Summary
Isolering av embryonale neural crest fra nevralrøret forenkler bruken av
Abstract
Den embryonale neural crest (NC) er en multipotent stamfar befolkning som stammer ved dorsal del av nevralrøret, gjennomgår en epitelial til mesenchymale overgang (EMT) og vandrer hele embryoet, som gir opphav til ulike celletyper 1-3. NC har også en unik evne til å påvirke differensiering og modning av målorganer 4-6. Når eksplantert in vitro, NC stamfedre gjennomgå selvfornyelse, vandrer og skille ut en rekke vevstyper inkludert nerveceller og gliaceller, glatte muskelceller, brusk og bein.
NC multipotency ble først beskrevet fra explants av luftfarten nevralrøret 7-9. In vitro isolering av NC celler letter studiet av NC dynamikk, inkludert spredning, migrasjon, og multipotency. Videre arbeid i luftfarten og rotte systemer vist at eksplanterte NC cellene beholder sin NC potensial når transplantert tilbake til fosteret 10-13. Fordi disse iboende cellulære egenskapene er bevart i eksplanterte NC stamfedre, gir nevralrøret eksplantering analysen et attraktivt alternativ for å studere NC in vitro.
For å oppnå en bedre forståelse av pattedyr NC har mange metoder blitt ansatt for å isolere NC populasjoner. NC-deriverte stamfedre kan dyrkes fra post-trekkende steder i både embryo og voksne til å studere dynamikken i post-trekkende NC stamfedre 11,14-20 imidlertid isolering av NC stamfedre som de emigrere fra nevralrøret gir optimal bevaring av NC celle potensiale og trekkende egenskaper 13,21,22. Enkelte protokoller benytter fluorescens aktivert celle sortering (FACS) å isolere en NC befolkning beriket for bestemte stamfedre 11,13,14,17. Men når du starter med tidlig stadium embryoer, celle tall tilstrekkelige for analyser er vanskelig å få med FACS, kompliserer isolering av tidlig NC populations fra individuelle embryo. Her beskriver vi en tilnærming som ikke er avhengig FACS og resultater i en ca 96% ren NC befolkningen basert på en Wnt1-Cre aktivert avstamning reporter 23.
Metoden som presenteres her er tilpasset fra protokoller optimalisert for kulturen i rotte NC 11,13. Fordelene med denne protokollen i forhold til tidligere metoder er at 1) cellene ikke er dyrket på en mater lag, 2) FACS er ikke påkrevd for å oppnå en relativt ren NC befolkning, 3) premigratory NC cellene er isolert og 4) resultatene er lett kvantifisert. Videre kan denne protokollen brukes til isolering av NC fra noen mutant mus modell, tilrettelegge studiet av NC egenskaper med ulike genetiske manipulasjoner. Begrensningen av denne tilnærmingen er at NC er fjernet fra rammen av embryo, som er kjent for å påvirke overlevelse, migrasjon og differensiering av NC 2,24-28.
Protocol
1. Forbereder Plater
- Bruk steril teknikk til alle tider.
- Forbered fibronectin (FN) ved å fortynne 100 mL av humant plasma FN lager til en endelig volum på 3,3 ml i Dulbecco sin PBS (dPBS). Endelig konsentrasjon er 30 mikrogram / ml og dette kan lagres ved 4 ° C i 1 uke.
- Dekk bunnen av hver brønn av en steril vevskultur fire godt plate med FN-løsning og la sitte i 15 minutter. Sørg for at hele overflaten er dekket. Gjør media i løpet av denne tiden (trinn 2 og 3).
- Fjern Fn løsning og la platene tørke. Skyll forsiktig brønner med 500 mL DMEM, fjern DMEM, og legge til 500 mL av selvfornyelse (SR) medium (se nedenfor). Inkuber ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5 prosent CO 2. Fullfør dette omtrent en time før disseksjon slik at platene vil være tørr før bruk.
2. Forbereder SR Medium
- For kulturen i vagal og bagasjerommet NCfra ti embryoer (ca ett kull, avhengig av genetisk bakgrunn av musen linje), forberede 25 mL SR medium. Kombiner 12,5 ml lavt glukose DMEM, 7,5 mL Neurobasal Medium, 25 mL retinsyre (117 mM endelig konsentrasjon), og 25 mL 2-mercaptoethanol (50 mM endelig konsentrasjon). Bland godt.
- Legg 3.75 mL Chick Embryo Extract, 250 mL N 2 salt supplement, 500 mL B27 supplement og 250 mL penicillin-streptomycin (1% endelig konsentrasjon). Filtrer mediet gjennom en 0,22 mikrometer filter.
- Tilsett 10 mL sterilt IGF1 (20 mikrogram / ml endelig konsentrasjon) og 20 mL sterilt bFGF (20 mikrogram / ml endelig konsentrasjon). Bland ved å snu. Oppbevares ved 4 ° C.
3. Forbereder Wash Medium
- For ca 10 embryo forberede 50 mL vask medium. Kombiner 50 mg BSA med 35 ml lavt glukose DMEM, 15 ml Neurobasal Medium, og 500 mL penicillin-streptomycin (1% endelig konsentrasjon). Sterile filter med en 0,22mikrometer filter.
4. Forbereder collagenase / dispase
- Tilsett 50 mL av 100 mg / ml collagenase / dispase til 5 ml dPBS. Bland godt.
- Sprøyte filter med en 0,2 mikrometer filtrere og legg 1,5 ml i hver av tre brønner på en tolv godt plate. Pipetter ca 1 ml vask medium i de resterende brønnene. Oppbevar hele platen på isen til den er klar til å fordøye dissekert vev.
- Skjær tuppen av en p20 og P1000 pipette filter tips med en steril barberblad. Skjær like nedenfor skrå kanten av tips. Den cut off P1000 vil bli brukt til å overføre hele embryoet, mens P20 vil bli brukt til å overføre deler av isolerte vev.
5. Isolere vagal og Trunk nevralrøret fra 9,5 DPC Embryoer
- For tidsstyrte svangerskap, er dammer med en vaginal plugg vurderes 0,5 DPC ved middagstid morgenen pluggen er observert. Ofre og fjerne livmoren på 9,5 DPC.
- Fjern decidua fra livmoren og forsiktig remove embryo fra decidua. Når opplevde med denne protokollen, isolere 3-4 9,5 DPC embryo på et tidspunkt i sterile dPBS. Bruk steril teknikk og sterilisert disseksjon instrumenter. Instrumenter kan steriliseres ved autoklavering, varme sterilisering eller ved inkubasjon i etanol.
- For anterior vagal NC: bruker insulin nåler, klipp nevralrøret på midten otic placode. Kutt igjen på bakre kanten av 4 th somitt. Trim vev ventral til nevralrøret å fjerne faryngale buer og hjerte.
- For trunk NC: bruker insulin nåler, fjerne den delen av nevralrøret mellom somites 16-22 (eller siste somitt hvis embryoer er utviklingshemmede tidligere enn 22 somitt scenen).
- Hold plommesekken og eventuelle gjenværende embryonale vev for genotyping.
6. Fjerning av ikke-nevral ektoderm og mesoderm
- Plasser nevralrøret inneholder segmenter i collagenase / dispase ved romtemperatur i 10 minutters. Vask straks i vask medium.
- Tilbake vev til sterile dPBS. Bruke sterile nåler insulin, forsiktig fjerne ikke-nevrale ektoderm fra vevet og skille de somites bort fra nevralrøret. De siste gjenværende delene av mesoderm fra somitt vev kan fjernes ved triturating forsiktig med en cut-ned P20 tips. Vær nøye med å ikke skade nevralrøret. Observer dette nøye under trituration.
- Plasser den isolerte nevralrøret gjennom en andre og tredje 30 andre vask av vask medium.
- Vask en gang i SR medium, og plasser den isolerte nevralrøret inn til sentrum av en FN-belagt vel som ble utarbeidet tidligere (Step 1,3). Fuktigere hypoksi kammer med et fat med sterilt vann. Sett fatet i hypoksi kammeret og skyll kammeret med blandet gass til 3% O 2 (bruk en tank som inneholder en blanding av 1% 2 O, 6% CO 2, 93% N 2).
- Håndter alltid kammeret ekstremt nøye for å sikre that explants er uforstyrret og forblir i sentrum av brønnene.
- Inkuber ved 37 ° C. Oppsummering av trinn 5-6 er vist i figur 1.
7. Fjerning av Neural Tube
- Etter 24 timers inkubering, fjerne nevralrøret ved forsiktig erting kanten av nevralrøret unna de vandrende celler ved hjelp av en steril nål insulin. Fjern og kast nevralrøret fra medium ved hjelp av en steril p20 kutt som i trinn 6,2 og erstatte medium med fersk SR medium (figur 2). Dette gjøres enklest ved hjelp av en invertert mikroskop.
8. Representative Resultater
Etter 24 timers inkubering ved 37 ° C i hypoksisk forhold, har NC celler migrert vekk fra nevralrøret i en nesten ren befolkning (figur 3a). Noen ganger vil mindre enn ideelle kulturer ikke gir robuste utvekster. For eksempel er det mulig at etter 24 timer tHan nevralrøret vil ha krøllet opp på seg, og NC skal ikke migrere bort fra nevralrøret (figur 3b). Av og til nevralrøret ikke vil feste til fibronectin belagte plater.
I vår erfaring, kan sub-optimal NC migrasjon eller problemer med feste av nevralrøret bli negativt påvirket av normoksiske forhold eller konsentrasjon av fibronectin, henholdsvis. Enzymatisk aktivitet av collagenase / dispase varierer litt med batch og fordøyelsen tid må justeres riktig, men ikke fordøye vevet lenger enn femten minutter. Overdigestion av nevralrøret inneholder vev i collagenase / dispase vil også resultere i mangel utvekster. Hvis somitt vev ikke fjernes lett fra nevralrøret etter inkubasjon i collagenase / dispase, kan nevralrøret skal inkuberes lenger enn ti minutter. Noen ganger nevralrøret ikke vil feste til underlaget. Hvis dette er tilfelle, dobbeltsjekk at fibronectinn konsentrasjon og hypoksi forhold.
Mens normoksisk forhold kan brukes til kultur villtype NC, hypoksisk forholdene nærmere etterligne in vivo miljøet 29,30. Vår erfaring ble hypoksisk forholdene kritisk da dyrkning mutant NC. For eksempel når Foxd3 mutant NC ble dyrket i normoksisk forhold, hadde trunk NC en sterkt redusert celle utvekst sammenlignet med kontroller. Denne ulikheten i utvekst størrelse ble fjernet da explants ble dyrket i hypoksisk forhold (figur 4). Videre, når vill type nevralrørsdefekter explants ble dyrket i normoksiske, var antallet caspase-positive celler større enn at av lignende explants dyrket i hypoksi (data ikke vist). Ved å opprettholde alle NC kultur i hypoksi, kan sammenligninger lettere gjøres mellom dynamikk kontroll og mutante kulturer.
Figur 2. Trinnvis fjerning av nevralrøret fra eksplantering. Nevralrøret må fjernes etter 24-48 timer for å unngå kontaminasjon med ikke-NC celler. A) Legg merke til grensen mellom nevralrøret og NC utvekst (heltrukket linje). B) Skjær langs kanten av nevralrøret med en insulin nål. C) Kast nevralrøret og erstatte medium med frisk selvtillit fornyelse medium. Stiplet linje angir omfanget av utvekst. Forkortelse: NT, nevralrøret.
Figur 3. Eksempler på representative resultater. A) Typisk eksplantering utvekst etter 24 timers inkubering i selv fornyelse medium i hypoksisk forhold (stiplet linje angir omfanget av utvekst). B) Forstørret visning av NC utvekst etter 48 timer i kultur. C) Mindre ideell kultur med lav utvekst avkastning. A og C ble dyrket under de samme forholdene. Bilder viser den naturlige utvalg i kultur robusthet. Dette kan bli påvirket av effektiviteten av nevralrøret isolasjon, konsentrasjon av FN, hypoksisk forhold, og tid i collagenase / dispase digestions.
Figur 4. In vitro-analyser av NC eksplantering kulturer i normoksiske versus hypoksi. Kontroll (villtype) NC celler migrert fra nevralrørsdefekter explants etter 48 timer i normoksisk kultur forhold. I kontrast, Foxd3 mutantNC hadde sterkt redusert celle utvekster i normoksiske (røde omriss mark kantene på NC utvekster). Når sammenlignbare explants ble dyrket under hypoksisk forhold, vokste Foxd3 mutante NC explants sammenlignbare med kontroller, slik at påfølgende analyser. Obs, denne atferden korrelerte med den oppførselen Foxd3 mutant NC in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nøye oppmerksomhet bør rettes mot utviklingsstadiet av embryo for å sikre suksess for denne tilnærmingen. Telle somites av tidlige mus embryoer er kritisk både for scene matching embryo innenfor et kull og bestemme de riktige delene av nevralrøret for isolasjon. En variant av en eller to somites mellom embryoer er innen rimelig rekkevidde av utviklingsmessige timing, avhengig av oppløsningen av forsøket gjennomført. Et embryo mellom 9 og 9,5 DPC vil ha mellom 17 og 25 somites. Hvis fosteret har mer enn 25 somites, blir NC videre avansert i utviklings tid, og NC utvekster vil bli mindre robust i kulturen. Staging embryoer basert på somitt nummer forenkler presisjon i eksperimenter når utviklingsstadiet av embryoet, og derfor NC, kan påvirke utfallet av eksperimentene. I en 9,5 DPC embryo, vandrer den vagal NC fra dorsal nevralrøret i definerte anterior-posterior grenser: fra midten av otic placode til somitt 7.Tilsvarende vandrer trunk NC fra nevralrøret på nivåer somitt 8 til somitt 24. For å isolere forskjellige populasjoner av NC stamfedre som beskrevet i denne protokollen, er diskret subregioner innenfor hver av disse domenene isolert. Den delen av nevralrøret som brukes vil variere basert på design av eksperimentet og den anterior-posterior regionen av NC som studeres.
De kultur forholdene beskrevet ovenfor, inkludert medium og inkubering forhold, er spesielt tilrettelagt for kultur murine NC. Lignende SR medium ble først brukt til kultur rotte NC 11. I våre hender, produserer denne rotte medium, med tillegg av Neurobasal Medium, en robust utvekst av murine NC stamfedre. Videre i motsetning til tidligere arbeid dyrking avian NC celler, er en mater lag unødvendig for kultur pattedyr NC bruke denne metoden 11,13,21,22. Mens det er mange protokoller detaljering både aviær og pattedyr NC kultur i normoksisk conditi ons 9,22, vi 23 (figur 4), sammen med andre i feltet 20, har funnet ut at dyrking murine NC celler i hypoksisk forhold som beskrevet her sterkt hjelpemidler overlevelse og selvfornyelse, antagelig fordi hypoksi mer etterligner fysiologiske oksygennivå innenfor embryo 20,29,30.
Evaluering av uttrykket av molekylære markører blir enklere identifisering av NC celler og deres differensierte derivater. Disse inkluderer uttrykk for Foxd3, p75, og Sox10 for NC stamceller. Markører for differensiert NC inkludere glatt muskulatur alpha actin (SMA) for myofibroblasts, glial fibrillary surt protein (GFAP) for gliaceller, mikroftalmi-assosiert transkripsjonsfaktor (MITF) for melanocytter, og beta-III tubulin, protein genproduktet 9,5 (PGP9.5 ), og peripherin for nerveceller. Disse markørene kan brukes til å bestemme eksplantering effektivitet og differensiering av NC stamfedre.
innhold "> Når denne teknikken er mestret, kan kultivert NC brukes i en rekke tester, inkludert kvantifisering av spredning, celledød, migrasjon dynamikk, og / eller differensiering status. NC kan også være clonally kultivert å undersøke selvfornyelse eller multipotency av individuelle NC stamfedre 23. Etter nevralrøret blir fjernet fra kulturer, distansere NC cellene i 100 mL Trypsin-EDTA (0,25%) for nøyaktig 5 minutter ved 37 ° C. Avkjøl Trypsin-EDTA i overkant vask medium (8-10 MLS) ved å legge til 800 mL per brønn og overføre til individuelle 15 ml rør som inneholder vask medium. forsiktig sentrifuger cellene ved 150 xg i 3 minutter, fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml SR medium. telle celler ved hjelp av en hemocytometer og plate dem på en tetthet på 25 celler / cm 2. Disse koloniene kan være serielt passaged til analysen selvfornyelse. Til analysen multipotency, vedlikeholde NC cellene ved klonal tetthet i SR medium for 6 dager, og deretter bytte til differensieringmedium (10 ng / ml bFGF og 1% kylling embryo ekstrakt). Kultur cellene i differensiering medium etter hypoksi for 8 dager før analysere koloni komposisjon med molekylære markører som ovenfor 11.I konklusjonen, produserer denne metoden for å isolere NC celler fra mus embryo en mater gratis tilhenger kultur premigratory NC celler uten bruk av FACS. Analyse av eksperimenter med disse cellene kan enkelt kvantifiseres. Mens denne teknikken er enkel, dets applikasjoner for studiet av NC kjennetegn ved migrasjon, selvfornyelse og differensiering er enorme. Videre isolere NC fra genmodifiserte mus embryoer tillater direkte studiet av bestemte gener og gangstier i forbindelse med NC migrasjon, overlevelse, og / eller differensiering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Marc Wozniak for video hjelp. Vi ønsker også å erkjenne Sean Morrison ved UT Southwestern for den opprinnelige protokollen for dyrkning rotte NC celler. Dette arbeidet ble støttet Vanderbilt University Medical Center Academic Program Support og med tilskudd fra NIH (HD36720 og HD036720-11S109) og AHA 11GRNT7690040 til PAL, predoctoral stipend fra AHA (0615209B) og NIH (NS065604) til NAM, og ERP var støttet av en NIH trening stipend T32HD007502.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM (low glucose) | GIBCO, by Life Technologies | 11885 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO, by Life Technologies | 21103 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3912-10G | |
| dPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | |
| IGF1 | BD Biosciences | 354037 | Store in 50 μg/mL aliquots |
| bFGF | BD Biosciences | 354060 | Store in 25 μg/mL aliquots |
| Fibronectin | GIBCO, by Life Technologies | 33016-015 | Stored in 1mg/mL aliquots |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R2625 | Put into solution with ethanol, make 35 μg/ml aliquots |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | D-5637 | |
| N2 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 supplement | GIBCO, by Life Technologies | 17504-044 | |
| Steriflip 0.22 μm filters | EMD Millipore | SCGP00525 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| 0.20 μm filters | Corning | 431219 | |
| Syringes (for filtration) | BD Biosciences | 301604 | |
| Four well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 176740 | |
| Collagenase/Dispase | Roche Group | 269 638 | Activity varies by batch. Stored in 100 mg/mL aliquots. |
| Insulin needles (29 ½ gage) | BD Biosciences | 309306 | |
| Hypoxia Chamber | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Oxygen Analyzer | Billups-Rothenberg, Inc. | ||
| Forceps #5 | Fine Science Tools | For removing uterus and decidua. |
References
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).
- Kulesa, P. M., Gammill, L. S. Neural crest migration: patterns, phases and signals. Developmental biology. 344, 566-568 (2010).
- Saint-Jeannet, J. -P. Neural crest induction and differentiation. , Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).
- Plank, J. L. Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation. Developmental biology. 349, 321-330 (2011).
- Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas. Development. 135, 2151-2160 (2008).
- Freem, L. J. The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice. J. Anat. 217, 651-664 (2010).
- Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. A clonal approach to the problem of neural crest determination. Developmental biology. 46, 262-280 (1975).
- Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells. Developmental biology. 80, 96-106 (1980).
- Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest. Development. 112, 301-305 (1991).
- White, P. M. Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals. Neuron. 29, 57-71 (2001).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos. J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).
- Chung, I. H. Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development. Stem Cells. 27, 866-877 (2009).
- Biernaskie, J. SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells. Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).
- Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors. Development. , 126-3781 (1999).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2. Stem Cells. 29, 128-140 (2011).
- Morrison, S. J. Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells. J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).
- Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. In vitro clonal analysis of mouse neural crest development. Developmental biology. 157, 517-525 (1993).
- Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).
- Mundell, N. A., Labosky, P. A. Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates. Development. 138, 641-652 (2011).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling. Development. 133, 99-106 (2006).
- Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation. Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).
- Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia. Development. 133, 4839-4847 (2006).
- Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick. Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).
- Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).
- Simon, M. C., Keith, B. The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).
- Ivanovic, Z. Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).
