijking met controles. Dit verschil in grootte uitgroei werd verwijderd toen de explantaten werden gekweekt in hypoxische omstandigheden (figuur 4). Bovendien, als wild-type neurale buis explantaten werden gekweekt in normoxia het aantal caspase-positieve cellen was groter dan die van soortgelijke explantaten gekweekt in hypoxie (gegevens niet getoond). Door het handhaven van alle NC cultuur in hypoxie, kunnen vergelijkingen gemakkelijker worden gemaakt tussen de dynamiek van controle en mutant culturen.

Figuur 1
2 hypoxische omstandigheden.

Figuur 2
Figuur 2. Stapsgewijze het verwijderen van de neurale buis van explantaat. De neurale buis moet worden verwijderd na 24-48 uur om verontreiniging met niet-NC-cellen te voorkomen. A) Let op de grens tussen de neurale buis en de NC uitgroei (vaste lijn). B) Knip langs de rand van de neurale buis met een insuline naald. C) Gooi de neurale buis en vervang medium met vers zelfvernieuwing medium. Onderbroken lijn geeft de omvang van de uitgroei. Afkorting: NT, neurale buis.


Figuur 3. Voorbeelden van representatieve resultaten. A) Typische explant uitgroei na 24 uur incubatie bij zelfvernieuwing medium in hypoxische omstandigheden (gestippelde lijn geeft de omvang van de uitgroei). B) Vergrote weergave van NC uitgroei na 48 uur in de cultuur. C) Minder ideale cultuur met een lage uitgroei opbrengst. A en C werden onder dezelfde omstandigheden. Afbeeldingen tonen het natuurlijke verspreidingsgebied in de cultuur robuustheid. Dit kan worden beïnvloed door de efficiëntie van de neurale buis isolatie, concentratie van het FN, hypoxische omstandigheden, en tijd in collagenase / Dispase ontsluitingen.

Figuur 4
Figuur 4. In vitro analyses van NC explant culturen in normoxia ten opzichte van hypoxie. Control (wild-type) NC-cellen gemigreerd van neurale buis explantaten na 48 uur in normoxische kweekomstandigheden. Daarentegen Foxd3 mutantNC was sterk verminderd cel uitwassen in normoxia (rode contouren merk randen van de NC uitwassen). Bij vergelijkbare explantaten werden gekweekt onder hypoxische condities, Foxd3 mutant NC explantaten groeide vergelijkbaar met controles, waardoor latere analyses. Let op, dit gedrag goed gecorreleerd met het gedrag van Foxd3 mutant NC in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan het ontwikkelingsstadium van het embryo aan het succes van deze aanpak te garanderen. Tellen somieten van de vroege muizenembryo's is van cruciaal belang voor zowel het podium bijpassende embryo's in een nest en het bepalen van de juiste regio's van de neurale buis voor isolatie. Een variatie van een of twee somieten tussen embryo binnen een redelijk aantal ontwikkelingstiming, afhankelijk van de resolutie van de uitgevoerde experimenten. Een embryo tussen 9 en 9,5 dpc zal hebben tussen de 17 en 25 somieten. Als het embryo heeft meer dan 25 somieten, wordt de NC verder ontwikkeld in ontwikkelings-tijd, en NC uitwassen zullen minder robuust zijn in cultuur. Staging embryo's op basis van somiet aantal vergemakkelijkt precisie in experimenten bij het ontwikkelingsstadium van het embryo, en dus NC, kan invloed hebben op de uitkomst van de experimenten. In een 9,5 dpc embryo, de vagale NC migreert van het dorsale neurale buis in de gedefinieerde anterior-posterior grenzen: vanaf het midden van otic placode aan somiet 7.Ook stam NC migreert van neurale buis niveaus somiet 8 somiet 24. Om verschillende populaties van NC-voorlopercellen, zoals beschreven in dit protocol te isoleren, zijn discrete sub-regio's binnen elk van die domeinen geïsoleerd. De regio van de neurale buis gebruikt zal variëren op basis van het ontwerp van het experiment en de anterior-posterior regio van de NC wordt onderzocht.

De cultuur hierboven beschreven voorwaarden, met inbegrip van het medium en incubatie-omstandigheden, zijn speciaal aangepast voor de cultuur van muizen NC. Vergelijkbare SR medium werd eerst gebruikt voor de cultuur van de rat NC 11. In onze handen, deze rat medium, met de toevoeging van Neurobasal Medium, geeft een robuuste uitgroei van muizen-NC-voorlopercellen. Bovendien, in tegenstelling tot eerder werk het kweken van vogels NC-cellen, een feeder-laag is niet nodig voor cultuur van de zoogdieren NC met deze methode 11,13,21,22. Hoewel er tal van protocollen waarin zowel de vogels en zoogdieren NC cultuur in normoxische omstandig ons 9,22, we 23 (figuur 4), samen met anderen in het veld 20, hebben ontdekt dat het kweken van muizen-NC-cellen in hypoxische condities zoals hier beschreven enorm helpt te overleven en zelf-vernieuwing, vermoedelijk omdat hypoxie nauwer nabootst fysiologische zuurstofgehalte binnen het embryo 20,29,30.

Evaluatie van de expressie van moleculaire merkers aanzienlijk vergemakkelijkt de identificatie van cellen NC en gedifferentieerde derivaten. Deze omvatten uitdrukking van Foxd3, P75, en Sox10 voor NC stamcellen. Markers van gedifferentieerde NC zijn gladde spieren alfa-actine (SMA) voor myofibroblasten, gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP) voor de glia, microftalmie-gerelateerde transcriptiefactor (MITF) voor de melanocyten, en beta-tubuline III, proteïne-genproduct 9,5 (PGP9.5 ) en peripherin voor de neuronen. Deze merkers kunnen worden gebruikt om explantaat efficiëntie en differentiatie van NC voorlopercellen bepalen.

content "> Als deze techniek wordt geleid, kan gekweekte NC worden in verschillende assays met kwantificering van proliferatie, celdood migratiedynamiek en / of differentiatie statuut. NC kan hij klonaal gekweekt zelf-verlenging of multipotent van onderzoeken individuele NC voorlopers 23. Na neurale buis wordt verwijderd uit de cultuur, dissociëren de NC cellen in 100 pi trypsine-EDTA (0,25%) precies 5 minuten bij 37 ° C. Doof trypsine-EDTA dan wasmedium (8-10 ML) door toevoeging 800 pl per putje en het overdragen van individuele 15 ml buizen met wasmedium. zachtjes gecentrifugeerd cellen bij 150 g gedurende 3 minuten verwijderd supernatant en hersuspenderen celpellet in 1 ml medium SR. Count cellen door een hemocytometer en plaat ze op een dichtheid van 25 cellen / cm 2. Deze kolonies kunnen serieel worden gepasseerd voor het testen van zelf-vernieuwing. Om test multipotent, onderhouden de NC-cellen op klonale dichtheid in SR medium voor 6 dagen en dan overschakelen naar differentiatiemedium (10 ng / mL bFGF en 1% kippenembryocellen extract). De cultuur van de cellen in differentiatie medium onder hypoxie gedurende 8 dagen voor het analyseren van kolonie compositie met moleculaire merkers zoals hierboven 11.

Concluderend deze methode voor het isoleren NC cellen van de muis embryo produceert feeder vrije aanhanger cultuur van premigratory NC cellen zonder het gebruik van FACS. Analyse van experimenten met deze cellen kunnen gemakkelijk worden gekwantificeerd. Hoewel deze techniek is eenvoudig, de toepassingen ervan voor de studie van NC kenmerken van de migratie, zelfvernieuwing en differentiatie zijn enorm. Bovendien isoleren NC van genetisch gemodificeerde muisembryo maakt de rechtstreekse studie van bepaalde genen en wegen in het kader van NC migratie overleving en / of differentiatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Wij hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij willen Marc Wozniak erkennen voor video-ondersteuning. Wij zouden ook graag Sean Morrison te erkennen aan de UT Southwestern voor het oorspronkelijke protocol voor het kweken van ratten NC cellen. Dit werk werd ondersteund Vanderbilt University Medical Center Academisch programma Support en door subsidies van de NIH (HD36720 en HD036720-11S109) en de AHA 11GRNT7690040 op PAL, predoctorale beurzen van de AHA (0615209B) en NIH (NS065604) naar de NAM, en ERP was ondersteund door een NIH-subsidie ​​T32HD007502 training.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (low glucose) GIBCO, by Life Technologies 11885
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103
BSA Sigma-Aldrich A3912-10G
dPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-144
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots
Fibronectin GIBCO, by Life Technologies 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625 Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots
2-mercapt–thanol Sigma-Aldrich D-5637
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
Steriflip 0.22 μm filters EMD Millipore SCGP00525
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
0.20 μm filters Corning 431219
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604
Four well plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 176740
Collagenase/Dispase Roche Group 269 638 Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots.
Insulin needles (29 ½ gage) BD Biosciences 309306
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg, Inc.
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg, Inc.
Forceps #5 Fine Science Tools For removing uterus and decidua.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
  2. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
  3. Saint-Jeannet, J. -P. Neural crest induction and differentiation. Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).
  4. Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
  5. Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
  6. Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
  7. Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
  8. Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
  9. Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
  10. White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
  11. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  12. Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
  13. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  14. Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
  15. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
  16. Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
  17. Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
  18. Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. 126-3781 (1999).
  19. Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
  20. Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
  21. Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
  22. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
  23. Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
  24. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
  25. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
  26. Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
  27. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
  28. Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
  29. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
  30. Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).
Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).More

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter