Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine

doi: 10.3791/4134 Published: June 2, 2012

Summary

הבידוד של הרכס העצבי העובר מן הצינור העצבי מאפשרת את השימוש

Abstract

עובריים עצביים לפסגה (NC) היא האוכלוסייה אבי multipotent שמקורו ב היבט הגב של הצינור העצבי, עובר אפיתל המעבר mesenchymal (EMT) ו נודד ברחבי העובר, והוליד סוגי תאים שונים 1-3. NC גם יש את היכולת הייחודית להשפיע על התמיינות והתבגרות של אברי המטרה 4-6. כאשר explanted במבחנה, אבות צפון קרוליינה לעבור עצמית והתחדשות, להעביר להתמיין למגוון של סוגי רקמות כולל נוירונים, גליה, תאים שריר חלק, סחוס ועצמות.

Multipotency NC תוארה לראשונה מ explants של הצינור העצבי העופות 7-9. בבידוד מבחנה של תאים צפון קרוליינה מאפשר לימוד NC Dynamics כולל התפשטות, הגירה, ו multipotency. עבודה נוספת במערכות העופות ואת העכברים הראו כי explanted תאים צפון קרוליינה NC לשמור על הפוטנציאל שלהם כאשר מושתלים בחזרה העובר 10-13. בגלל מאפיינים אלה הסלולר הטמונות נשמרים explanted אבות צפון קרוליינה, assay עצבית explant הצינור מספק אופציה אטרקטיבית ללימוד NC במבחנה.

כדי להשיג הבנה טובה יותר של NC יונקים, שיטות רבות הועסק לבודד אוכלוסיות NC. NC-derived אבות יכול להיות מתורבת מתוך הפוסט נודדות למקומות בעובר וגם למבוגרים ללמוד את הדינמיקה של פוסט נודדות אבות צפון קרוליינה 11,14-20 עם זאת הבידוד של אבות צפון קרוליינה כפי שהם להגר הצינור העצבי מספק שימור מיטבי של NC תא הפוטנציאל ומאפיינים נודדות 13,21,22. פרוטוקולים מסוימים להעסיק תא הקרינה מיון מופעל (FACS) כדי לבודד את האוכלוסייה NC מועשר עבור אבות מסוימים 11,13,14,17. עם זאת, כאשר החל עוברים בשלבים מוקדמים, מספרים סלולריים הולמים עבור ניתוחים קשה להשיג עם FACS, שמסבך את בידודה של צפון קרוליינה מוקדם populatioNS מעוברים בודדים. כאן, נתאר גישה זו אינה מסתמכת על FACS ותוצאות ב האוכלוסייה כ 96% טהור NC על פי כתב Wnt1-Cre שושלת הופעל 23.

השיטה המוצגת כאן הוא עיבוד פרוטוקולים מותאם לתרבות של עכברוש NC 11,13. יתרונותיה של פרוטוקול זה לעומת שיטות קודמות הן כי 1) התאים לא גדלים על שכבה מזין, 2) FACS לא נדרש לקבל האוכלוסייה טהור יחסית NC, ​​3) premigratory תאים צפון קרוליינה מבודדות 4) התוצאות בקלות לכמת. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול לשמש הבידוד של צפון קרוליינה מהמודל כל עכבר מוטנטי, להקל על מחקר של מאפיינים צפון קרוליינה עם מניפולציות גנטיות שונות. הגבלה של גישה זו היא כי NC מוסר בהקשר של העובר, אשר ידוע להשפיע, הישרדות הגירה והבחנה של NC 2,24-28.

Protocol

1. הכנת פלטות

  1. השתמש בטכניקה סטרילית בכל עת.
  2. הכן fibronectin (FN) על ידי דילול 100 μL מלאי אדם FN פלזמה לתוך נפח סופי של 3.3 מ"ל ב PBS Dulbecco של (dPBS). הריכוז הסופי הוא 30 מיקרוגרם / מ"ל ​​וזה יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע 1.
  3. מכסים תחתית של כל אחד בצלחת סטרילית התרבות 4 רקמות היטב עם פתרון FN ולתת לשבת במשך 15 דקות. ודא את כל פני השטח מכוסה. הפוך את התקשורת במהלך תקופה זו (שלבים 2 ו -3).
  4. הסר לחוץ Fn פתרון ולאפשר צלחות לייבוש. בעדינות ולשטוף בארות עם 500 DMEM μL, הסר DMEM, ולהוסיף 500 μL של התחדשות עצמית (SR) בינוני (ראו להלן). דגירה על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified המכילה 5 אחוז CO 2. להשלים כשעה לפני החיתוך כך הצלחות יהיה יבש לפני השימוש.

2. הכנת בינוני SR

  1. לתרבות של NC מחנק והגומתוך עשרה עוברי (כ 1 המלטה, בהתאם לרקע הגנטי של הקו העכבר), להכין 25 מ"ל של מדיום SR. שלב 12.5 מ"ל גלוקוז נמוכה DMEM, 7.5 מ"ל Neurobasal בינוני, 25 חומצה retinoic μL (117 מיקרומטר הריכוז הסופי), ו 25 μL 2-mercaptoethanol (50 mM הריכוז הסופי). מערבבים היטב.
  2. הוסף צ'יק 3.75 מ"ל תמצית העובר, 250 μL N 2 תוספת מלח, 500 μL תוסף B27 ו 250 μL פניצילין, סטרפטומיצין (הריכוז הסופי 1%). סינון בינונית דרך פילטר 0.22 מיקרומטר.
  3. הוסף 10 IGF1 סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ריכוז סופי) ו - 20 bFGF סטרילית μL (20 מיקרוגרם / מ"ל ​​בריכוז הסופי). מערבבים על ידי היפוך. לאחסן ב 4 ° C.

3. הכנת בינוני Wash

  1. במשך כ 10 עוברים להכין 50 מ"ל של מדיום שטיפה. שלב 50 מ"ג BSA עם 35 מ"ל גלוקוז DMEM נמוך, בינוני 15 מ"ל Neurobasal, ו 500 μL פניצילין, סטרפטומיצין (1% ריכוז סופי). מסנן סטריליים עם 0.22מיקרומטר הסינון.

4. הכנת collagenase / dispase

  1. הוסף 50 μL של 100 מ"ג / מ"ל ​​collagenase / dispase עד 5 dPBS מ"ל. מערבבים היטב.
  2. מזרק מסנן עם 0.2 מיקרומטר לסנן ולהוסיף 1.5 מ"ל לתוך כל אחת משלוש הבארות של צלחת 12 באר. פיפטה כ 1 מ"ל בינוני לשטוף את הבארות הנותרות. אחסן את כל הצלחת על הקרח עד מוכנים לעכל את הרקמה גזור.
  3. גזור קצות קצה פיפטה P20 ו p1000 מסנן בסכין גילוח סטרילית. גזור מתחת הקצה המחודד של קצה. לחתוך את p1000 ישמש להעביר את העובר כולו תוך P20 ישמש להעברת פיסות רקמה מבודדת.

5. בידוד מחנק צינור Trunk עצבית מ 9.5 עוברים DPC

  1. עבור הריונות זמן קבועים, סכרים עם תקע הנרתיק נחשבים 0.5 DPC בצהריים בבוקר תקע הוא ציין. להקריב את ולהסיר את הרחם ב 9.5 DPC.
  2. הסר את decidua מהרחם בעדינות Remove העובר מן decidua. חוויתי פעם אחת עם פרוטוקול זה, לבודד 3-4 9.5 עוברים DPC בכל פעם dPBS סטריליים. השתמש בטכניקה סטרילית ומכשירים הנתיחה מעוקרות. מכשירים ניתן לעקר על ידי עיקור, מעוקר חום או דגירה של אתנול.
  3. עבור הקדמי מחנק NC: באמצעות מחטים אינסולין, לחתוך את הצינור העצבי על placode otic באמצע. חותכים שוב בקצה האחורי של somite 4 ה. חתוך הרקמה הגחון כדי הצינור העצבי להסיר את הקשתות הגרון והלב.
  4. עבור NC הגזע: באמצעות מחטים אינסולין, להסיר את החלק של הצינור העצבי בין somites 16-22 (או somite האחרון אם הם עוברים שלב התפתחותי מוקדם יותר מאשר 22 somite).
  5. שמור את שק החלמון וכל רקמה עוברית הנותרים עבור genotyping.

6. הסרת האאקטודרם ללא עצבית והמזודרם

  1. מניחים בצינור העצבי המכיל קטעים לתוך collagenase / dispase בטמפרטורת החדר למשך 10 דקותs. מיד לשטוף בינוני לשטוף.
  2. חזור רקמות dPBS סטריליים. שימוש במחטים סטריליות אינסולין, הוצא בעדינות האאקטודרם לא העצבית מרקמת ולהפריד את somites מן הצינור העצבי. החלקים האחרונים של והמזודרם מרקמות somite ניתן להסיר על ידי triturating בעדינות באמצעות חתך למטה P20 עצה. להיזהר לא לפגוע בצינור העצבי. להתבונן מקרוב במהלך טחינה דקה.
  3. מניחים את הצינור העצבי מבודד באמצעות שטיפה 2 ו 3 2 30 בינוני לשטוף.
  4. לשטוף פעם בינוני SR, ומקום בצינור העצבי מבודד למרכז גם FN מצופה שהוכנה קודם לכן (שלב 1.3). ללחלח את החדר היפוקסיה עם צלחת של מים סטריליים. מניחים את הצלחת לתוך תא היפוקסיה ולשטוף את החדר בגז מעורבת על 3% O 2 (להשתמש במיכל המכיל תערובת של 1% מ 2, 6% CO 2, 93% N 2).
  5. תמיד להתמודד עם הקאמרית מאוד בזהירות כדי להבטיח thaexplants T הם באין מפריע ולהישאר במרכז וולס.
  6. דגירה על 37 ° C. סיכום של צעדים 5-6 מוצג באיור 1.

7. הסרת בצינור העצבי

  1. לאחר 24 שעות של דגירה, הסר בצינור העצבי על ידי בעדינות מתגרה קצה הצינור העצבי מן התאים הנודדות באמצעות מחט סטרילית אינסולין. הסר וזורקים בצינור העצבי ממדיום באמצעות חתך P20 סטרילית כמו בשלב 6.2 ולהחליף בינוני עם בינוני SR טרי (איור 2). הדבר נעשה בקלות באמצעות מיקרוסקופ הפוכה.

8. נציג תוצאות

לאחר 24 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס בתנאי חוסר חמצן, תאים צפון קרוליינה היגרו מן הצינור העצבי באוכלוסייה טהור כמעט (איור 3 א). לפעמים, פחות תרבויות אידיאליים לא תניב בצמחים חזקים. לדוגמה, ייתכן כי לאחר 24 שעות לאהוא בצינור העצבי יהיה מכורבל על עצמה ו NC לא יעברו מן הצינור העצבי (איור 3 ב). מדי פעם בצינור העצבי לא יצרף את הצלחות מצופה fibronectin.

מניסיוננו, תת אופטימלית הגירה NC או בעיות עם החיבור של הצינור העצבי יכול להיות מושפע לרעה בתנאי normoxia או ריכוז של fibronectin, בהתאמה. הפעילות האנזימטית של collagenase / dispase משתנה מעט על ידי אצווה זמן עיכול חייב להיות מותאם כראוי, לעומת זאת, לא לעכל את הרקמה יותר מרבע שעה. Overdigestion של הצינור העצבי המכיל רקמות collagenase / dispase תגרור בצמחים לקויה. אם הרקמה somite לא יוסר בקלות לאחר דגירה של collagenase / dispase של הצינור העצבי, הצינור העצבי ניתן מודגרות למשך זמן ארוך יותר מעשר דקות. לפעמים בצינור העצבי לא לצרף המצע. אם זה המקרה, בדוק fibronecפח ריכוז ותנאי חוסר חמצן.

למרות התנאים normoxic ניתן wild-type תרבות NC, תנאי חוסר חמצן לחקות באופן הדוק יותר בסביבה vivo 29,30. מניסיוננו, בתנאי חוסר חמצן הפכה קריטית כאשר culturing מוטציה NC. לדוגמה, כאשר Foxd3 מוטציה NC היו בתרבית בתנאים normoxic, היה המטען NC תוצאה תא הקטינה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצת הביקורת. פער זה בגודל תוצאה הוסר כאשר explants היו בתרבית בתנאי חוסר חמצן (איור 4). יתר על כן, כאשר wild-type explants בצינור העצבי היה מתורבת normoxia, מספר caspase-חיוביים בתאים היה גדול יותר מזה של explants דומים בתרבית היפוקסיה (מידע לא מוצג). על ידי שמירה על כל התרבות NC ב היפוקסיה, השוואות יכולים יותר בקלות בין הדינמיקה של שליטה ותרבויות מוטציה.

איור 1
> באיור 1. סכמטית כוללת של בידוד NC. א) לנתח אזורים של עניין מן העובר. ב) לקט בצינור העצבי של collagenase / dispase עשר דקות (לא יעלה על רבע שעה). ג) לשטוף בינוני לשטוף. D) לנתח משם האאקטודרם לא עצבית והמזודרם. EF) לשטוף פעמיים בינוני לשטוף. ז) צלחת בינונית התחדשות עצמית. דגירה על 37 מעלות צלזיוס ב 3% O 2 בתנאי חוסר חמצן.

איור 2
איור 2. הסרת בשלבים של הצינור העצבי מן explant. הצינור העצבי יש להסיר לאחר 24-48 שעות על מנת למנוע זיהום עם לא-NC תאים. א) הודעה הגבול בין הצינור העצבי ואת תולדה NC (קו מוצק). ב) גזור לאורך הקצה של הצינור העצבי עם מחט האינסולין. ג) מחק בצינור העצבי ולהחליף בינוני עם בינוני עצמית חדשה והתחדשות. קו מקווקו מציין היקף תוצאה. קיצור: NT, בצינור העצבי.

> איור 3
איור 3. דוגמאות מייצגות תוצאות. א) תוצאה explant בדרך כלל אחרי 24 שעות הדגירה במדיום התחדשות עצמית בתנאי חוסר חמצן (קו מקווקו מציין היקף תוצאה). ב) יתגדל לאור תוצאה NC לאחר 48 שעות בתרבית. ג) תרבות אידיאלי פחות עם תשואה תוצאה נמוכה. A ו-C היו בתרבית בתנאים זהים. תמונות להדגים את טווח טבעי חוסן התרבות. זה יכול להיות מושפע יעילות הבידוד בצינור העצבי, ריכוז של FN, תנאי חוסר חמצן, ולאחר זמן collagenase / dispase digestions.

איור 4
איור 4. בניתוח חוץ גופית של תרבויות צפון קרוליינה explant ב normoxia לעומת היפוקסיה. בקרה (סוג בטבע) צפון קרוליינה התאים נדדו מן explants בצינור העצבי לאחר 48 שעות בתנאים תרבות normoxic. לעומת זאת, מוטציה Foxd3NC לא פחותה בהרבה בצמחים תא normoxia (סימן אדום לרמות שולי בצמחים NC). כאשר explants דומים גדלו בתנאי חוסר חמצן, Foxd3 מוטציה explants צפון קרוליינה גברה comparably לבקרות, המאפשר ניתוח שלאחר מכן. שימו לב, התנהגות זו קשורה גם עם התנהגות של Foxd3 מוטציה NC in vivo.

Discussion

תשומת לב מיוחדת צריכה להינתן בשלב ההתפתחותי של העובר על מנת להבטיח את ההצלחה של גישה זו. ספירת somites של עוברי עכברים מוקדם הוא קריטי גם לשלב התאמת עוברים בתוך פסולת וקביעת אזורים הנכונות של הצינור העצבי של בידוד. וריאציה של אחד או שניים somites בין העוברים נמצא בטווח סביר של עיתוי התפתחותי, תלוי ברזולוציה של הניסוי שנערך. העובר בין 9 ל 9.5 DPC תהיה בין 17 ו -25 somites. אם לעובר יש יותר מ -25 somites, צפון קרוליינה היא מתקדמת עוד יותר בזמן התפתחותית, ואת בצמחים צפון קרוליינה יהיה פחות חזק בתרבות. קביעת עוברים מבוסס על מספר somite מאפשר דיוק בניסויים כאשר בשלב ההתפתחותי של העובר, ולכן NC, יכול להשפיע על תוצאות הניסויים. בעובר DPC 9.5, NC מחנק נודד מן הצינור העצבי הגבי ב-anterior האחוריים גבולות מוגדרים: מ placode באמצע otic כדי somite 7.באופן דומה, תא המטען NC נודד מן הצינור העצבי ברמות somite 8 עד 24 somite. לבודד אוכלוסיות נפרדות של אבות צפון קרוליינה כמתואר בפרוטוקול זה, דיסקרטית תתי אזורים בתוך כל אחד התחומים האלה מבודדים. באזור של הצינור העצבי המשמש משתנה מבוססת על עיצוב של הניסוי ובאזור הקדמי, האחורי של NC הנלמד.

התנאים תרבות שתוארו לעיל, לרבות אמצעי ותנאי הדגירה, מותאמים במיוחד עבור תרבות של NC murine. דומה בינוני SR שימש לראשונה לתרבות של עכברוש NC 11. בידיים שלנו, זה בינוני חולדה, עם תוספת של Neurobasal בינונית, מייצרת תוצאה החזקה של Murine אבות NC. יתר על כן, שלא כמו הקודמים culturing עבודה תאים העופות NC, שכבת מזין מיותר לתרבות של NC יונקים בשיטה זו 11,13,21,22. אמנם יש פרוטוקולים רבים המפרטים תרבות NC גם העופות וגם היונקים ב normoxic conditi תוספות 9,22, אנחנו 23 (איור 4), יחד עם אחרים בתחום 20, מצאו כי Murine culturing תאים צפון קרוליינה בתנאי חוסר חמצן שתוארו כאן הישרדות עזרי מאוד עצמית והתחדשות, יש להניח כי היפוקסיה יותר מקרוב מחקה רמות החמצן פיזיולוגיים בתוך העובר 20,29,30.

הערכת ביטוי של סמנים מולקולריים מאוד מקל על זיהוי תאים צפון קרוליינה נגזרות הבדיל שלהם. אלה כוללים ביטוי Foxd3, p75, ו Sox10 בתאי גזע צפון קרוליינה. סמנים של NC הבדיל כוללים חלק השריר אלפא אקטין (SMA) עבור myofibroblasts, חלבון גליה fibrillary חומצי (GFAP) עבור, גליה microphthalmia הקשורים גורם שעתוק (MITF) עבור מלנוציטים, ו-III בטא טובולין, הגן חלבון המוצר 9.5 (PGP9.5 ), ו peripherin על הנוירונים. סמנים אלה יכולים לשמש כדי לקבוע את היעילות explant והבחנה של אבות NC.

תוכן "> פעם בטכניקה זו נעשה במיומנות, NC תרבותי ניתן להשתמש במגוון רחב של מבחני כולל כימות של שגשוג, מוות של תאים, הגירה Dynamics, ו / או בידול המצב. NC יכול להיות גם תרבותי clonally לחקור עצמית חידוש או multipotency של בודדים אבות צפון קרוליינה 23. לאחר הצינור העצבי יוסר התרבויות, לנתק את התאים צפון קרוליינה ב 100 μl טריפסין-EDTA (0.25%) עבור בדיוק 5 דקות על 37 ° C. דובדבני טריפסין-EDTA בינוני לשטוף עודף (8-10 MLS) על ידי הוספת 800 μl לכל גם והעברת ל -15 צינורות בודדים מ"ל המכילים בינוני לשטוף. בעדינות סרכזת תאים ב XG 150 במשך 3 דקות, להסיר תאים גלולה supernatant ו resuspend במדיום 1 SR מ"ל. ספירת תאים באמצעות hemocytometer וצלחת אותם צפיפות של 25 תאים / 2 ס"מ. מושבות אלה ניתן passaged סדרתי כדי assay עצמית והתחדשות. כדי multipotency assay, לשמור על התאים צפון קרוליינה על צפיפות משובט במדיום SR עבור 6 ימים ולאחר מכן לעבור התמיינותבינונית (10 ng / mL bFGF ו 1% העובר תמצית חומוס). התרבות התאים בינוני בידול תחת היפוקסיה במשך 8 ימים לפני ניתוח הרכב מושבת עם סמנים מולקולריים כנ"ל 11.

לסיכום, זו שיטה לבודד תאים מעוברים צפון קרוליינה עכבר מייצר תרבות חופשית מזין חסיד של premigratory תאים צפון קרוליינה ללא שימוש FACS. ניתוח של ניסויים באמצעות תאים אלה ניתן בקלות לכמת. אמנם שיטה זו היא פשוטה, היישומים שלה עבור המחקר של תכונות של צפון קרוליינה, הגירה בידול עצמי התחדשות, הם עצום. יתר על כן, בידוד NC מ עוברי עכברים מהונדסים גנטית מאפשר לימוד ישיר של גנים ושבילים מסוימים בהקשר של NC הגירה, הישרדות, ו / או בידול.

Disclosures

אין לנו מה למסור.

Acknowledgments

ברצוננו להודות מארק ווזניאק לסיוע וידאו. אנו רוצים גם להודות שון מוריסון ב UT Southwestern בפרוטוקול המקורי של עכברים לתאים culturing NC. עבודה זו נתמכה הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט מרכז התמיכה של תוכנית אקדמית על ידי תרומות של NIH (HD36720 HD036720 ו-11S109) ו 11GRNT7690040 AHA ל PAL, מלגות predoctoral של AHA (0615209B) ו-NIH (NS065604) לווייטנאם, היה ה-ERP נתמך על ידי מתן הכשרה NIH T32HD007502.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM (low glucose) GIBCO, by Life Technologies 11885
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103
BSA Sigma-Aldrich A3912-10G
dPBS GIBCO, by Life Technologies 14190-144
IGF1 BD Biosciences 354037 Store in 50 μg/mL aliquots
bFGF BD Biosciences 354060 Store in 25 μg/mL aliquots
Fibronectin GIBCO, by Life Technologies 33016-015 Stored in 1mg/mL aliquots
Retinoic Acid Sigma-Aldrich R2625 Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots
2-mercapt–thanol Sigma-Aldrich D-5637
N2 supplement GIBCO, by Life Technologies 17502-048
B27 supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
Steriflip 0.22 μm filters EMD Millipore SCGP00525
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140122
0.20 μm filters Corning 431219
Syringes (for filtration) BD Biosciences 301604
Four well plates Thermo Fisher Scientific, Inc. 176740
Collagenase/Dispase Roche Group 269 638 Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots.
Insulin needles (29 ½ gage) BD Biosciences 309306
Hypoxia Chamber Billups-Rothenberg, Inc.
Oxygen Analyzer Billups-Rothenberg, Inc.
Forceps #5 Fine Science Tools For removing uterus and decidua.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
  2. Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
  3. Saint-Jeannet, J. -P. Neural crest induction and differentiation. Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).
  4. Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
  5. Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
  6. Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
  7. Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
  8. Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
  9. Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
  10. White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
  11. Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
  12. Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
  13. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  14. Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
  15. Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
  16. Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
  17. Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
  18. Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. 126-3781 (1999).
  19. Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
  20. Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
  21. Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
  22. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
  23. Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
  24. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
  25. Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
  26. Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
  27. Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
  28. Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
  29. Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
  30. Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).
בידוד והתרבות של תאים עצביים לפסגה מהצינור עובריים עצבית Murine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).More

Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube. J. Vis. Exp. (64), e4134, doi:10.3791/4134 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter