Summary
Isolement de la crête neurale embryonnaire à partir du tube neural facilite l'utilisation de
Abstract
Le feuillet embryonnaire de la crête neurale (CN) est une population progénitrices multipotentes qui provient à la face dorsale du tube neural, subit une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et migre à travers l'embryon, donnant lieu à divers types cellulaires 1-3. NC a également la capacité unique d'influencer la différenciation et la maturation des organes cibles 4-6. Lorsque explanté in vitro, les progéniteurs NC subissent une auto-renouvellement, de migrer et se différencier en une variété de types de tissus, y compris les neurones, cellules gliales, les cellules musculaires lisses, des cartilages et des os.
Multipotence NC a été décrite pour la première à partir d'explants du tube neural aviaire 7-9. Dans l'isolement in vitro de cellules NC facilite l'étude de la dynamique de NC, y compris la prolifération, la migration et multipotence. Des travaux supplémentaires dans les systèmes aviaires et le rat ont démontré que les cellules explantées NC conservent leur potentiel de NC lorsque transplantées dans l'embryon 10-13. Parce que ces propriétés inhérentes cellulaires sont conservés dans les progéniteurs NC explantés, le dosage du tube neural explant fournit une option intéressante pour l'étude de la NC in vitro.
Pour atteindre une meilleure compréhension de l'mammifères NC, de nombreuses méthodes ont été employées pour isoler les populations NC. NC dérivés progéniteurs peuvent être cultivées à partir de post-migratoires endroits à la fois dans l'embryon et l'adulte pour étudier la dynamique de progéniteurs NC post-migratoires 11,14-20, mais l'isolement des progéniteurs NC comme ils émigrent à partir du tube neural fournit une conservation optimale de la CN cellule potentiel et des propriétés de migration 13,21,22. Certains protocoles utilisent la fluorescence tri cellulaire (FACS) pour isoler une population enrichie en progéniteurs NC particuliers 11,13,14,17. Cependant, quand on commence avec des embryons à un stade précoce, le nombre de cellules adéquates pour les analyses sont difficiles à obtenir avec FACS, ce qui complique l'isolement de début NC populations à partir d'embryons individuels. Ici, nous décrivons une approche qui ne repose pas sur FACS et les résultats dans un environ 96% de la population NC pure, basée sur un journaliste Wnt1-Cre activé lignée 23.
La méthode présentée ici est une adaptation de protocoles optimisés pour la culture de rat NC 11,13. Les avantages de ce protocole par rapport aux méthodes précédentes sont que 1) les cellules ne sont pas cultivés sur une couche nourricière, 2) FACS n'est pas nécessaire d'obtenir une population relativement pur NC, 3) prémigratoire cellules NC sont isolés et 4) les résultats sont facilement quantifiés. En outre, ce protocole peut être utilisé pour l'isolement de NC de tout modèle de la souris mutante, ce qui facilite l'étude des caractéristiques NC avec différentes manipulations génétiques. La limitation de cette approche est que le NC est supprimé à partir du contexte de l'embryon, qui est connue pour influencer la survie, la migration et la différenciation de la NC 2,24-28.
Protocol
1. Plaques Préparation
- Utiliser une technique stérile à tout moment.
- Préparer la fibronectine (FN) en diluant 100 uL de plasma humain FN stock dans un volume final de 3,3 ml dans du PBS de Dulbecco (DPBS). La concentration finale est de 30 pg / ml, ce qui peut être conservé à 4 ° C pendant 1 semaine.
- Recouvrez le fond de chaque puits d'une culture de tissu stérile de quatre plats bien avec une solution FN et laisser reposer pendant 15 minutes. Assurez-vous que la surface est entièrement recouverte. Sensibiliser les médias pendant cette période (étapes 2 et 3).
- Retirer FN solution et laisser les plaques sécher. Rincer délicatement les puits avec 500 uL de DMEM, supprimer DMEM, et ajouter 500 ul d'auto-renouvellement (SR) à moyen (voir ci-dessous). Incuber à 37 ° C dans un incubateur humidifié contenant 5 pour cent de CO 2. Remplissez cette heure environ avant la dissection de sorte que les plaques seront à sec avant de l'utiliser.
2. Préparation moyen SR
- Pour la culture de la vague et le tronc NCà partir de dix embryons (environ une portée, selon le fond génétique de la lignée de souris), de préparer 25 ml de milieu SR. Mélanger 12,5 ml de glucose à faible DMEM, 7,5 ml de milieu Neurobasal, 25 l'acide rétinoïque ul (117 uM de concentration finale), et 25 pi de 2-mercaptoéthanol (50 mM de concentration finale). Mélangez bien.
- Ajouter 3,75 ml extrait d'embryon de poussin, 250 ul supplément sel N 2, 500 ul B27 supplément et 250 ul de pénicilline-streptomycine (1% en concentration finale). Filtrer le milieu à travers un filtre de 0,22 um.
- Ajouter 10 uL stérile IGF1 (20 pg / ml de concentration finale) et 20 bFGF ul stérile (20 pg / ml de concentration finale). Mélanger par inversion. Conserver à 4 ° C.
3. Préparation Lavable
- Pour environ 10 embryons de préparer 50 ml de milieu de lavage. Mélanger 50 mg de BSA avec 35 ml de glucose à faible DMEM, 15 ml de milieu Neurobasal, et 500 ul de pénicilline-streptomycine (1% en concentration finale). Filtre stérile avec un 0,22Filtre um.
4. Préparation de la collagénase / dispase
- Ajouter 50 uL de 100 mg / ml de collagénase / dispase à 5 mL dPBS. Mélangez bien.
- Seringue filtre avec un filtre de 0,2 um et ajoutez 1,5 ml dans chacun des trois puits d'une plaque douze bien. Introduire à la pipette d'environ 1 ml milieu de lavage dans les puits restants. Conserver la plaque entière sur la glace jusqu'à ce que prêt à digérer les tissus disséqués.
- Couper conseils d'un embout de pipette p20 et p1000 filtre avec une lame de rasoir stérile. Coupez juste au-dessous du bord biseauté de la pointe. La coupure sera p1000 être utilisé pour transférer l'embryon entier tandis que le p20 sera utilisé pour transférer des morceaux de tissu isolé.
5. Isoler vagal et Tube Neural Trunk à partir d'embryons DPC 9.5
- Pour les grossesses chronométrés, les barrages avec un bouchon vaginal sont considérés 0,5 dpc à midi le matin, le bouchon est observée. Sacrifice et enlever l'utérus à 9,5 dpc.
- Retirez la caduque de l'utérus et doucement remove l'embryon de la caduque. Une fois connu avec ce protocole, isoler 3-4 9.5 embryons DPC à la fois dans dPBS stériles. Utiliser une technique stérile et instruments de dissection stérilisés. Les instruments peuvent être stérilisés par autoclavage stérilisation par la chaleur, ou par incubation dans de l'éthanol.
- Pour antérieure vagal NC: l'utilisation d'aiguilles à insuline, couper le tube neural à la mi placode otique. Couper à nouveau le bord postérieur du somite 4 e. Coupez le tissu ventral du tube neural de supprimer les arcs branchiaux et le cœur.
- Pour NC tronc: l'utilisation d'aiguilles à insuline, enlever la partie du tube neural entre somites 16-22 (ou le dernier somite si les embryons sont développemental plus tôt que l'étape 22 somite).
- Gardez le sac vitellin et tout tissu restant embryonnaire pour le génotypage.
6. Retrait de la non-neuronal ectoderme et du mésoderme
- Placez tube neural contenant des segments dans la collagénase / dispase à température ambiante pendant 10 minutess. Laver immédiatement au milieu de lavage.
- Retourner tissu à dPBS stériles. Utiliser des aiguilles stériles à insuline, retirez délicatement l'ectoderme non neural du tissu et de séparer les somites loin du tube neural. Les dernières parties restantes du mésoderme à partir de tissus somite peut être retiré en triturant délicatement avec une cut-down p20 pointe. Attention à ne pas endommager le tube neural. Observez attentivement la situation au cours de la trituration.
- Placer le tube neural isolé par un lavage des deuxième et troisième 30 secondes de milieu de lavage.
- Laver une fois dans un milieu SR, et placer le tube isolé neuronal dans le centre d'un puits FN-revêtu qui a été préparé précédemment (étape 1.3). Humidifier la chambre de l'hypoxie avec un plat d'eau stérile. Placer la capsule dans la chambre de l'hypoxie et rincer la chambre avec le gaz mixte à 3% d'O 2 (utiliser un réservoir contenant un mélange de 1% de O 2, 6% de CO 2, 93% de N 2).
- Toujours manipuler la chambre avec un soin extrême pour assurer l'eexplants t ne sont pas perturbées et restent dans le centre du puits.
- Incuber à 37 ° C. Résumé des étapes 5-6 est illustré à la figure 1.
7. Retrait du tube neural
- Après 24 heures d'incubation, retirer le tube neural par un léger taquiner le bord du tube neural à l'écart des cellules qui migrent à l'aide d'une aiguille d'insuline stérile. Retirer et jeter le tube neural à partir du milieu en utilisant un coupe p20 stérile comme à l'étape 6.2 et remplacer le milieu avec SR milieu frais (Figure 2). Ceci est plus facile à faire à l'aide d'un microscope inversé.
8. Les résultats représentatifs
Après 24 heures d'incubation à 37 ° C dans des conditions hypoxiques, les cellules ont migré loin NC à partir du tube neural dans une population presque pur (figure 3a). Parfois, moins de cultures idéales ne cédera pas excroissances solides. Par exemple, il est possible que, après 24 heures til aura du tube neural recroquevillé sur lui-même et le NC ne sera pas migrer loin du tube neural (figure 3b). Parfois, le tube neural ne se fixe pas sur les plaques recouvertes de fibronectine.
Dans notre expérience, sous-optimale de migration NC ou des problèmes de fixation du tube neural peuvent être altérés par les conditions de normoxie ou de la concentration de la fibronectine, respectivement. L'activité enzymatique de la collagénase / dispase varie légèrement selon le lot et le temps de digestion doivent être ajustés de manière appropriée, cependant, ne digèrent pas le tissu de plus de quinze minutes. Overdigestion du tube neural contenant des tissus dans la collagénase / dispase se traduira également par des excroissances déficientes. Si le tissu somite ne s'enlève pas facilement à partir du tube neural après incubation dans la collagénase / dispase, le tube neural peuvent être incubés pendant plus de dix minutes. Parfois, le tube neural ne se fixe pas sur le substrat. Si tel est le cas, vérifiez l'fibronecconcentration en étain et les conditions de l'hypoxie.
Bien que les conditions normoxiques peut être utilisé pour la culture de type sauvage NC, des conditions hypoxiques imiter de plus près l'environnement in vivo 29,30. Dans notre expérience, des conditions hypoxiques est devenue critique lorsque la culture mutant NC. Par exemple, lorsque Foxd3 mutant NC ont été cultivées dans des conditions normoxiques, le tronc NC eu une excroissance de cellules fortement réduite par rapport aux contrôles. Cette disparité dans la taille excroissance a été supprimée lorsque les explants étaient cultivés dans des conditions hypoxiques (Figure 4). En outre, lorsque de type sauvage explants du tube neural ont été cultivées en normoxie, le nombre de cellules positives pour la caspase-était plus grande alors que des explants cultivés en hypoxie similaires (données non présentées). En maintenant toute la culture NC en hypoxie, les comparaisons ne peuvent plus facilement être faite entre la dynamique de contrôle et les cultures mutantes.
Figure 2. Retrait par étapes du tube neural de l'explant. Le tube neural doit être retirée après 24-48 heures pour éviter la contamination avec les non-NC cellules. A) Notez la frontière entre le tube neural et l'excroissance NC (ligne continue). B) coupés le long du bord du tube neural avec une aiguille d'insuline. C) Jeter le tube neural et de remplacer à moyen avec un milieu auto renouvelée. La ligne pointillée indique l'étendue de l'excroissance. Abréviation: NT, le tube neural.
Figure 3. Exemples de résultats représentatifs. A) excroissance explant typique après 24 heures d'incubation dans un milieu auto-renouvellement dans des conditions hypoxiques (ligne en pointillés indique l'étendue de l'excroissance). B) Vue agrandie d'excroissance NC après 48 heures de culture. C) la culture idéale, avec un rendement moins excroissance faible. A et C ont été cultivées dans les mêmes conditions. Images de démontrer l'aire de répartition naturelle de la robustesse de la culture. Ce peut être affectée par l'efficacité de l'isolement du tube neural, la concentration du FN, des conditions hypoxiques, et l'heure dans la collagénase / dispase digestions.
Figure 4. Dans les analyses in vitro de cultures d'explants NF en normoxie par rapport hypoxie. De contrôle (type sauvage), les cellules ont migré à partir d'explants NC du tube neural après 48 heures dans des conditions de culture normoxiques. En revanche, Foxd3 mutantNC avaient fortement réduit les excroissances cellulaires dans des conditions de normoxie (bords rouges marquent les contours des excroissances NC). Lorsque des explants comparables ont été cultivées dans des conditions hypoxiques, Foxd3 mutantes explants NC a augmenté comparativement à des contrôles, ce qui permet des analyses ultérieures. Remarque, ce comportement est bien corrélée avec le comportement de Foxd3 mutant NC in vivo.
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Discussion
Une attention particulière devrait être accordée à l'étape du développement de l'embryon afin d'assurer le succès de cette approche. Compter somites d'embryons de souris au début est essentiel à la fois pour la phase correspondant embryons à l'intérieur d'une portée et de déterminer les régions correctes de tube neural pour l'isolement. Une variation de un ou deux somites entre les embryons se situe dans une fourchette raisonnable du calendrier de développement, en fonction de la résolution de l'expérience menée. Un embryon entre 9 et 9,5 dpc aura entre 17 et 25 somites. Si l'embryon possède plus de 25 somites, le NC est plus avancé dans le temps de développement, et des excroissances NC sera moins robuste dans la culture. Mise en scène d'embryons en fonction du nombre somite facilite la précision dans les expériences où le stade de développement de l'embryon, et donc NC, peuvent influencer le résultat des expériences. Dans un embryon 9,5 jpc, le NC vagal migre du tube neural dorsal dans définies antéro-postérieures des limites: à partir de la placode otique à la mi-somite 7.De même, le tronc NC migre du tube neural au niveau des somites 8 à somite 24. Pour isoler des populations distinctes de progéniteurs NC tels que décrits dans le présent protocole, discrète sous-régions au sein de chacun de ces domaines sont isolés. La région du tube neural utilisé varie en fonction de la conception de l'expérience et de la région antéro-postérieure de la NC à l'étude.
Les conditions de culture décrites ci-dessus, y compris le milieu et les conditions d'incubation, sont particulièrement adaptés pour la culture de NC murin. Similaire à moyen SR a d'abord été utilisé pour la culture de rat NC 11. Dans nos mains, ce milieu de rat, avec l'ajout de moyen Neurobasal, produit une excroissance solide de progéniteurs murins NC. En outre, contrairement aux précédentes travail en culture de cellules aviaires NC, une couche nourricière n'est pas nécessaire pour la culture de la NC mammifères en utilisant cette méthode 11,13,21,22. Bien qu'il existe de nombreux protocoles précisant la culture NC aviaire et de mammifères dans normoxique conditi ons 9,22, nous 23 (Figure 4), ainsi que d'autres dans le domaine de 20, ont constaté que la culture de cellules murines NC dans des conditions hypoxiques, comme décrit ici la survie grandement aides et d'auto-renouvellement, sans doute parce que l'hypoxie plus étroitement imite les niveaux d'oxygène physiologiques dans l'embryon 20,29,30.
Évaluation de l'expression de marqueurs moléculaires facilite grandement l'identification des cellules NC et leurs dérivés différenciés. Il s'agit notamment de l'expression de Foxd3, p75, et SOX10 pour les cellules souches NC. Les marqueurs de différenciation NC comprennent muscle lisse alpha actine (SMA) pour les myofibroblastes, protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) pour la glie, microphtalmie associée à des facteurs de transcription (MITF) pour les mélanocytes, et de bêta-tubuline III, protein gene product 9,5 (PGP9.5 ), et pour périphérine neurones. Ces marqueurs peuvent être utilisés pour déterminer l'efficacité de l'explant et la différenciation des progéniteurs NC.
contenu "> Une fois que cette technique est maîtrisée, cultivée NC peut être utilisé dans une variété de tests, y compris la quantification de la prolifération, la mort cellulaire, la dynamique des migrations, et / ou la différenciation de statut. NC peut aussi être cultivée par clonage d'enquêter sur l'auto-renouvellement ou de multipotence individuels progéniteurs NC 23. Après le tube neural est retiré des cultures, dissocier les cellules NC dans 100 pi de trypsine-EDTA (0,25%) pendant exactement 5 minutes à 37 ° C. On y prend goût de trypsine-EDTA en milieu de lavage en excès (8-10 ml) en ajoutant 800 ul par puits et le transfert aux différents tubes de 15 ml contenant du milieu de lavage. doucement centrifuger les cellules à 150 xg pendant 3 minutes, retirez la cellule surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml SR moyennes. cellules de comptage à l'aide d'un hémocytomètre et la plaque eux à une densité de 25 cellules / cm 2. Ces colonies peuvent être des passages en série de test d'auto-renouvellement. Pour multipotence dosage, de maintenir les cellules à une densité clonale NC en milieu SR pour 6 jours et ensuite passer à la différenciationmoyenne (10 ng / ml de bFGF et 1% d'extrait d'embryon de poulet). Culture des cellules dans un milieu de différenciation en vertu de l'hypoxie pendant 8 jours avant d'analyser la composition colonie avec des marqueurs moléculaires comme ci-dessus 11.En conclusion, cette méthode pour isoler des cellules d'embryons de souris NC produit une alimentation de la culture libre adhérente de cellules NC prémigratoire sans l'utilisation de la FACS. L'analyse des expériences en utilisant ces cellules peuvent être facilement quantifiés. Bien que cette technique est simple, ses applications pour l'étude des caractéristiques de la migration NC, l'auto-renouvellement et la différenciation sont vastes. En outre, isoler NC à partir d'embryons de souris génétiquement modifiées permet l'étude directe des gènes particuliers et des voies dans le contexte de la migration NC, la survie et / ou la différenciation.
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Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Marc Wozniak pour l'assistance vidéo. Nous tenons également à remercier Sean Morrison à l'UT Southwestern pour le protocole original de culture de cellules de rat NC. Ce travail a été soutenu Vanderbilt University Medical Center Programme de soutien académique et par des subventions du NIH (HD36720 et HD036720-11S109) et le 11GRNT7690040 AHA pour PAL, bourses doctorales de l'AHA (0615209B) et le NIH (NS065604) à NAM, et l'ERP a été soutenu par une subvention des NIH de formation T32HD007502.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (low glucose) | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912-10G | |
| dPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots |
| Fibronectin | GIBCO, by Life Technologies | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | D-5637 | |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche Group | 269 638 | Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots. |
| Insulin needles (29 ½ gage) | BD Biosciences | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. |
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