Summary
Een efficiënte aanpak voor het bereiden nanovezels ingericht met functionele groepen die specifiek interactie met eiwitten beschreven. De benadering vereist eerst de bereiding van een gefunctionaliseerd polymeer met geschikte functionele groep. De functionele polymeer wordt gefabriceerd in nanovezels door electrospinning. De effectiviteit van de binding van de nanovezels met een eiwitgehalte wordt onderzocht door confocale microscopie.
Abstract
Elektrospinnen is een effectieve behandeling voor het bereiden van nanovezels ingericht met functionele groepen. Nanovezels ingericht met functionele groepen kan worden gebruikt om materiaal-biomarker interacties ie fungeren als biosensoren met potentieel als single molecule detectoren studie. Wij hebben een effectieve aanpak voor het bereiden functionele polymeren waarvan de functionaliteiten heeft de capaciteit tot specifieke binding met een modeleiwit. In ons model systeem de functionele groep 2,4-dinitrofenyl (DNP) en het eiwit anti-DNP IgE (immunoglobuline E). Het functionele polymeer, α, ω-bi [2,4-dinitrofenyl capronzuur] [poly (ethyleenoxide)-b-poly (2-methoxystyreen)-b-poly (ethyleenoxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP), bereid door anionische levende polymerisatie. De difunctionele initiator gebruikt in de polymerisatie werd bereid door reactie van elektronoverdracht α-methylstyreen en kalium (mirror) metaal. De 2-methoxystyreen monomeer toegevoegdeerst de initiator, gevolgd door de toevoeging van het tweede monomeer, ethyleenoxide en ten slotte het levende polymeer werd beëindigd door methanol. De α, ω-dihydroxyl polymeer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] omgezet met N-2 ,4-DNP-∈-aminocapronzuur door DCC koppeling, resulterend in de vorming van α, ω-bi [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poly (ethyleenoxide)-b-poly (2-methoxystyreen)-b-poly (ethyleenoxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). De polymeren werden gekarakteriseerd door FT-IR, 1H NMR en gelpermeatiechromatografie (GPC). De molecuulgewichtsverdelingen van de polymeren waren klein (1,1 tot 1.2) en polymeren met molecuulgewichten groter dan 50.000 werd gebruikt in dit onderzoek. De polymeren werden gele poeders en oplosbaar in tetrahydrofuran. Een water oplosbaar CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (dimethoxyethylene glycol) bindt en bereikt steady state binding met IgE oplossing binnen enkele seconden. Hoger molecuulgewicht (niet in water oplosbare dwz ongeveer 50.000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymeren, bevattende 1% enkelwandige koolstofnanobuizen (SWCNT) werden verwerkt tot elektroactieve nanovezels (100 nm tot 500 nm in diameter) op siliciumsubstraat. Fluorescentiespectroscopie toont dat anti-DNP IgE samenwerkt met de nanovezels door binding met de functionele groepen DNP versieren de vezels. Deze waarnemingen suggereren dat de juiste gefunctionaliseerde nanovezels belofte voor het ontwikkelen van biomarker detectie-apparaat vast te houden.
Protocol
1. Synthese van α, ω-dihydroxyl Polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]
- Monteer polymerisatiereactor zoals weergegeven in figuur 1. De reactor voor dit experiment uit een 100 ml ronde bodem 2-halskolf met een standaard conische buitenste verbinding (Chemglass), twee stroomregeling adapters met afsluiters (Chemglass) en een Teflon roerstaaf. Adapter A (Figuur 1) werd gebruikt om Ultra High Purity (UHP) Stikstof stroomt houden door middel van het systeem om lucht en vocht in het inerte systeem. Adapter B (figuur 1) werd gebruikt om het oplosmiddel, monomeer en initiator te injecteren in de reactiekolf.
- 200 ml droog tetrahydrofuran (THF) over Na metaal, met benzofenon als indicator voor minimaal 6 uur onder droge stikstof gas.
- Droog 10 ml 2-methoxystyreen op calciumhydride gedurende 24 uur.
- Bereid een lage temperatuur met constante temperatuur -78 ° C met een suspensie van een isopropanolnd vloeibare stikstof.
- 25 ml THF in de polymerisatiereactie kolf (zie figuur 1) onder stikstofgas en houden reactor onder stikstofgas hele polymerisatie.
- Plaats 100 ml rondbodemkolf tot een suspensie.
- Voeg 2 ml (0,27 mmol / ml) van de initiatoroplossing in de reactiekolf.
- Injecteer het eerste monomeer, 2-methoxystyreen (4 ml) in de reactiekolf.
- Laat de reactie verlopen gedurende 40 min.
- Voeg 1 ml van het tweede monomeer, ethyleenoxide.
- Laat de polymerisatie bij kamertemperatuur nog twee dagen.
- Beëindigen polymeer met HCl (6 M) / methanol (1/20, vol / vol).
- Zuiver het polymeer door neerslaan in hexaan en droog polymeer in een vacuümoven.
- Karakteriseren het polymeer met NMR.
2. Functionalisering van α, ω-dihydroxyl polymeer met N-2 ,4-DNP-Ε-aminocapronzuur de functionele Polym verkrijgeneh, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP
- In een driehalskolf, plaats de α, ω-dihydroxyl polymeer (0,05 mmol), het N-2 ,4-DNP-E-aminocapronzuur (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) en DMAP (0,005 mmol) en drogen op vacuümleiding gedurende 4 uur.
- Destilleren droge dichloormethaan (10 ml) in de kolf.
- De vacuümverpakking onder stikstof en roeren reactiemengsel gedurende 12 uur bij kamertemperatuur.
- Filter reactiemengsel en herstellen polymeer door neerslaan tweemaal in hexanen en methanol.
- Droog neergeslagen polymeer in een vacuümoven bij 40 ° C.
- Bepaal de polymeerstructuur en functionaliteit van FT-IR en 1H NMR.
3. Voorbereiding van CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT Oplossing voor electospinning
- Los 20 w% van CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP in chloorbenzeen.
- Los 20 w% en 40 gew% polystyreen (MW 800.000) in chloorbenzeen twee oplossingen te bereiden. De hogere moleculaire polystyreen wordt gebruikt toenemendee polymeerketen keten verstrengeling en verkrijgen van de optimale viscositeit vereist elektrospinnen.
- Meng de polymeeroplossingen bereid in 3.1 en 3.2 samen tot 1:1 en 1:2 verhoudingen van de polymeren te vormen en 1 w% enkelwandige koolstof nanobuisjes (SWCNT) toe te voegen aan het mengsel en roer 's nachts voor een gelijkmatige verdeling van de CNTs.
4. Electrospinning van Polymer-CNT Composite
- Monteer de electrospinning opgezet als weergegeven in figuur 2. Aan de rechterkant van de figuur is de Glassman High Voltage bron. Daarnaast is een retort stand waarop de silicium wafer is bevestigd. Aan de linkerzijde is een retort stand waarop de injectiespuit is achter en is de lamp voor het visualiseren van de procedure het vordert.
- Met een injectiespuit trekken een kleine hoeveelheid CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT mengsel (ongeveer 1 ml) en monteer de injectiespuit de retort stand.
- Een silicium wafer is mounted tegenover de injectiespuit stevig op een afstand van 10 cm, en de aardklem van de hoogspanningsbron is verbonden.
- Bevestig de clip met het hoge voltage wordt toegepast op de naald van de spuit, de zuiger iets (een druppel op de naald schorsen) en op dit punt, electrospinning klaar.
- Schakel de hoogspanningsbron en voltmeter aan 10 kV passen. Afhankelijk van de aard van de polymeren in de samenstelling kunnen hogere spanningen noodzakelijk zijn, vooral als nanovezels onder honderd nanometer in diameter gewenst.
- Unmount silicium wafer en doe dit in een exsiccator 's nachts volledig drogen.
5. Karakterisering van nanovezels
- Eerste beeldvorming van nanovezels gebeurt met optische microscoop om het algemene perspectief van de vezels observeren.
- Maak gebruik van Scanning Electron Microscope voor fijnere details zoals morfologie, diameter, gemiddelde poriegrootte, enz. in acht nemen
- Dragenverdere beeldvorming met een Atomic Force Microscope om 3-D topografie van vezels, enz. in acht nemen
6. Bindingsspecificiteit van nanovezels met anti-DNP IgE Protein
- Bereid een oplossing van 4 ug / l fluorescerend gelabelde, FITC-IgE (fluoresceïne-isocyanaat-Isothio Immunoglobuline E) in PBS-BSA (fosfaat gebufferde zoutoplossing runderserumalbumine) oplossing.
- Een klein stukje silicium wafer waarop er nanovezels op MatTek goed dekglaasje. Incubeer de nanovezels in deze oplossing gedurende een uur. Incubatie vindt plaats door voorzichtig pipetteren van 10 ul IgE oplossing op de silicium wafer.
- Na incubatie, verwijder ongebonden IgE door wassen monster driemaal met de PBS-BSA-buffer oplossing. De PBS oplossing voorzichtig afgegeven op de wand van de MatTek schotel, om te voorkomen spuiten de buffer direct op de nanovezels. Swirl de schotel voorzichtig met de hand, om bufferoplossing verspreiden op nanovezels. Verwijder voorzichtig buffer met een pipet en opnieuwturf dit nog twee keer.
- Voor de controle, incubeer nanovezels in fluorescent gelabelde IgG (niet specifiek voor DNP) onder dezelfde omstandigheden.
- Visualiseer de gebonden vezels met een confocale microscoop te observeren binding met IgE. Voor onze studie, de gebruikte microscoop was Leica confocale TCS SP2 met 63x lens.
7. Stroom-spanning Gedrag van nanovezels
- Sluit twee micro klepstandstellers tot een zeer laag actuele bron, zoals de Keithley 6430 gevoelige SourceMeter. De opgezet voor het bepalen van de actuele spanning gedrag is weergegeven in figuur 3. Deze figuur toont de Probe station gebruikt om de initiële IV kenmerken van de nanovezels bepalen. Het bestaat uit de Bausch en Lomb MicroZoom Microscope een vacuümklem Stage en vier micropositioners in sonderen. Op de bovenste rechterkant is de Agilent 34405A digitale multimeter voor het meten van de spanning en daaronder is het Keithley 6430 Sub-Femtoamp Remote Bron Meter gebruikt om de bron van de lage stromen die input waren in de vezels.
- Monteer de sonde-armen van de micro manipulatoren over de vezelmat aan weerszijden met de tips aan te raken de vezels.
- Sluit een ander twee micro klepstandstellers op een digitale multimeter, monteert u de sonde-armen in-tussen de andere twee en het land van de tips over de vezel mat. Zorg ervoor dat de vier tips zijn als collineair mogelijk te maken.
- Input verschillende hoeveelheden stroom van de Keithley (typisch in het bereik nanoamps).
- Meet de spanningsval over de buitenste punten voor elke magnitude van stroom afkomstig.
- Plotten deze waarden geeft het type apparaat de vezelmat werkt als.
8. Representatieve resultaten
Functional Polymer
"> De werkwijze voor de synthese van α, ω-bi [2,4-dinitrofenyl capronzuur] [poly (ethyleenoxide)-b-poly (2-methoxystyreen)-b-poly (ethyleenoxide)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) wordt getoond in Figuur 4. 1 De structuur van de functionele polymeer werd bevestigd door FT-IR (Figuur 5) en 500 MHz 1H NMR spectroscopie (figuur 6). FT-IR toont het verdwijnen van de-OH brede absorptie rond 3500 cm -1 aangeeft kwantitatieve functionalisering met de CDNP groep. Dit wordt ook bevestigd door het NMR spectrum getoond in figuur 6. Met de integratie van de pieken in het NMR spectrum, werd vastgesteld dat de CDNP-PEO -P2MS-PEO-polymeren CDNP kwantitatief gefunctionaliseerd.Nanovezels
In figuur 7 is een mat van geleidend nanovezels verkregen door elektrospinnen CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyreen / SWCNT van chloorbenzeen sheigen. Verkregen confocale beelden bleek dat het eiwit IgE bindt met DNP op het vezeloppervlak. 3 Dit is een indicatie van de specificiteit van binding van electrospun DNP-polymeren naar IgE antilichaam. De lichtintensiteit is een indicator van de aanwezigheid van IgE op de nanovezels als het eiwit fluorescent gelabeld is.
Figuur 8a is een AFM (Atomic Force Microscope) foto van een van de nanovezels verkregen door dit proces en Figuur 8b toont de omvang van deze specifieke nanovezel ongeveer 150 nm in diameter. Door dit proces vezels tussen 100-700 nm verkregen. Op dit huidige tijd is het een uitdaging om vezels te bereiden met een specifieke dimensie. Dit strookt met hetgeen wordt waargenomen door andere groepen. 4 Figuur 9 toont SEM beelden van CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyreen / SWCNT nanovezels en de diameter van de nanovezels waren tussen 200 nm tot 300 nm. Er zijn drie SEM beelden van nanofibers getoond bij verschillende vergrotingen. Studie van de drie beelden toont de morfologie van de vezels lineair en kralen. Het algemene doel is het voorbereiden van vezels die zijn meestal lineair. Figuur 10 toont de IV plot van matten van nanovezels bereid uit CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyreen / SWCNT. De grafiek toont het gedrag van een weerstand (ohmse). Het antigeen wordt gebonden aan de nanovezels verwachten we een verandering in het gedrag van de IV vezelmat zien deze verandering in weerstand is een kenmerk dat suggereert dat de functionele vezels mogelijke toepassing als actieve component in sensoren voor detectie molecuul hebben .
Figuur 1. Polymerisatie reactor voor het synthetiseren van de α, ω-dihydroxyl polymeer. A) De injectie punt voor de stroom UHP gas stikstof. B.) Injectiepunt het oplosmiddel, monomeer en initiator. C) Het reactievat.
Figuur 2. Setup voor elektrospinnen met een Glassman hoogspanningsbron.
Figuur 3. Setup gebruikt om IV percelen met behulp van een Sub-femtoamp Remote SourceMeter (Keithley) te meten.
Figuur 4. A). Synthetische benadering voor het bereiden OH-PEO-P2MS-PEO-OH polymeren. B) functionalisering van α, ω-dihydroxy [poly (ethyleenoxide)-b-poly (2-methoxystyreen)-b-poly (ethyleenoxide)].
Figuur 5. FT-IR spectra van (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, voorloper CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP en (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
Figuur 6. 500 MHz Proton NMR van CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
Figuur 7. A) Binding beeld van FITC-IgE met CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP vezels electrospun van chloorbenzeen. B) Confocale microscoop beeld van de controle (nanovezels met IgG).
Figuur 8. A) AFM afbeelding van CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Fibers electrospun van chloorbenzeen en B) AFM profiel ie afmeting van een vezel getoond in figuur 5a.
Figuur 9. SEM beelden van CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyreen / SWCNT nanovezels.
Figuur 10. IV perceel van matten van nanovezels bereid uit CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyreen / SWCNT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit rapport hebben we voorgesteld een krachtige aanpak voor het bereiden van biofunctionele nanovezels. De nanovezels zijn ingericht om een functionele groep die specifiek is voor een modeleiwit. De procedure en werkwijze in deze mededeling is algemeen en kan worden gebruikt om nanovezels ingericht met elke gewenste functionele groep te bereiden. De anionische polymerisatie levende krachtige methode om gecontroleerde polymeerstructuren covalent verbonden met een aantal interessante functionele of functionele groepen die specifiek zijn voor bepaalde biomarkers plaats synthetiseren. Anionische levende polymerisatie is verankerd voor het monomeer 2-methoxystyreen. Electrospinning 2 is een veelzijdige techniek dat de vezel afmetingen eenvoudig worden geregeld door de spanning en verschillende concentraties van de te onderzoeken oplossing electrospun. 5 nanovezels tonen resistieve IV gedrag en dus zijn veelbelovend als actieve componenten functioneren inbiosensoren dwz meldde de aanpak lijkt veelbelovend voor de ontwikkeling van biomarker detectie-apparaat. 6,7
De polymerisatie van het eerste monomeer, 2-methoxystyreen, 100% volledig binnen 40 min wil zeggen 100% van het monomeer omgezet in het polymeer en het tweede monomeer polymerisatie langzaam die 2 dagen polymeriseren. Dat is, een monomeer gepolymeriseerd monomeer sneller dan 2. Er geen ongebruikte monomeer, maar eind van de 2 dagen er een ongebruikte monomeer maar dit zal niet bij aan de polydispersiteit. Wij hebben homopolymeren van het eerste monomeer dus poly (2-methoxystyreen) en de PDI van deze polymeer ongeveer 1,2 en de blokcopolymeren die hier is 1.2. Om het beste van onze kennis, is er geen onderzoek is uitgevoerd waarbij gekeken wordt naar het effect van PDI op de dimensie van de electrospun vezels, maar het is normaal verwacht dat lage PDI bijdragen aan een betere kwaliteit van verwerkt product omwille van redenen van cHain-keten verwikkelingen.
We gebruikten SWCNTs omdat eerder werk waaruit blijkt dat poly2-methoxystyreen effectief in wikkelen rond de koolstof nanobuis gaan en de agglomeratie van de SWCNT. 8 We geloven dat dit te maken heeft met de specifieke grootte van de SWCNTs. Tenslotte 1% SWCNT gehalte in de vezels resulteert in vezels die voldoende elektroactieve voor ons onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NSF HRD-0630456, een NSF CREST Program en NSF is DMR-0934142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Metal | Sigma-Aldrich | 282065 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 239852 | |
| 2-methoxystyrene | Sigma-Aldrich | 563064 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 178810 | |
| Chlorobenzene | Sigma-Aldrich | 319996 | |
| Single walled CNTs | Sigma-Aldrich | 704113 | |
| Polystyrene | Sigma-Aldrich | 81416 | |
| Silicon Wafers | Silicon Quest Int’l | 720200 | |
| Zeiss FESEM | Carl Zeiss Inc. | Ultra 60 | |
| Probestation with Bausch & Lomb MicroZoom II High Performance Microscope | Bausch and Lomb | ||
| Leica Scanning Confocal System | Leica Microsystems | TCS SP2 | |
| Sub-femtoamp Remote Sourcemeter | Keithley Instruments | 6430 | |
| Autoranging Digital Multimeter | Keithley Instruments | 175A | |
| Syringe Pump | Chemyx Inc. | Fusion 200 | |
| Zeiss Optical Microscope | Carl Zeiss Inc. | Zeiss/Axiotech |
References
- Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
- Gordon, K., Sannigrahi, B. Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces. Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).
- Baird, E. J., Holowka, D. Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation. Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).
- Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , World Sceintific. (2005).
- Kameoka, J., Craighead, H. G. Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning. Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).
- Ramakrishna, S., Lala, N. L. Polymer Nanofibers for Biosensor Applications. Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).
- Reuven, D., Sil, D. Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins. Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).
- Ogunro, O., Karunwi, K. Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).
