Summary
תיאור מפורט של בידוד איון עכבר מתואר באמצעות הטכניקה של cannulation באתר הלבלב ductal וטפטוף של שילוב של מטוהר collagenase ופרוטאז הניטראלי.
Abstract
חקירתו של ביטוי גנים בטא תא ותפקוד במבחנה השתנתה ישר לאורך השנים מהמחקר של שורות תאים סרטניים מכרסמים לחקר איונים מכרסמים מבודדים. איים עיקריים מציעים את היתרון הברור שהם יותר משקפים נאמנו את הביולוגיה של מסלולי איתות תאיים ותגובות הפרשה. ואילו בשיטה של בידוד איון באמצעות אנזים הכנות dissociating רקמות (TDE) כבר מבוססת היטב במעבדות רבות 1-4, וריאציות בעקביות של תפוקה ואיכות איון מכל זן מכרסמים ניתן להגביל את מידת ההיתכנות ומחקרי איון ראשוניים. וריאציות אלו מתרחשות לעתים קרובות כתוצאה מTDES הגולמי המטוהר חלקי המשמש בהליך בידוד האיון; TDES לעתים קרובות מפגינים הרבה וריאציות להרבה בפעילות ולעתים קרובות דורש התאמות למינון של אנזים בשימוש. מספר קטן של דיווחים השתמש מטוהר TDES לבידודים סלולריים מכרסמים 5, 6 7 Gotoh, 8, שבו הם TDES perfused ישירות לתוך צינור הלבלב של עכברים, ואחרי חלוקת רקמה גולמית באמצעות שיפוע Histopaque 9, ובידוד של איים מטוהרים. הבדל משמעותי בפרוטוקול שלנו הוא השימוש במטוהרי collagenase (CI האנזים הזה MA) ושילוב ניטראלי פרוטאז (CI האנזים הזה BP). Collagenase התאפיין בשימוש בקולגן פעילות assay 6 פלואורסצנטי המשפיל (CDA) שמנוצל סיבים מסיסים שבכותרתו fluorescently שוק עור כמצע 6. מצע זה יותר חזוי של קינטיקה של פירוק קולגן במטריקס הרקמות מכיוון שהוא מסתמך על קולגן יליד כמצע. פרוטאז הוא characterized עם assay הקינטית ניאון רגיש 10. ניצול משופרים מבחנים אלה, יחד עם ניתוח ביוכימי מסורתי יותר תאפשר TDE להיות מיוצר באופן עקבי יותר, מה שמוביל לביצועים משופר עקביות בין מגרשים. הפרוטוקול המתואר כאן היה מותאם לתשואה מקסימלי איון ומורפולוגיה איון אופטימלית באמצעות C57BL / 6 עכברים. במהלך הפיתוח של פרוטוקול זה, כמה שילובים של collagenase ופרוטאזות ניטראליות הוערכו בריכוזים שונים, והיחס הסופי של collagenase: פרוטאז ניטראלי 35:10 מייצג ביצועים דומים לסיגמה הסוג XI אנזים. בגלל השתנות משמעותית בתשואות איון ממוצעות מזנים שונים של חולדות ועכברים כבר דיווחה, שינויים נוספים בהרכב TDE צריכים להיעשות כדי לשפר את התפוקה והאיכות של איונים התאוששו ממינים וזנים שונים.
Protocol
חומרים דרושים א: ראה טבלה 1 (ריאגנטים) לפני ההכנה
- HBSS (P / S): 100 מ"ל HBSS 10X + 900 המ"ל H 2 0 + 1% פניצילין / סטרפטומיצין (מאוחסן במקרר או שמר על קרח).
- 20% מניות BSA נעשית במים וaliquoted ומאוחסנות ב -20 ° C.
- HBSS (BSA): 200 מ"ל 1X HBSS (P / S) + 3 מ"ל של 20% BSA (ריכוזי BSA האחרונים הם 0.3%)
- איילט בינוני: RPMI + 10% FBS + גלוטמין% 1 + 1% פניצילין / סטרפטומיצין
- Histopaque 1100: 240 1119 Histopaque המ"ל + 200 המ"ל 1077 Histopaque
- תפר 4-0 (McKesson): לחתוך לחתיכות 2 ¾ אינץ ומאוחסן בצלחת פטרי 10 סנטימטרים
- מכשירים: לכופף את המלקחיים מהגדרות המדע פיין עד 90 מעלות, ולשייף את השיניים המשוננות של כל שלושת הזוגות במלקחיים. המטרה היא להקהות את השיניים, שלא להסיר אותם.
- צינורית לממשל של תערובת collagenase / פרוטאז: 27G ½ פנימה מחט, 30 וחצי פנימהמחט, PE50 צינור חתוך לחתיכות 12 פנימה. להגיש שתי המחטים עד סוף חלק מעוגל שאין קצוות חדים. הכנס את מחט 27G לקצה אחד של 12 פנימה חתיכת PE50 צינורות. הסר מחט 30G מהמעטפת על ידי ניפוץ המעטפת עם צבת, הופך את מארז ¼ פונה בכל פעם. הסר את המחט בצבת מהמעטפת והכנס אותו לקצה השני של צינור PE50 תחת מיקרוסקופ נתיחה. הקפד שלא קינקיות הצינור שאתה מכניס את המחט לתוך PE50 הצינורות. מחט 27G היא הסוף שתוכל לצרף את המזרק של collagenase.
- פרוטאז collagenase (CI האנזים הזה MA) והניטראלי (CI האנזים הזה BP). לשקם TDE להוראות יצרן. עיין בתעודה הספציפית הרבה ניתוח כדי לחשב את ריכוז פעילות האנזים. העברת סך של 350.000 פעילות יחידות קולגן משפילות (CDA) של collagenase המשוחזר ו100.000 יחידות הפרוטאז ניטראליות של reconstitפרוטאז uted BP לתוך צינור חרוטים ולדלל עד סך 15 מ"ל בHBSS (P / S)
פרוטוקול ב 'שלב אחר שלב
1. אינפלציה של לבלב עם תערובת collagenase / פרוטאז
- להרדים את העכבר על ידי נקע צוואר רחם, להרוות את גוף העכבר עם EtOH 70%, חלל בטן פתוח לחלוטין מפי הטבעת לסרעפת עם כל מספרי נתיחה ומלקחיים.
- הנח את העכבר על הפלטפורמה של המיקרוסקופ לנתיחה.
- משוך את המעי האטום ומעי הגס עולה החוצה ולהגדיר אותם מחוץ לחלל הגוף לשמאלך. ראה איור 1 לסיכום של השלבים הבאים.
- מקם את האונות של הכבד נגד הסרעפת; הם צריכים להישאר שם אם חלל הגוף פתוח מספיק רחוק. מצא את העורק כבד, וריד פורטל וחבילת צינור מרה מובילה אל הכבד על ידי האחיזה בתריסריון עם מלקחיים מעוקלים. עם עוד זוג מלקחיים מעוקלים, להגיע מתחת לעורק, וריד והצינור bundle ולמשוך 2 ¾ פנימה חתיכת התפר 4-0 תחת העורק, הווריד, צינור המרה ולקשור אותו פעם אחת ולמשוך אותו בחוזקה כמו לסגור את הכבד ככל האפשר.
- השימוש בשני זוגות של מלקחיים מעוקלים, לתפוס זהירות התריסריון ולמצוא את צינור המרה יצורף לתריסריון בגבשושיות. השתמש במלקחיים של טונג למבעדם לבלב וזכות רקמת חיבור מתחת קרוב צינור המרה לגבשושיות. נקוב המלקחיים שלך במהירות באמצעות האיבר לעשות חור ולאחר מכן הניח את שני המלקחיים של מלקחיים ביניהן ותופס חלק 2 ¾ סנטימטרים נוספים של תפר דרך 4-0 ולקשור אותו פעם אחת ולמשוך אותו למעגל קטן, אבל אל תמשכו חזק.
- שינוי ל90 ° המלקחיים ולמספרי Vannas Superfine. עם 90 ° מלקחיים, לצבוט בזהירות ולמשוך מעי הדק עד צינור המרה הוא מתוח. הפוך חתך אופקי אחד מעבר פטמית עם מספריים מדקירת סכין את המספריים הפתוחים אל המעי ולאחר מכן חיתוך בתנועה אחת. נסה לעשות o רקne חצה פטמית בלי להינתק צינור המרה מהגבשושיות.
- ועדיין מחזיק את המעי עם 90 מלקחי °, להכניס צינורית לתוך צינור המרה עד מחצית אורכו של צינור המרה, ולאחר מכן משוך בעדינות את התפר ההדוק סביב הצינורית.
- מלא מזרק 3 מ"ל עם 2.0 מ"ל של תערובת collagenase / פרוטאז ולהזריק לתוך הצינורית בקצב איטי וקבוע.
- לאחר האינפלציה של הלבלב היא מוחלטת, הסר צינורית מצינור מרה ולהשתמש במלקחיים המעוקלים ומספריים מעוגלים אביב כדי להסיר את הלבלב המנופח על ידי מתחיל במעי הגס היורד וחיתוך רקמת חיבור כפי שאתה מושך את המעיים. המשך להסיר את הלבלב מהמעיים עד שתגיע לצינור המרה, ואז להסיר את הלבלב מהטחול, אז בטן ולאחר מכן מהקרביים של חלל הבטן. סיים את ההסרה על ידי לגזוז את התפרים. הוסף את הלבלב לצינור 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של HBSS(P / S). צינור זה צריך להיות על קרח.
- חזור על התהליך לעיל לכל חיה עד ארבע חיות. לקבלת תוצאות אופטימליות, לנתק רק ארבע pancreata בפעם אחת. בדרך כלל, ואילו הארבעה הראשונים הם באמבט המים 37 מעלות צלזיוס, אנו לנפח עוד pancreata ארבעה.
2. הלבלב דיסוציאציה
- הנח את 50 צינורות המ"ל מכילים pancreata לתוך אמבט מי 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
- נער בעדינות את הצינור ולבדוק לניתוק רקמות, כדי להיות בטוח רקמות מתפרקות בקלות, ואז מערבולת הצינורות 12 פעמים בזמן שאתה מחזיק את הצינור על ידי המכסה.
- הוסף לא יותר מ 30 מ"ל של HBSS (BSA) (זה יכול להיות סכום נמוך, תלוי כמה נחוץ כדי לאזן את הצינורות לצעד צנטריפוגה), וצנטריפוגה XG ב 290 דקות לאחד.
- לשאוב supernatant זהירות ולהשאיר כמות קטנה של supernatant (2-3 מ"ל) בתחתית כדי לא לשבש את התא הגלול.
- באמצעות מזרק 30 מ"ל ATTACהד ל14 גרם מחט, להוסיף לא יותר מ 10 מ"ל של HBSS (BSA) ולשאוב את ההשעיה למעלה ולמטה 2 פעמים.
- סנן את תערובת התא דרך מסננת תה פלסטיק לתוך צינור מ"ל 50 ולשטוף עם 10 מ"ל HBSS אחר (BSA).
- צנטריפוגה ב XG 330 עבור 2 דקות.
- supernatant למזוג ולהפוך צינורות לניקוז על מגבת נייר סופגת לדקת 1.
- Resuspend כל צינור בשנת 1100 histopaque 10 המ"ל הקר.
- כיסוי histopaque עם 10 המ"ל HBSS (BSA) וסרכזת ב900 XG עבור 18 דקות.
- הסר את כל 20 המ"ל של supernatant באמצעות נשא pipet מ"ל גדול 25 ולהעביר את supernatant דרך 70 מיקרומטר סינון הפוכים.
- יש לשטוף את האיונים לתוך צלחת פטרי 10 סנטימטרים על ידי pipetting 10 תקשורת איון מ"ל דרך המסנן בעוד מחזיק אותו בצד ימין מעל הצלחת.
- תרבות האיים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 רקמת תרבות חממה עד מוכן לניסויים. בדרך כלל, איונים הן נבחרו ידניים וספרו לפני experimentation.
3. נציג תוצאות
תשואות איון, מורפולוגיה, ואיכות הם הפרמטרים הכלליים המשמשים לשפוט את ההצלחה של בידוד איון. בידות שלנו, תשואות מאיון C57BL הממוצע / 6 העכבר הן בטווח של 150-250 איונים באמצעות פרוטוקול זה (ראה טבלה 2), וניתנות להשוואה לנתונים המתקבלים באמצעות אופטימיזציה סיגמא סוג XI collagenase. עם זאת, תשואות יכולות להשתנות בהתאם לעומס העכבר משמש וגיל של העכבר. רוב בעלי החיים שאנו מעסיקים הם בטווח גילי 8-16 שבוע פרוטוקול זה נבדק על זני עכבר מרובים, כולל C57BL / 6 (180-250 איונים / עכבר), CD1 (200-300 איונים / עכבר), 129 / ויטמין B6 (200-300 איונים / עכבר), BLKS-db/db (120-200 איונים / עכבר), NOD (10 בני שבוע, 100-150 איונים / עכבר), וNOD-SCID (100-150 איונים / עכבר ). מורפולוגיה איון טיפוסית מוצגת באיור 2, שבו יש לי איונים עגולים למלבניים צורה עם גודל אחיד יחסית (אם כי הגודל uniformity יכול להשתנות מזן לזן). איור 3 מציג הניתוח הטיפוסי שלנו של הפרשת גלוקוז מגורה אינסולין מC57BL / 6 איים מבודדים באמצעות עכבר TDES המטוהר לעומת collagenase XI סיגמא סוג. בדרך כלל, תוצאות באיכות גבוהה איון הכנה בגירוי אינסולין בגלוקוז 25 מ"מ שהוא גדול 6-20 פעמים יותר מאשר זה שנצפה בגלוקוז 2.5 מ"מ. יישומים אחרים יכולים לשמש גם כדי לבדוק את האיכות של איים מבודדים, ואלה כוללים שימוש בטכניקות perifusion, Ca 2 + הדמיה (עם Fura2), והשעתוק ההפוך PCR, בין יתר 11.
איור 1. סיכום של cannulation של צינור המרה.
איור 2. מראה אופייני של איוני C57BL / 6 בבידוד 24 השעות הבאים. תמונות נרכשו במיקרוסקופ בהגדלה של 40X verted.
איור 3. הפרשת גלוקוז מגורה אינסולין של C57BL / 6 איונים. בבידוד 24 שעות הבאים, 100 איונים הודגרו בצלחת 12-היטב לשעה 1 ב 37 ° C בקרבס-רינגר פתרון HEPES נאגר מכיל גלוקוז 2.5 מ"מ. איונים אז הועברו לHEPES קרבס-Ringer בגלוקוז 2.5 מ"מ עבור שעות נוספות, אחרי שsupernatant נאסף למדידת אינסולין באמצעות assay שני אתר immunospecific אנזים צמוד immunosorbent (ELISA) (קריסטל כימי). אותם האיים הועברו לאחר מכן לקרבס-רינגר פתרון HEPES נאגר מכיל גלוקוז 25 מ"מ, ושחרור אינסולין לתוך המדיום נמדד באמצעות ELISA לאחר שעת 1 של דגירה.
Discussion
בפרוטוקול זה, יש לנו תארתי ההליך שלנו לcannulation, זלוף collagenase, והניתוק של הלבלב העכברי, במטרה לבודד את האיים לנגרהנס. מבחינה טכנית, בשיטה שלנו, שלט בפעם אחת, צריכה לאפשר לבידוד לבלב בתוך 4 דקות של הרדמת חסד בבעלי החיים ועל ידי 1 שעה צריכה לגרום לבידודה של איים מחיה אחת. המהירות של הטכניקה מאפשרת לנו לבודד מאיונים עד 12 עכברים בקטע אופייני, ובכך וכתוצאה מכך הבידוד של עד 3,000 איים.
בניגוד לפרוטוקולים אחרים המשתמשים בתכשירים גסים של collagenase, הפרוטוקול שלנו כולל את השימוש של פרוטאזות מטוהרות, CI האנזים הזה collagenase תואר שני וProtease BP CI האנזים הזה. סטיות בעקביות מהיערכות TDE כי הם זמינים מסחריים דורשות שכל מגרש להיבדק בנפרד ומותאם מראש לשימוש כללי. השתנות זו הרבה להרבה הובילה אותנו לשקול שימוש בפוריםTDES fied מVitaCyte. TDES אלה מטוהרים מאוד מתאפיינים במספר שיטות לרבות השימוש במבחני מצע רגישים פלואורסצנטי שכותרתו. Assay CDA פלואורסצנטי רגיש יותר לצורות מולקולריות שונות של collagenase כי יש קינטיקה שונה בקולגן הטבעי המשפיל. מבחני המצע פפטיד הסטוריים מספקים הערכה חסרה של collagenase. אפיון collagenase ידי מספר שיטות מבטיחה פעילות אנזים גדולה יותר בין מגרשים.
בהתבסס על הבדיקה בבית שלנו תוך שימוש במגוון של תכשירי collagenase הזמינים מסחרי, מצא כי שילובי אנזים מטוהרי ניב תוצאות לשעתק הרבה להרבה. היתרונות העיקריים של שימוש TDES מטוהר מאוד ומאופיין בקפדנות ביישום זה פעם אחת בהרכב האנזים האופטימלי מוגדרים, עקביות ביצועים הרבה להרבה מובטחת. עקביות זו מבטלת את תהליך העבודה האינטנסיבית של הסמכה הנדרשת בדרך כלל הרבהלמוצרי collagenase גולמי או מועשרים. TDES המטוהר גם לאפשר שינויים נוספים בהרכב על מנת לשפר את התפוקה והאיכות של איונים התאוששו מזנים שונים של עכברים. דיווח קומפוזיציות אנזים אופטימליות לבידוד של איים מזנים שונים של עכברים יכול להיות מועבר בצורה יעילה יותר. זה, בתורו, מוביל לשימוש יעיל יותר במשאבים וגמישות משופרת בעיצוב ניסיוני.
יש הרבה שלבים קריטיים שיכול להשפיע על התוצאה של בידודי איון באמצעות הפרוטוקול שלנו. הראשון הוא הצורך להשיג אינפלציה יעילה של הלבלב בטפטוף של הכנת האנזים. זה חשוב להתחיל אינפלציה בכוח עדין על המזרק, ולהגדיל את הכח כהתנפחות הלבלב. זה מועיל כדי להעביר את המעיים ולהרים את הלבלב באינפלציה כך שcollagenase perfuses כל האיברים. שלב קריטי נוסף הוא הכח שבעזרתו לוחץ הצינורות afteדגירת r על 37 מעלות צלזיוס (שלב 2.2). אנחנו גילינו שרועדים בלבלב קשה נגד הכובע של הצינור גורם לפיצול של איונים, אך ללא כל צורה של ניתוק מכאני בשלב זה, תשואות איון יכולות לנפול באופן דרמטי. זה גם הכרחי כי במהלך שלב הניתוק עם המזרק (שלב 2.5), כוח רמה בינונית מיושם במהלך התנועה מעלה ומטה עם הבוכנה; זה מבטיח ניתוק רקמות נאות לפני שלב הסינון (2.6), שבו מעט מאוד רקמה יש לשמור על מסנן מסננת התה. לבסוף, השלב האחרון הוא לעקוב בזהירות את שאיפתם של 20 המ"ל כל מהאיים המופרדים histopaque. למרות שאיים הם בדרך כלל בממשק של histopaque וHBSS, מצאתי שאנחנו מאבדים איונים כאשר אנו מנסים להסיר רק את הממשק, במקום זאת, אנחנו עכשיו להסיר את כל 20 המ"ל באמצעות נשא pipet מ"ל גדול 25. אנחנו הוספנו סינון דרך המסנן ההפוך 70 מיקרומטר (שלב 2.11) לבטל את הצורך לגentrifuge האיים שוב ושוב כדי לשטוף את histopaque.
Disclosures
NDS, יום שבת, ואין לי מה RGM לחשוף. AGB המחבר הוא מועסק על ידי VitaCyte. המחבר RCM יש עניין בעלות בVitaCyte.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH R01 מענקי DK060581, R01 DK083583 (שניהם לRGM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
|||||||||||
References
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. Experience of islet isolation without neutral protease supplementation. Islets. 2, 278-282 (2010).
- Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation. Cell Transplant. , Forthcoming (2012).
- McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation. Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).
- Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets. Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).
- Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting. Transplantation. 51, 566-570 (1991).
- McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3, 144-149 (2011).
- Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment. Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).
- Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure. Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).
