Summary
En effektiv metode for fremstilling av nanofibers dekorert med funksjonelle grupper i stand til spesifikt samarbeidsstil proteiner er beskrevet. Tilnærmingen krever først fremstillingen av en polymer funksjonalisert med passende funksjonell gruppe. Den funksjonelle polymer er fabrikkert i nanofibers ved electrospinning. Effektiviteten av bindingen av nanofibers med et protein er studert av konfokal mikroskopi.
Abstract
Electrospinning er en effektiv prosesseringsmetode for fremstilling nanofibers dekorert med funksjonelle grupper. Nanofibers dekorert med funksjonelle grupper kan anvendes for å studere materiale-biomarkør interaksjoner ie act som biosensorer med potensial som ett molekyl detektorer. Vi har utviklet en effektiv metode for å forberede funksjonelle polymerer hvor funksjonaliteten har kapasitet til spesifikt bindende med en modell protein. I vår modell system, er den funksjonelle gruppe 2,4-dinitrofenyl (DNP) og proteinet er anti-DNP IgE (Immunoglobulin E). Den funksjonelle polymer, α, ω-bi [2,4-dinitrofenyl Caproic] [poly (etylen oksid)-b-poly (2-methoxystyrene)-b-poly (etylenoksid)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- CDNP), fremstilles ved anionisk levende polymerisering. Den difunksjonelle initiator anvendes i polymeriseringen ble fremstilt ved elektronoverføring omsetning av α-metylstyren og kalium (speil) metall. Den 2-methoxystyrene monomer ble lagtførste til initiativtakeren, fulgt av tilsetning av den andre monomer, etylenoksyd, og endelig den levende polymer ble avsluttet ved metanol. Den α, ω-dihydroxyl polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] ble omsatt med N-2 ,4-DNP-∈-aminokapronsyre, etter DCC kopling, noe som resulterer i dannelsen av α, ω-bi [ 2,4-dinitrophenylcaproic] [poly (ethyleneoxide)-b-poly (2-methoxystyrene)-b-poly (etylenoksid)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). Polymerene ble karakterisert ved FT-IR, 1 H NMR og gelpermeasjonskromatografi (GPC). Molekylvekten distribusjoner av polymerene var smal (1,1 til 1,2) og polymerer med molekylvekter større enn 50.000 ble brukt i denne studien. Polymerene var gule pulver og løselige i tetrahydrofuran. En vannløselig CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (dimethoxyethylene glycol) kompleks binder og oppnår steady state binding med løsningen IgE i løpet av få sekunder. Høyere molekylvekt (vann uløselig dvs. rundt 50.000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymerer, som inneholder 1% enkelt vegg karbon nanorør (SWCNT) ble behandlet i electroactive nanofibers (100 nm til 500 nm i diameter) på silisium substrat. Fluorescensspektroskopi viser at anti-DNP IgE samhandler med nanofibers ved binding med DNP funksjonelle grupper dekorere fibre. Disse observasjonene tyder på at riktig functionalized nanofibers holder løftet for å utvikle biomarkører deteksjon enhet.
Protocol
1. Syntese av α, ω-dihydroxyl Polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]
- Monter polymerisasjonsreaktor som vist i figur 1. Reaktoren for dette forsøk består av en 100 ml rundbundet 2-halset kolbe med en standard konus ytre felles (Chemglass), to flytkontroll adaptere med stoppekraner (Chemglass), og en Teflon rørestang. Adapter A (figur 1) ble brukt til å holde ultra høy renhet (UHP) Nitrogen som strømmer gjennom systemet for å hindre at luft og fuktighet fra å komme den inerte system. Adapter B (figur 1) ble anvendt for å injisere løsningsmidlet, monomer og initiator i reaksjonskolben.
- Tørr 200 ml tetrahydrofuran (THF) over Na metall, ved hjelp av benzofenon som indikator, for minimum 6 timer under tørr nitrogengass.
- Tørr 10 ml 2-methoxystyrene enn kalsium-hydrid i 24 timer.
- Forbered en kald temperatur bad holdt ved -78 ° C ved hjelp av en oppslemming av isopropanol ennd flytende nitrogen.
- Tilsett 25 ml THF inn polymerisasjonsreaksjonen kolbe (se figur 1) under nitrogen og holde reaktoren under nitrogen gjennom hele polymeriseringen.
- Plass 100 ml rundbundet kolbe inn i slurry.
- Tilsett 2 ml (0,27 mmol / ml) av initiatoren løsning i reaksjonskolben.
- Injiser første monomer, 2-methoxystyrene (4 ml) i reaksjonskolben.
- Tillat reaksjonsblandingen å pågå i 40 min.
- Tilsett 1 ml av den andre monomer, etylenoksyd.
- Tillate polymeriseringen å fortsette ved romtemperatur i to dager.
- Avslutte polymeren med HCl (6 M) / metanol (1/20, vol / vol).
- Rense polymeren ved utfelling i heksaner og tørr polymer i en vakuumovn.
- Karakterisere polymer med NMR.
2. Funksjonalisering av α, ω-dihydroxyl Polymer med N-2 ,4-DNP-Ε-aminokapronsyre skaffer Functional Polymeh, CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP
- I en tre halset kolbe, plasserer α, ω-dihydroxyl polymer (0,05 mmol), N-2 ,4-DNP-e-aminokapronsyre (0,25 mmol), DCC (0,15 mmol) og DMAP (0,005 mmol) og tørke på vakuumledning i 4 timer.
- Destillere tørr diklormetan (10 ml) inn i kolben.
- Slipp vakuum under nitrogen og omrør reaksjonsblandingen i 12 timer ved romtemperatur.
- Filter reaksjonsblandingen og gjenopprette polymer ved utfelling to ganger i heksaner og metanol.
- Tørr utfelt polymer i en vakuumovn ved 40 ° C.
- Bestem polymerstruktur og funksjonalitet ved FT-IR og 1H NMR.
3. Utarbeidelse av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT løsning for electrospinning
- Oppløse 20 w% av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP i chlorobenzene.
- Oppløs 20 w% og 40 vekt% av polystyren (MW 800.000) i klorbenzen til å forberede to løsninger. Jo høyere molekylær polystyren brukes til økte polymerkjede-kjeden sammenfiltring og oppnå optimal viskositet kreves for elektrospinning.
- Bland polymerløsninger utarbeidet i 3.1 og 3.2 sammen til 01:01 og 1:2 forhold mellom polymerene og tilsett 1 w% enkeltkjedet vegger karbon nanorør (SWCNT) til blandingen og omrør over natten for jevn fordeling av CNTs.
4. Electrospinning av Polymer-CNT Composite
- Monter elektrospinning satt opp som vist i figur 2. På høyre side av figuren er Glassman Internett spenningskilden. Ved siden av det er et skarpt svar stå der silisium wafer er vedlagt. Til venstre er en annen motsvar stativ der sprøyten er montert og bak det er lampen for å visualisere prosedyren som det skrider frem.
- Ved hjelp av en hypodermisk sprøyte, trekke tilbake en liten mengde av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT blandingen (ca. 1 ml) og monter hypodermisk sprøyten på retorten stativet.
- En silisium wafer er mounted over fra sprøyten sikkert ved en avstand på 10 cm, og bakken klipp av høyspent kilden er festet til den.
- Fest klemmen bærer høye spenning som skal påtrykkes på nålen på sprøyten stemplet trykkes litt (for å suspendere en dråpe på nålspissen) og på dette punktet, er elektrospinning klar.
- Strøm på høy spenningskilde og juster voltmeteret til 10 kV. Avhengig av arten av de polymerer i kompositt, kan høyere spenninger være nødvendig, spesielt hvis nanofibers under hundre nanometer i diameter er ønskelig.
- Avmonter silisium wafer og plasser i et tørkeapparat over natten for å tørke helt.
5. Karakterisering av Nanofibers
- Innledende avbildning av nanofibers gjøres med optisk mikroskop for å observere helhetsperspektivet av fibrene.
- Utnytte scanning elektronmikroskop for å observere finere detaljer som morfologi, diameter, gjennomsnittlig porestørrelse, etc.
- Carryut ytterligere avbildning med en Atomic Force Microscope å observere 3-D topografi av fibre osv.
6. Bindende Spesifisitet av Nanofibers med Anti-DNP IgE Protein
- Forbered en løsning av 4 ug / l fluorescensmerkede, FITC-IgE (Fluorescein Isothio-cyanate-Immunoglobulin E) i PBS-BSA (fosfatbufret saltvann-bovint serum albumin) løsning.
- Plasser et lite stykke silisium wafer hvor det er nanofibers på en Mattek godt dekkglass. Inkuber nanofibers i denne løsningen for én time. Inkubasjonen utføres ved forsiktig pipettering ut, 10 ul IgE løsning på silisiumskiven.
- Etter inkubering, fjernes ubundet IgE ved vasking prøven tre ganger med PBS-BSA-bufferløsning. PBS løsning dispenseres forsiktig på veggen av Mattek parabol, for å unngå squirting bufferen direkte på nanofibers. Swirl fatet forsiktig for hånd, for å distribuere buffer løsning på nanofibers. Fjern forsiktig buffer med en pipette og retorv dette to ganger til.
- For kontroll, inkuber nanofibers i fluorescensmerkede IgG (ikke-spesifikk for DNP) under de samme betingelser.
- Visualiser de bundne fibre med en confocal mikroskop for å observere binding med IgE. For vår studie var mikroskop Leica confocal TCS SP2 med 63x linse.
7. Strøm-spenning oppførsel Nanofibers
- Koble to mikro posisjoneringsenheter til en svært lav strøm kilde som Keithley 6430 sensitive sourcemeter. Den er satt opp for å bestemme den nåværende spenning atferd er vist i figur 3.. Denne figuren viser Probe stasjonen brukes til å bestemme den første IV karakteristikk av nanofibers. Det består av Bausch & Lomb MicroZoom mikroskop, et vakuum Chuck Stage, og fire Micropositioners brukes i undersøkelser. Øverst til høyre er Agilent 34405A Digital Multimeter brukes til måling av spenning og under det er Keithley 6430 Sub-Femtoamp Remote Source Meter brukes til kilden de lave strøm som var innspill inn i fibrene.
- Monter proben armene av mikro posisjoneringsenheter over fibermatten på motsatte sider med tuppene berøre fibrene.
- Koble ytterligere to micro posisjoneringsenheter til en digital multimeter, montere sonden armene i mellom de to andre og lande tips om fibermatten. Sørg for at de fire tipsene er så collinear som mulig.
- Input varierende mengder strøm fra Keithley (typisk i nanoamps området).
- Måle spenningsfallet over ytre tips, for hver størrelsesorden av strøm hentet.
- Plotting disse verdiene vil indikere hvilken type enhet fibermatten fungerer som.
8. Representant Resultater
Funksjonell Polymer
"> Den fremgangsmåte for syntese av α, ω-bi [2,4-dinitrofenyl Caproic] [poly (etylen oksid)-b-poly (2-methoxystyrene)-b-poly (etylenoksid)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) er vist i Figur 4. 1 Oppbyggingen av funksjonelle polymer ble bekreftet ved FT-IR (fig. 5) og 500 MHz 1 H NMR spektroskopi (figur 6). FT-IR viser fullstendig forsvinning av den-OH brede absorpsjon rundt 3500 cm -1 indikerer kvantitativ funksjonalisering med CDNP gruppen. Dette bekreftes også av NMR-spektrum er vist i Figur 6. Bruke integreringen av toppene i NMR-spektrum, ble det fastslått at CDNP-PEO -P2MS-PEO-CDNP polymerer kvantitativt functionalized.Nanofibers
I Figur 7, er en matte av ledende nanofibers innhentet av electrospinning CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / isopor / SWCNT fra chlorobenzene shegen. Confocal bilder oppnådd viste at proteinet IgE binder med DNP på fiberflaten. 3 Dette er en indikasjon av spesifisiteten av binding av elektrospunnede DNP-polymerer mot IgE antistoff. Intensiteten av lys er en indikator på tilstedeværelse av IgE på nanofibers som proteinet er fluorescensmerket kodet.
Figur 8a er en AFM (Atomic Force Microscope) bilde av en nanofibers fremstilt ved denne prosessen, og Figur 8b viser den dimensjonen av denne bestemt nanofiber er rundt 150 nm i diameter. Ved denne prosessen fibrene mellom 100-700 nm er innhentet. På dette klokkeslettet er det utfordrende å forberede fibre med en bestemt dimensjon. Dette er konsistent med det som er observert av andre grupper. 4 Figur 9 viser SEM bilder av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / polystyren / SWCNT nanofibers og diameteren nanofibers var mellom 200 nm til 300 nm. Det er tre SEM bilder av nanofibers vist på ulike forstørrelser. Studier av de tre bildene viser morfologier av fibrene er lineær og beaded. Det overordnede målet er å forberede fibre som er mest lineære. Figur 10 viser IV tomt på matter av nanofibers fremstilt fra CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / isopor / SWCNT. Plottet viser virkemåten av en motstand (Ohmsk). Når antigenet er bundet til nanofibers forventer vi å se en endring i IV oppførselen fibermatten som denne endringen i motstand er en karakteristikk som antyder at de funksjonelle fibrene har potensiell anvendelse som den aktive komponenten i sensorer for enkelt molekyl deteksjon .
Figur 1. Polymerisasjonsreaktor for å syntetisere den α, ω-dihydroxyl polymer. A) injeksjonspunktet for flyten UHP gass nitrogen. B.) Injeksjon punktet for oppløsningsmidlet, monomer og initiator. C) reaksjonsbeholder.
Figur 2. Oppsett brukes for electrospinning med en Glassman høy spenning kilde.
Figur 3. Setup brukes til å måle IV tomter ved hjelp av en Sub-femtoamp Remote Sourcemeter (Keithley).
Figur 4. A). Syntetisk tilnærming for fremstilling OH-PEO-P2MS-PEO-OH polymerer. B) Funksjonalisering av α, ω-dihydroksy [poly (ethyleneoxide)-b-poly (2-methoxystyrene)-b-poly (ethyleneoxide)].
Figur 5. FT-IR spektra av (A) OH-PEO-P2MS-PEO-OH, forløperen til CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP og (B) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
Figur 6. 500 MHz Proton NMR av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP.
Figur 7. A) Binding bilde av FITC-IgE med CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP fibre elektrospunnede fra chlorobenzene. B) Confocal mikroskop bilde av kontrollen (nanofibers med IgG).
Figur 8. A) AFM bilde av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP Fibers elektrospunnede fra klorbenzen og B) AFM profilen dvs. dimensjon av en fiber vist på fig 5a.
Figur 9. SEM bilder av CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / isopor / SWCNT nanofibers.
Figur 10. IV tomt på matter av nanofibers fremstilt fra CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / isopor / SWCNT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne rapporten har vi presentert en kraftig tilnærming for å forberede biofunctional nanofibers. Nanofibers er innredet til en funksjonell gruppe som er spesifikk for en modell protein. Fremgangsmåten og tilnærming rapportert i denne kommunikasjonen er av generell art og kan anvendes for å fremstille nanofibers dekorert med noen funksjonell gruppe ønsket. Det anioniske levende polymerisasjon er kraftig metode for å syntetisere kontrollerte polymer strukturer kovalent koplet til en rekke interessante funksjonelle eller funksjonelle grupper som er spesifikke for spesielle biomarkører av interesse. Anionisk levende polymerisasjonen veletablert for monomer 2-methoxystyrene. 2 Electrospinning er en allsidig teknikk i at fiberdimensjoner kan lett kontrolleres ved å endre spenningen og også varierende konsentrasjon av løsningen er elektrospunnede. 5 nanofibers viser resistive IV adferd og dermed er lovende å fungere som aktive komponenter ibiosensorer dvs. tilnærming rapportert holder løftet for å utvikle biomarkører deteksjon enhet. 6,7
Polymerisasjonen av den første monomer, 2-methoxystyrene, er 100% fullført innen 40 min dvs. 100% av monomeren er omdannet til polymer, og den andre monomer polymeriseringen er langsom krever 2 dager for å polymerisere. Det vil si, polymeriserer monomer en raskere enn monomer 2. Det er ingen ubrukt monomer en, men slutten av 2 dager, er det noen ubrukte monomer, men dette vil ikke bidra til polydispersitet. Vi har utarbeidet homopolymerer av den første monomer dvs. poly (2-methoxystyrene) og PDI av disse polymer er rundt 1,2 og også blokk-kopolymerer som rapporteres her er også 1,2. Til det beste av vår kunnskap, ingen studier utført som ser på effekten av PDI på dimensjonen av elektrospunnede fibre, men det er normalt forventes at lav PDI bidra til bedre kvalitet bearbeidede produkt på grunn av hensyn til chain-kjeden entanglements.
Vi brukte SWCNTs grunn av tidligere arbeid som viser at poly2-methoxystyrene er effektiv i innpakning rundt karbon nanorør og bryte agglomeration av SWCNT. 8 Vi tror dette har å gjøre med den spesifikke størrelsen på SWCNTs. Endelig, en% SWCNT innholdet i fibrene resulterer i fibre som er tilstrekkelig electroactive for vår studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av NSF HRD-0630456, er en NSF CREST Program og NSF DMR-0934142.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium Metal | Sigma-Aldrich | 282065 | |
| Benzophenone | Sigma-Aldrich | 239852 | |
| 2-methoxystyrene | Sigma-Aldrich | 563064 | |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 178810 | |
| Chlorobenzene | Sigma-Aldrich | 319996 | |
| Single walled CNTs | Sigma-Aldrich | 704113 | |
| Polystyrene | Sigma-Aldrich | 81416 | |
| Silicon Wafers | Silicon Quest Int’l | 720200 | |
| Zeiss FESEM | Carl Zeiss Inc. | Ultra 60 | |
| Probestation with Bausch & Lomb MicroZoom II High Performance Microscope | Bausch and Lomb | ||
| Leica Scanning Confocal System | Leica Microsystems | TCS SP2 | |
| Sub-femtoamp Remote Sourcemeter | Keithley Instruments | 6430 | |
| Autoranging Digital Multimeter | Keithley Instruments | 175A | |
| Syringe Pump | Chemyx Inc. | Fusion 200 | |
| Zeiss Optical Microscope | Carl Zeiss Inc. | Zeiss/Axiotech |
References
- Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
- Gordon, K., Sannigrahi, B. Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces. Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).
- Baird, E. J., Holowka, D. Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation. Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).
- Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , World Sceintific. (2005).
- Kameoka, J., Craighead, H. G. Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning. Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).
- Ramakrishna, S., Lala, N. L. Polymer Nanofibers for Biosensor Applications. Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).
- Reuven, D., Sil, D. Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins. Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).
- Ogunro, O., Karunwi, K. Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).
