Summary
En detaljeret beskrivelse af muse ø-isolering er beskrevet anvendelse af teknikken af in situ pancreatisk ductal kanylering og perfusion af en kombination af renset collagenase og neutral protease.
Abstract
Afhøring af beta-celle genekspression og funktion in vitro har holdent flyttet over årene fra undersøgelsen af gnaver tumorfremkaldende cellelinier til studiet af isolerede gnaver øer. Primære holme tilbyde den klare fordel, at de mere retvisende billede af biologi intracellulære signalveje og sekretoriske svar. I metoden til ø-isolation ved hjælp af væv dissocierende enzym (TDE) præparater har været veletableret i mange laboratorier 1-4, variationer i konsistens af ø udbytte og kvalitet fra en given gnaver stamme begrænse omfanget og gennemførligheden af primær ø undersøgelser. Disse variationer forekommer ofte som et resultat af de rå delvist oprensede TDES anvendes i ø-isoleringsprocedure, TDES ofte udviser parti-til-parti forskelle i aktivitet og kræver ofte tilpasninger af den anvendte dosis af enzym. Et lille antal rapporter har brugt renset TDES for gnavere celle isolationer 5, 6 7, 8, hvor TDES er perfunderes direkte i pancreas-kanalen hos mus, efterfulgt af rå væv fraktionering gennem en Histopaque gradient 9, og isolering af oprenset øer. En væsentlig forskel i vores protokol er anvendelsen af renset collagenase (CI zyme MA) og neutral protease (CI zyme BP) kombination. Collagenase blev karakteriseret ved anvendelse af en 6 fluorescens collagen nedbrydende aktivitet (CDA) assay, der anvendes fluorescensmærkede opløselige kalveskind fibriller som substratet 6. Dette substrat er mere prædiktiv for kinetikken af kollagennedbrydning i vævsmatrixen, fordi den er afhængig af nativt collagen som substratet. Proteasen blev characterized med en følsom fluorescerende kinetisk assay 10. Udnytte disse forbedrede assays sammen med mere traditionel biokemisk analyse gør det muligt TDE, der skal fremstilles mere konsekvent, hvilket fører til forbedret ydelse konsistens mellem partier. Protokollen beskrevet her blev optimeret for maksimal ø-udbytte og optimal ø-morfologi ved hjælp af C57BL / 6 mus. Under udviklingen af denne protokol, blev flere kombinationer af collagenase og neutrale proteaser evalueret i forskellige koncentrationer, og den endelige forhold mellem collagenase: neutral protease af 35:10 repræsenterer enzymydeevne sammenlignes med Sigma Type XI. Fordi betydelig variation i gennemsnit ø-udbytter fra forskellige stammer af rotter og mus er blevet rapporteret, bør yderligere modifikationer af TDE præparatet bringes til at forbedre udbytte og kvalitet af øer udvundet fra forskellige arter og stammer.
Protocol
A. Nødvendige materialer: Se tabel 1 (reagenser) før tilberedning
- HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% penicillin / streptomycin (opbevares i køleskab eller opbevares på is).
- 20% BSA stock fremstilles i vand og alikvoteret og opbevaret ved -20 ° C.
- HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA endelige koncentrationer på 0,3%)
- Islet medium: RPMI + 10% FBS + 1% glutamin + 1% penicillin / streptomycin
- Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque
- 4-0 Sutur (McKesson): skåret i 2 ¾ cm stykker og opbevaret i en 10 cm petriskål
- Instrumenter: Bøj tangen fra fin Science Tools til 90 °, og fil ned de takkede tænder af alle tre par af tang. Målet er at sløve tænderne, ikke at fjerne dem.
- Tungeholder til administration af collagenase / protease blanding: 27G ½ i. nål, 30 ½ i.nål, PE50 rør skæres i 12 in stykker. Fil begge nåle ned til en glat afrundet ende, som ikke har nogen skarpe kanter. Sæt 27G nål i den ene ende af en 12 tommer stykke PE50 rør. Fjern 30G nål fra huset ved at smadre huset med en tang, dreje huset ¼ drej hver gang. Fjern nålen med tang fra huset, og sæt det ind i den anden ende af PE50 rør under en dissektion mikroskop. Vær sikker på at ikke knækkes slangen, når du sætter nålen i PE50 rør. Den 27G nål er slutningen, at du vil vedhæfte sprøjten af collagenase.
- Collagenase (CI liserede enzym MA) og Neutral Protease (CI liserede enzym BP). Opløs TDE ifølge producentens anvisninger. Der henvises til partiet specifikke Certificate of Analysis at beregne enzymaktiviteten koncentration. Overfør i alt 350.000 collagen nedbrydende aktivitet (CDA) enheder af den rekonstituerede collagenase og 100.000 neutral protease enheder af reconstitudloddet BP Protease til et konisk rør, og der fortyndes til 15 ml i alt i HBSS (P / S)
B. Step-by-Step protokol
1. Oppustning af Pancreas med collagenase / Protease Blanding
- Aflive mus ved cervical dislokation, mætte muse torso med 70% EtOH, åbne bughulen helt fra anus til membranen med eventuelle dissektion saks og pincet.
- Placer musen på platformen af en dissektion mikroskop.
- Træk caecum og colon ascendens ud og sætte dem uden for kroppen hulrum til venstre. Se figur 1 for en oversigt over de følgende trin.
- Placere fligene i leveren mod membranen, og de skal forblive der, hvis kropskaviteten er åben langt nok. Find den hepatiske arterie, portal vene og galdegang bundt fører ind i leveren ved at tage fat i duodenum med buede pincet. Med et andet par krumme pincet, når under arterie, vene, og kanalen bundle og træk en 2 ¾ i. stykke 4-0 sutur under arterie, vene, galdegang og binde det én gang og stram den så tæt på leveren som muligt.
- Ved hjælp af to par buede pincet, forsigtigt fat i duodenum og finde galdegang fastgjort til duodenum ved papilla. Brug en tang af pincet til at stikke gennem bugspytkirtlen og bindevæv lige under galdegang tæt på papilla. Poke dine pincet hurtigt gennem organ at lave et hul og derefter sætte begge tænger af tang igennem og få fat i en anden 2 ¾ tomme stykke 4-0 sutur gennem og binde det én gang og trække den til en lille kreds, men IKKE træk sammen.
- Skift til de 90 ° pincet og til Superfine Vannas saks. Med de 90 ° pincet, klemmes forsigtigt og træk tyndtarmen, indtil galdegang er stram. Gør én vandret snit på tværs af papilla med saksen ved at stikke de åbne saks ind i tarmen og derefter skære med én bevægelse. Prøv at kun gøre one går på tværs af papilla uden løs galdegang fra papilla.
- Mens du stadig holder tarmen med de 90 ° pincet, skal du indsætte kanylen ind i galdegangen op til halvdelen af længden af galdegang, og træk derefter forsigtigt sutur stramt omkring kanylen.
- Fyld en 3 ml sprøjte med 2,0 ml collagenase / protease blanding og indsprøjtes i kanylen ved en langsom, konstant hastighed.
- Efter oppustning af pancreas er afsluttet, fjernes kanylen fra galdegangen og bruge de buede pincet og buede fjeder saks til at fjerne den oppustede pancreas ved at starte den nedadgående kolon og snipping bindevævet, som man trækker tarmene op. Fortsæt med at fjerne bugspytkirtlen fra tarmene, indtil du når galdegang, og fjern derefter bugspytkirtlen fra milten, så maven og derefter fra indvoldene af bughulen. Afslut fjernelse ved at klippe væk suturerne. Tilsæt pancreas til et 50 ml rør indeholdende 5 ml HBSS(P / S). Dette rør skal være på is.
- Gentage proceduren ovenfor for hvert dyr op til fire dyr. For at opnå optimale resultater, dissocierer kun fire pancreas på én gang. Typisk, medens de første fire er i 37 ° C vandbad, vi oppustning yderligere fire pancreas.
2. Pancreas Dissociation
- Placere 50 ml rør indeholdende pancreas til et 37 ° C vandbad i 15 min.
- Vip forsigtigt glasset og tjek for væv dissociation, skal du sørge væv kommer let fra hinanden, så hvirvel rørene 12 gange, mens du holder røret af låget.
- Tilføj ikke mere end 30 ml HBSS (BSA) (dette kan være et lavere beløb, afhængigt af hvor meget skal afveje rørene for centrifugeringstrin), og centrifuger ved 290 xg for én min.
- Aspirer supernatanten forsigtigt og efterlade en lille mængde supernatant (2-3 ml) ved bunden, således at ikke forstyrre cellepelleten.
- Anvendelse af en 30 ml sprøjte Attached til 14G nål, tilføje højst 10 ml HBSS (BSA), og der opsuges suspensionen op og ned 2 gange.
- Filtrere celleblandingen via en plast tesi i et 50 ml rør og skylles med en anden 10 ml HBSS (BSA).
- Centrifuger ved 330 x g i 2 min.
- Dekanter supernatanten og vendes rør til at dræne på en absorberende papirserviet i 1 min.
- Resuspender hvert rør i 10 ml kold 1100 HISTOPAQUE.
- Overlejrer HISTOPAQUE med 10 ml HBSS (BSA) og centrifuger ved 900 x g i 18 min.
- Fjerne hele 20 ml supernatant under anvendelse af en stor boring 25 ml pipette og passerer supernatanten gennem en omvendt 70 um filter.
- Skyl holme i en 10 cm petriskål ved pipettering 10 ml ø-medier gennem filteret, mens du holder den højre side op over skålen.
- Kultur øerne i en 37 ° C, 5% CO2 vævsdyrkningsinkubator indtil den er klar til forsøg. Typisk er holme håndplukket og talt før experimentation.
3. Repræsentative resultater
Islet udbytter, morfologi, og kvalitet er de generelle parametre, der anvendes til at bedømme succesen af ø isolation. I vores hænder, er ø-udbytter fra det gennemsnitlige C57BL / 6 mus i intervallet 150-250 holme ved hjælp af denne protokol (se tabel 2), og er sammenlignelige med data indsamlet ved hjælp af optimeret Sigma type XI collagenase. Imidlertid kan udbyttet variere afhængigt af musen anvendte stamme og alder musen. De fleste af de dyr, vi anvender, er i 8-16 uger aldersgruppe Denne protokol er blevet testet på flere musestammer, herunder C57BL / 6 (180-250 øer / mus), CD1 (200-300 øer / mus), 129 / B6 (200-300 øer / mus), BLKS-db/db (120-200 øer / mus), NOD (10 uger gamle, 100-150 øer / mus) og NOD-SCID (100-150 øer / mus ). Typisk ø-morfologi er vist i figur 2, i hvilken øer har en rund til aflang tablet med forholdsvis ensartet størrelse (selv om størrelsen uniformity kan variere fra stamme til stamme). Figur 3 viser vores typisk analyse af glucose-stimuleret insulinsekretion fra C57BL / 6 mus isolerede øer anvendelse af oprensede TDES vs Sigma Type XI collagenase. Typisk er en høj kvalitet ø forberedelse resulterer i en insulinstimulering med 25 mM glucose, der er 6-20 gange større end ved 2,5 mM glucose. Andre anvendelser kan også anvendes til at teste kvaliteten af isolerede øer, og disse indbefatter anvendelse af perifusion teknikker, Ca2 + billeddannelse (med fura2), og revers transskription PCR, bl.a. 11.
Figur 1. En sammenfatning af kanylering af galdegangen.
Figur 2. Typisk udseende af C57BL / 6 holme ved 24 HR efter isolation. Billederne blev optaget på et inomsættes mikroskop ved 40X forstørrelse.
Figur 3. Glucose-stimuleret insulinsekretion i C57BL / 6 øvævsceller. Ved 24 timer efter isolering, blev 100 øvævsceller inkuberet i en 12-brønds skål i 1 time ved 37 ° C i Krebs-Ringer HEPES-pufret opløsning indeholdende 2,5 mM glucose. Øvævsceller blev herefter overført til Krebs-Ringer HEPES ved 2,5 mM glucose i yderligere time, hvorefter supernatanten blev opsamlet for insulin måling under anvendelse af et to-site immunspecifikke enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) (Crystal Chem). De samme øvævsceller blev efterfølgende overført til Krebs-Ringer HEPES-pufret opløsning indeholdende 25 mM glucose, og insulin i mediet blev målt ved ELISA efter 1 timers inkubation.
Discussion
I denne protokol har vi beskrevet vores procedure til kanylering, collagenaseperfusion og dissociation af den murine pancreas, med det formål at isolere de Langerhansske øer. Teknisk set vores metode, når mestrer, bør give mulighed for bugspytkirtlen isolation inden 4 min til euthanizing dyret, og med 1 time bør resultere i isolation af øer fra et enkelt dyr. Hurtigheden af teknikken gør det muligt at isolere øer fra op til 12 mus i en typisk strækning, hvilket resulterer i isoleringen af op til 3.000 øvævsceller.
I modsætning til andre protokoller, der bruger rå præparater af collagenase tilbyder vores protokol anvendelse af oprensede proteaser, CI liserede enzym Collagenase Ma og CI liserede enzym BP protease. Variationer i sammenhængen i TDE præparater, der er kommercielt tilgængelige kræver, at hvert parti individuelt testet og optimeret forud for almindelig anvendelse. Dette parti-til-parti variation førte os til at overveje brugen af puricerede TDES fra VitaCyte. Disse højt oprensede TDES er karakteriseret ved flere metoder, herunder anvendelse af følsomme fluorescerende mærket substrat assays. Fluorescensen CDA assay er mere følsomt over for forskellige molekylære former for collagenase, som har forskellige kinetik på nedbrydning nativt collagen. Historiske peptidsubstrat assays giver en ufuldstændig vurdering af collagenase. Karakterisering af collagenase ved flere metoder sikrer en større enzymaktivitet mellem partier.
Baseret på vores in-house test under anvendelse af forskellige collagenase præparater kommercielt tilgængelige, fandt vi, at det oprensede enzym kombinationer gav reproducerbare parti-til-parti resultater. De største fordele ved at anvende højt oprensede og grundigt karakteriseret TDES i denne ansøgning, er, når den optimale enzymsammensætning er defineret, er parti-til-parti ydeevne konsistens sikret. Denne sammenhæng eliminerer arbejdskrævende proces af parti kvalifikation kræves normaltfor rå eller beriget collagenase produkter. Oprensede TDES også aktivere flere modifikationer af sammensætningen for at forbedre udbyttet og kvaliteten af øer udvundet fra forskellige musestammer. Rapportering optimale enzym-sammensætninger til isolering af øer fra forskellige musestammer kan gennemføres mere effektivt kommunikeres. Dette vil igen fører til mere produktiv brug af ressourcer og øget fleksibilitet på eksperimentel design.
Der er mange kritiske trin, der kan påvirke udfaldet af ø-isoleringer ved hjælp af vores protokol. Den første er behovet for at opnå effektiv inflation i bugspytkirtlen under perfusion af enzympræparatet. Det er vigtigt at starte inflationen med blid kraft på sprøjten, og øge kraften som bugspytkirtlen pustes op. Det er nyttigt at flytte tarmene og løft pancreas under oppustning, således at collagenase gennemløber vævet hele organet. Et andet kritisk trin er den kraft, hvormed man ryster rørene after inkubation ved 37 ° C (trin 2.2). Vi har fundet, at ryste bugspytkirtlen hårdt mod hætten af røret skaber et fragmenteret holme, men uden nogen form for mekanisk dissociation på dette trin, kan ø-udbytter falde drastisk. Det er også afgørende, at der under dissociationstrinnet med sprøjten (trin 2,5), er en mellemstor niveau kraft, der påføres under op-og nedadgående bevægelse med stemplet, hvilket sikrer en tilstrækkelig væv dissociation før filtreringstrinnet (2,6), hvor meget lidt væv bør bevares på tesi filter. Endelig er den sidste skridt til at følge nøje er aspiration af hele 20 ml af de HISTOPAQUE fraktionerede holme. Selv øer er typisk ved grænsefladen af HISTOPAQUE og HBSS, har vi fundet, at vi mister øvævsceller, når vi forsøger at fjerne kun grænsefladen, men i stedet vi nu fjerne hele 20 ml under anvendelse af en stor boring 25 ml pipette. Vi tilføjet filtrering gennem de omvendte 70 um filter (trin 2.11) for at eliminere behovet for at centrifuge øerne flere gange for at vaske væk HISTOPAQUE.
Disclosures
NDS, SAT, og RGM har intet at afsløre. Forfatter AGB er ansat af VitaCyte. Forfatter RCM har en ejerandel i VitaCyte.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet delvist af NIH tilskud R01 DK060581, R01 DK083583 (begge til RGM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
|||||||||||
References
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. Experience of islet isolation without neutral protease supplementation. Islets. 2, 278-282 (2010).
- Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation. Cell Transplant. , Forthcoming (2012).
- McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation. Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).
- Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets. Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).
- Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting. Transplantation. 51, 566-570 (1991).
- McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3, 144-149 (2011).
- Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment. Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).
- Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure. Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).
