Summary
마우스 작은 섬 격리에 대한 자세한 설명은 collagenase와 중성 단백 분해 효소를 정제의 조합의 현장 췌장 ductal cannulation 및 재관류에의 기술을 사용하여 설명되어 있습니다.
Abstract
베타 세포 유전자 발현과 체외에서 함수의 심문은 정면 쥐 tumorigenic 세포 라인의 연구에서 격리 된 쥐 섬의 연구에 년 동안 이동했다. 차 섬은 더 충실하게 세포 신호 경로와 분비 응답의 생물학을 반영하는 독특한 장점을 제공합니다. 조직 dissociating 효소 (TDE) 준비를 사용하여 작은 섬 고립의 방법이 잘 많은 실험실 1-4 년에 설립 된 반면, 특정 쥐 변형의 작은 섬 수율과 품질의 일관성의 변화는 범위와 주요 췌장 연구의 가능성을 제한 할 수 있습니다. 이러한 변화는 종종 작은 섬 격리 절차에 사용되는 원유 부분적으로 정화 TDEs의 결과로 발생, 자주 활동에 많은 - 투 - 많은 유사 전시하고 자주 사용되는 효소의 복용에 조정을 필요로 TDEs. 보고서의 소수의 쥐 세포 isolations에 대한 TDEs 5, 6을 정화 사용한 7, 8,에 의해 설명이에 따라 수정 마우스 작은 섬 절연 프로토콜을 개발 Histopaque 그라디언트 9, 섬을 정화의 고립. 우리 프로토콜의 중요한 차이는 정화 collagenase (CI 효소 MA)과 중성 단백 분해 효소 (CI 효소 BP) 조합의 사용이다. collagenase는 기판 6과 같은 휘황이라는 수용성 종아리 피부 원 섬유를 활용 6 형광의 콜라겐 굴욕 활동 (CDA) 분석의 사용에 의해 특징되었습니다. 이 기판으로 고유의 콜라겐에 의존하기 때문에 기판은 조직 매트릭스 콜라겐 저하의 동력학을 더 예측입니다. 단백 분해 효소는 채널이었습니다민감한 형광 운동 검정 10을 aracterized. 더 전통적인 생화학 분석과 함께 이러한 향상된 assays을 활용하면 TDE이 많은 사이의 향상된 성능의 일관성로 이어지는 더 일관되게 제조 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 C57BL / 6 마우스를 사용하여 최대 작은 섬 수율과 최적의 작은 섬의 형태에 최적화되었습니다. 이 프로토콜의 개발 기간 동안, collagenase하고 중립적 인 프로테아제의 여러 조합은 서로 다른 농도로 평가하고, collagenase의 최종 비율되었습니다 35:10의 중립 프로테아제는 시그마 타입 XI 비교 효소 성능을 나타냅니다. 쥐와 생쥐의 다른 변종의 평균 작은 섬 수율에 큰 변화가보고 되었기 때문에, TDE 구성의 추가 수정은 다른 종과 변종에서 발견 섬의 수율과 품질을 향상시키기 위해하여야한다.
Protocol
A. 재료는 필요 : 표 1 (시약)을 참조하십시오 준비하기 전에
- HBSS (P / S) : 100 ML 10X HBSS + 900 ML H 2 0 + 1% 페니실린 / 스트렙토 마이신 (냉장고에 보관하거나 얼음에 보관).
- 20% BSA의 재고가 물에 만들어 aliquoted 및 -20 ° C.에 저장됩니다
- HBSS (BSA) : 200 ML 1X HBSS (P / S) 20 % BSA의 + 3 ML (최종 BSA 농도는 0.3 %이다)
- 작은 섬 매체 : RPMI + 10% FBS + 1 % 글루타민 + 1퍼센트 페니실린 / 스트렙토 마이신
- Histopaque 1100 : 240 ML 1119 Histopaque + 200 ML 1077 Histopaque
- 4-0 봉합사 (McKesson)는 2 ¾ 인치 조각으로 잘라 10cm 페트리 접시에 저장
- 악기 : 90 °로 정밀 과학 도구에서 포셉을 잡아봐하고, 포셉의 세 쌍의 톱니 모양의 이빨 아래 파일. 목표는 그들을 제거하지, 지루 치아에 있습니다.
- collagenase / 단백 분해 효소 혼합물의 관리에 대한 캐뉼라 : 27G ½ 바늘 인치, 30 ½ 인치바늘, PE50 튜브는 조각 인치 12로 자른다. 더 날카로운 모서리가없는 부드러운 둥근 끝을 모두 바늘을 제출하십시오. PE50 튜브의 일부 인치 (12)의 한쪽 끝으로 27G 바늘을 삽입합니다. 케이스를 돌려, 펜치 한 쌍의 케이스 장애물을하여 케이스에서 30g의 바늘을 제거 ¼ 때마다 켜십시오. 케이스에서 플라이어로 바늘을 제거하고 분해 현미경으로 PE50 튜브의 다른 쪽 끝을에 삽입. 당신은 PE50 튜브에 바늘을 삽입로 튜브를 비틀 수 없습니다해야합니다. 27G 바늘은 collagenase의 주사기를 첨부 될 수있는 끝입니다.
- Collagenase (CI 효소 MA) 및 중성 단백 분해 효소 (CI 효소 BP). 제조업체의 지침에 따라 Reconstitute TDE. 효소 활동 농도를 계산하는 분석의 많은 특정 인증서를 참조하십시오. 재구성 collagenase의 350,000 콜라겐 굴욕 활동 (CDA) 단위 및 reconstit 100,000 중립 프로테아제 단위의 총 전송uted BP의 원뿔 튜브에 단백 분해 효소와 HBSS 15 ML 총 (P / S)까지 희석
B. 단계별 프로토콜
1. Collagenase / 단백 분해 효소 혼합물 췌장의 인플레이션
- 자궁 경부 전위가 마우스를 안락사시켜야, 70 % EtOH, 모든 해부 가위와 집게로 완전히 항문에서 다이어프램에 영업 복강으로 마우스 몸통을 포화.
- 해부 현미경의 플랫폼에서 마우스를 놓습니다.
- 맹장과 오름차순 콜론을 당겨하고 왼쪽으로 뱃속 바깥으로 설정합니다. 다음 단계에 대한 요약 그림 1을 참조하십시오.
- 횡경막을 간 엽 (叶)을 배치하고, 뱃속이 정도면 열려 있으면 사람들이 유지됩니다. 간장 동맥, 포털 정맥과 곡선 포셉과 십이지장을 그립하여 간으로 주요 담즙 덕트 번들을 찾습니다. 곡선 포셉의 다른 쌍의 동맥, 정맥 아래에 도달하고, 덕트 부ndle과 동맥, 정맥, 담즙 덕트에 따라 4-0 봉합의 일부 인치 ¾ 2를 당겨 한 번에 묶어 가능한 간 가까이로 세게 당겨.
- 곡선 포셉의 두 쌍을 사용하여 조심스럽게 십이지장을 움켜 잡고 유두에서 십이지장에 부착 된 담즙 덕트를 찾으십시오. 유두에 담즙 덕트 가까이 아래의 췌장 및 결합 조직 오른쪽을 찌를 포셉의 통을 사용합니다. 구멍을 만들기 위해 기관을 통해 신속하게 포셉을 찔러 후 포셉의 두 집게을 통해 넣어 4-0 봉합의 다른 2 ¾ 인치 조각을 움켜을 통해하고 묶어 한 번, 작은 원으로 당겨하지만, 꼭 당기지 마십시오.
- 90 °의 집게와 극상의의 Vannas 가위로 변경합니다. 90 °의 집게로 조심스럽게 찔러과 담즙 덕트의 긴장 늦추지 때까지 소장을 당긴다. 장에 오픈 가위를 배신하고 다음 하나 모션으로 절단하여 가위로 유두 건너 수평 몫을합니다. 만 O 만들려고NE는 유두에서 담즙 덕트를 dislodging 않고 유두을 가로 질러.
- 여전히 90 °의 집게로 장을 들고 있지만, 담즙 덕트의 절반 길이까지 담즙 덕트에 캐뉼라를 삽입하고 부드럽게 캐뉼라 주변 단단히 봉합를 당깁니다.
- collagenase / 단백 분해 효소 혼합물의 2.0 ML로 3 ML의 주사기를 작성하고, 천천히 일정한 속도로 캐뉼라로 주입.
- 췌장의 인플레이션이 완료되면 담즙 덕트에서 캐뉼라를 제거하고 내림차순 콜론에서 시작하고 장내를 끌어로 결합 조직을 snipping 의해 부풀려 췌장을 제거하는 곡선 포셉과 곡선 봄 가위를 사용합니다. 당신이 담즙 덕트에 도달 할 때까지 장내에서 췌장을 제거하려면 계속 다음, 다음, 비장에서 배를 췌장을 제거하고 복강의 내장에서. 봉합을 멀리 snipping 의해 제거를 완료합니다. HBSS의 5 ML을 포함하는 50 ML 튜브에 췌장을 추가(P / S). 이 관은 얼음에 있어야합니다.
- 최대 네 동물에 대한 각 동물에 대한 위의 절차를 반복합니다. 최적의 결과를 얻으려면 한 번에 네 개의 pancreata을 떼어 놓다. 처음 네는 37 ° C의 물을 욕조에있는 동안 일반적으로, 우리는 다른 네 pancreata보다 높게 나타났습니다.
2. 췌장 분리
- 15 분에 37 ° C의 물을 욕조에 pancreata를 포함하는 50 ML 튜브를 놓습니다.
- 부드럽게 튜브를 흔들와 조직 분리를 확인하면 뚜껑으로 튜브를 잡고있는 동안 조직은 튜브에게 소용돌이 다음, 쉽게 분해 12 회 제공해야합니다.
- 한 분을위한 290 XG에서 더 이상 30 HBSS (BSA) (이 원심 분리 단계의 튜브 균형을 필요 정도에 따라 더 낮은 금액 일 수)의 ML, 그리고 원심 분리기를 추가합니다.
- 조심스럽게 표면에 뜨는을 기음과 세포 펠렛을 방해하지 할만큼 하단에있는 표면에 뜨는 (2-3 ML)의 작은 금액을 둡니다.
- 30 ML 주사기 attac를 사용하여14G 바늘로 쓰인, HBSS (BSA)의 10 개 이상 ML을 추가하고 2 번을 정지를 대기음합니다.
- 50 ML 튜브에 플라스틱 차 스트레이너를 통해 세포 혼합물을 필터링하고 다른 10 ML HBSS (BSA)과 헹굼.
- 2 분 330 XG에 원심 분리기.
- 가만히 따르다의 표면에 뜨는 1 분에 흡수 종이 타월에 물기를하기 위해 튜브를 반전.
- 10 ML 추위 1,100 histopaque 각 관을 Resuspend.
- 10 ML HBSS (BSA)와 histopaque을 입혀 18 분 동안 900 XG에 원심 분리기.
- 큰 구멍 25 ML의 pipet을 사용하여 표면에 뜨는 전체 20 ML를 제거하고 필터 역 70 μm을 통해 표면에 뜨는을 전달합니다.
- 요리를 통해서 오른쪽을 누른 상태에서 필터를 통해 10 ML의 작은 섬 미디어를 pipetting하여 10cm 페트리 접시에 섬을 씻어.
- 실험 준비가 될 때까지 문화 37 ° C, 5 % CO 2 조직 문화 인큐베이터에있는 섬입니다. 일반적으로 섬은 손으로 선택되고 이전 exper을 계산imentation.
3. 대표 결과
작은 섬 생산량, 형태, 및 품질이 작은 섬 고립의 성공을 판단하는 데 사용되는 일반적인 매개 변수입니다. 손에서 평균 C57BL / 6 마우스에서 작은 섬 수율이 프로토콜을 (표 2 참조)를 사용하여 150-250 섬의 범위에 있으며, 최적화 된 시그마 유형 XI collagenase를 사용하여 얻은 데이터를 비교합니다. 그러나 수익률은 사용 마우스 변형 마우스의 연령에 따라 달라질 수 있습니다. 우리가 사용하는 것과 동물의 대부분은 8~16주의 연령 범위에서이 프로토콜은 C57BL / 6 (180-250 섬 / 마우스), CD1 (200-300 섬 / 마우스), 129 / 등의 여러 마우스 종자에서 테스트되었습니다 아르 B6 (200-300 섬 / 마우스), BLKS-db/db (120-200 섬 / 마우스), NOD (10 주 된, 100-150 섬 / 마우스), 그리고 NOD-SCID (100-150 섬 / 마우스 ). 일반적인 작은 섬의 형태가 (섬은 비교적 균일 한 크기와 모양을 직사각형 할 수있는 원형을 보유하고있는, 그림 2에 표시되어 있습니다 크기 unif이기는하지만ormity)는 잡아 당기 부담 다를 수 있습니다. 그림 3은 정화 TDEs 대 시그마를 입력 XI의 collagenase를 사용하여 C57BL / 6 마우스 절연 섬에서 포도당 자극 인슐린 분비 우리의 일반적인 분석을 보여줍니다. 일반적으로, 2.5 MM 포도당에서 관찰보다 6-20 배 큰 25 mm까지 포도당에서 인슐린 자극에 고품질의 작은 섬 준비 결과입니다. 다른 응용 프로그램은 격리 된 섬의 품질을 테스트하는 데 사용하고, 이것들은 perifusion 기술, 다른 11 중 칼슘 2 + 영상 (Fura2 포함) 및 역방향 전사 PCR의 사용을 포함 할 수 있습니다.
1 그림. 담즙 덕트의 cannulation의 요약입니다.
그림 2. 24 시간 다음 고립에서 C57BL / 6 섬의 전형적인 모습. 이미지의에서 획득 된40X 배율의 현미경 verted.
그림 3. C57BL / 6 섬의 포도당 자극 인슐린 분비. 24 시간 다음 고립에서, 100 섬이 37 2.5 MM 포도당을 포함 Krebs - 벨소리에서 ° C HEPES 버퍼 솔루션에서 1 시간에 12 잘 접시에 incubated되었습니다. 섬은 다음 두 사이트 immunospecific 효소 결합 면역 분석 (엘리사) (크리스탈 화학)를 사용하여 표면에 뜨는는 인슐린 측정을 위해 수집 된 후 추가 시간에 대해 2.5 MM 포도당에 Krebs-벨소리 HEPES로 전송되었습니다. 같은 섬은 이후 25 MM 포도당을 포함 Krebs-벨소리 HEPES 버퍼 솔루션에 전송되었고, 매체에 인슐린 릴리스는 부화의 1 시간 후 엘리사에 의해 측정되었다.
Discussion
이 프로토콜에서는, 우리는 Langerhans의 섬을 분리의 목적으로, cannulation, collagenase 재관류 및 손쥐 췌장의 분리에 대한 절차를 설명하고 있습니다. 기술적으로, 우리의 방법은 한번 습득, 동물을 euthanizing의 4 분 이내에 췌장 절연을 허용하고, 1 시간에 하나의 동물에서 섬의 고립을 초래할 것입니다. 기술의 급속은 우리가 따라서 최대 3000 섬까지 격리의 결과로, 최대의 전형적인 스트레치 12 마우스로 섬을 분리 할 수 있습니다.
collagenase의 원유 준비를 사용하는 다른 프로토콜과는 달리, 우리의 프로토콜은 정화 프로테아제, CI 효소 Collagenase MA 및 CI 효소 BP 프로테아제의 사용을 제공합니다. 상업적으로 사용할 수있는 TDE 준비의 일관성의 변화는 각이 많이 개별적으로 일반적인 사용하기 전에 테스트 및 최적화 할 것을 요구합니다. 이 많은 - 투 - 많은 다양성은 우리가 푸리의 사용을 고려했다VitaCyte에서 fied TDEs. 이러한 고도의 정화 TDEs은 민감한 형광 표시 기판 assays의 사용 등 다양한 방법으로 특징을 가지고 있습니다. 형광 CDA 분석이 저하 원래 콜라겐에서 다른 동력학을 collagenase의 다른 분자 형태에 더 민감하다. 역사 펩타이드 기판 assays는 collagenase의 불완전 평가를 제공합니다. 여러 방법으로 collagenase를 특성화하는 것은 많은 사이의 큰 효소의 활동을 보장합니다.
상업적으로 이용 가능한 collagenase를 준비 다양한를 사용하여 자체 테스트를 바탕으로, 우리는 정화 효소 조합 재현 많은 - 투 - 많은 결과를 굴복 것으로 나타났습니다. 이 응용 프로그램에서 높은 정화되고 엄격 특징 TDEs을 사용하여의 주요 장점은 한 번에 최적의 효소 성분이 정의되어 있으며, 많은 - 투 - 많은 성능의 일관성이 보장됩니다. 이 일관성은 일반적으로 필요한 많은 자격의 노동 집약적 프로세스를 제거원유 또는 농축 collagenase 제품에 대한. 정화의 TDEs는 다른 마우스 변종에서 발견 섬의 수율과 품질을 향상시키기 위해 구성의 추가 수정 할 수 있습니다. 마우스의 여러 변종에서 섬의 고립에 대한 최적의 효소 작품을보고는 더 효과적으로 전달 될 수 있습니다. 이것은 결과적으로, 자원 및 실험 디자인 개선 유연성을보다 생산적 사용로 연결됩니다.
우리의 프로토콜을 사용하여 작은 섬 isolations의 결과에 영향을 미칠 수있는 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 효소 준비 재관류 동안 췌장의 효율적인 인플레이션을 달성 할 필요가 있습니다. 이 주사기에 부드러운 힘으로 인플레이션을 시작하고, 췌장의 웃기로 힘을 증가하는 것이 중요합니다. 그것은 창자를 이동하고 collagenase이 전체 오르간을 perfuses 있도록 인플레이션 동안 췌장을 올려 도움이 될 것입니다. 또 다른 중요한 단계는 하나가 튜브 afte을 흔드는되는 힘이다37 ° C (단계 2.2)에서의 R 배양. 우리는 튜브의 캡에 대한 하드 췌장을 흔들어 것은 섬의 분열을 초래하지만이 단계에서 기계적 분리 어떠한 형태없이 작은 섬 수율이 크게 떨어질 수 있다는 것을 발견했습니다. 그것은 주사기 (단계 2.5)로 분리 단계에서, 중간 수준의 힘이 플런저와 위, 아래로 이동하는 동안 적용되는 것 또한 중요합니다,이 필터링 단계 (2.6) 이전에 적절한 조직 분리를 보장 어디로 거의 조직은 차 스트레이너 필터에 보관해야합니다. 마지막으로,주의 깊게 따라야 할 마지막 단계는 histopaque fractionated 섬의 전체 20 ML의 포부입니다. 섬은 histopaque하고 HBSS의 인터페이스에서 일반적이지만, 우리는 인터페이스를 제거하려고 할 때 우리가 섬을 잃고 발견 대신, 우리는 이제 큰 구멍 25 ML의 pipet을 사용하여 전체 20 ML를 제거합니다. 우리는 c에의 필요성을 제거하는 역 70 μm 필터 (단계 2.11)를 통해 여과를 추가histopaque을 멀리 씻어 반복 섬을 entrifuge.
Disclosures
NDS, SAT, 그리고 RGM은 공개 할 수 없어요. 작성자 AGB은 VitaCyte에 의해 고용됩니다. 저자 RCM은 VitaCyte에 소유권 관심이 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 보조금 R01 DK060581, R01 DK083583 (RGM에 모두)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
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References
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