Summary
Uma descrição detalhada de isolamento de ilhotas do rato está descrito por meio da técnica de canulação na pancreático ductal in situ e a perfusão de uma combinação de colagenase purificados e protease neutra.
Abstract
A interrogação da expressão génica em células beta e função in vitro tem esquadria deslocada ao longo dos anos a partir do estudo de linhas celulares de roedores tumorigénicas para o estudo das ilhotas de roedores isoladas. Ilhotas primários oferecem a vantagem de que eles mais reflectem fielmente a biologia das vias de sinalização intracelular e respostas secretoras. Considerando que o método de isolamento de ilhotas de tecido utilizando dissociação enzimática (TDE) preparações foi bem estabelecida em muitos laboratórios de 1-4, as variações na consistência da qualidade e rendimento da ilhota a partir de qualquer estirpe de roedor dado limitar a extensão dos estudos e viabilidade das ilhotas primárias. Estas variações ocorrem frequentemente como uma consequência das TDES bruto parcialmente purificadas utilizadas no procedimento de isolamento de ilhotas; TDES frequentemente exibem de lote para lote, variações na actividade e muitas vezes necessita de ajustes para a dose de enzima utilizada. Um pequeno número de relatórios utilizaram purificado TDES para isolamentos de células de roedores 5, 6 7, 8, em que os TDES são perfundidas directamente para o canal pancreático de ratos, seguido de fraccionamento do tecido cru por meio um gradiente de Histopaque 9, e isolamento de ilhotas purificadas. A diferença significativa no nosso protocolo é a utilização de colagenase purificados (CI zyme MA) e protease neutra combinação (CI zyme BP). A colagenase foi caracterizado através da utilização de um colagénio fluorescência 6 degradante actividade ensaio (CDA), que utilizou etiquetas fluorescentes fibrilas vitela solúvel como substrato pele 6. Este substrato é mais preditiva da cinética de degradação do colagénio na matriz de tecido porque ele depende de colagénio nativo como o substrato. A protease foi characterized com um ensaio fluorescente sensível cinético 10. Utilizando estes ensaios melhoradas juntamente com mais tradicional análise bioquímica habilitar o TDE a ser fabricado de forma mais consistente, levando a consistência melhor desempenho entre os lotes. O protocolo aqui descrito foi optimizada para a produção máxima de ilhotas e morfologia das ilhotas óptima utilizando ratinhos C57BL / 6. Durante o desenvolvimento deste protocolo, várias combinações de colagenase e proteases neutras, foram avaliados em concentrações diferentes, e a razão final de colagenase: a protease neutra de 35:10 representa um desempenho comparável ao da enzima Sigma Tipo XI. Devido variabilidade significativa em rendimentos médios a partir de ilhotas diferentes estirpes de ratos e murganhos foram relatados, modificações adicionais da composição TDE deve ser feito para melhorar o rendimento e qualidade das ilhotas recuperadas a partir de diferentes espécies e estirpes.
Protocol
A. Materiais necessários: Ver Tabela 1 (reagentes), antes da preparação
- HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10x + 900 ml de H 2 0 + 1% de Penicilina / Estreptomicina (armazenado no frigorífico ou mantido em gelo).
- 20% BSA estoque é feito em água e distribuído por alíquotas e guardado a -20 ° C.
- HBSS (ASB): HBSS 1X 200 ml (P / E) + ml de três BSA 20% (concentração finais BSA 0,3%)
- Islet meio: RPMI + 10% FBS + glutamina a 1% + 1% de Penicilina / Estreptomicina
- Histopaque 1100: 240 ml 1119 + 200 ml de Histopaque 1077 Histopaque
- Sutura 4-0 (McKesson): corte em 2 ¾ polegadas peças e armazenados numa placa de 10 cm de Petri
- Instrumentos: dobrar as pinças de Ferramentas Ciência Belas a 90 °, e arquivar as dentes serrilhados de todos os três pares de fórceps. O objetivo é maçante os dentes, para não removê-los.
- Cânula para a administração de colagenase / protease mistura: 27G ½ pol agulha, 30 ½ polagulha, tubo PE50 cortado em pedaços de 12 polegadas. Arquivo ambas as agulhas para baixo para uma extremidade arredondada lisa, que não tem arestas vivas. Insira a agulha de 27G em uma extremidade de um pedaço de 12 polegadas PE50 tubulação. Remover a agulha de 30G a partir do invólucro por esmagamento do invólucro com um par de alicates, transformando o invólucro ¼ de volta de cada vez. Remover a agulha com a pinça do invólucro, e inseri-la na outra extremidade da tubagem PE50 sob um microscópio de dissecação. Certifique-se de não torcer o tubo de como inserir a agulha no tubo PE50. A agulha 27G é o fim que você irá anexar a seringa de colagenase.
- Colagenase (CI zyme MA) e Neutro Protease (CI zyme BP). TDE reconstituir o acordo com as instruções do fabricante. Consulte o Certificado de lote específico de análise para calcular a concentração de atividade enzimática. Transferir um total de 350.000 colágeno degradantes de atividade (CDA) unidades da colagenase reconstituído e 100.000 unidades de protease neutros do reconstitProtease BP buído para um tubo cónico e diluir até ao total de 15 ml em HBSS (P / S)
B. Protocolo Passo-a-Passo
1. Inflação do pâncreas com colagenase / Protease Mistura
- Euthanize rato por deslocamento cervical, saturar o torso mouse com EtOH 70%, cavidade abdominal aberta completamente do ânus para diafragma com as tesouras e pinças de dissecção.
- Posicione o mouse sobre a plataforma de um microscópio de dissecação.
- Puxe o ceco e cólon ascendente para fora e colocá-las fora da cavidade do corpo para a esquerda. Ver Figura 1 para um resumo dos passos seguintes.
- Posicionar os lóbulos do fígado contra o diafragma, que devem permanecer ali, se a cavidade do corpo é aberta suficientemente longe. Localizar a artéria hepática, veia portal e feixe do ducto biliar conduzem ao fígado agarrando o duodeno com fórceps curvo. Com um outro par de fórceps curvos, alcançar sob a artéria, veia, e conduta de bundle e puxar um 2 ¾ polegadas pedaço de sutura 4-0 sob o, duto veia artéria bile, e amarrá-lo uma vez e puxe bem como perto do fígado possível.
- Usando duas pinças curvas, cuidadosamente pegar o duodeno e encontrar o ducto biliar ligado ao duodeno na papila. Use uma pinça do fórceps para picar através do pâncreas e direito do tecido conjuntivo sob a estreita ducto biliar a papila. Picar suas pinças rapidamente através do órgão para fazer um buraco e, em seguida, colocar as duas pinças de pinças através de e pegar outro pedaço de 2 ¾ polegadas de sutura 4-0 através de e amarrá-lo uma vez e puxe-a para um pequeno círculo, mas não puxe apertado.
- Mude para o 90 ° fórceps e Vannas a tesoura superfino. Com os 90 ° pinças, cuidadosamente beliscar e puxar o intestino delgado até o ducto biliar é tenso. Faça um corte horizontal em toda a papila com a tesoura por esfaquear a tesoura abertas para o intestino e, em seguida, corte com um movimento. Tente apenas fazer one atravessam a papila sem desalojar o ducto biliar da papila.
- Continuando a manter o intestino com os fórceps 90 °, inserir a cânula no ducto biliar até a metade do comprimento do ducto biliar, e puxe o fio apertada em torno da cânula.
- Encher uma seringa de 3 ml com 2,0 ml de colagenase / protease mistura e injectar a cânula a um ritmo lento e constante.
- Depois de inflação do pâncreas é concluída, remova a cânula de ducto biliar e usar a pinça e tesouras curvas primavera curvas para remover o pâncreas inflado, começando no cólon descendente e cortando o tecido conjuntivo como você puxa para cima os intestinos. Continue a remover o pâncreas a partir do intestino até chegar ao ducto biliar, em seguida, remover o pâncreas a partir do baço, o estômago e, em seguida, a partir das vísceras da cavidade abdominal. Terminar de remover cortando fora as suturas. Adicionar o pâncreas para um tubo de 50 ml contendo 5 ml de HBSS(P / S). Este tubo deve ser em gelo.
- Repita o procedimento acima para cada animal até quatro animais. Para melhores resultados, dissociar apenas pâncreas quatro de uma vez. Tipicamente, quando os primeiros quatro são no banho de água a 37 ° C, é um outro inflar pâncreas quatro.
2. Pâncreas dissociação
- Colocar os tubos de 50 ml contendo o pâncreas em um banho de água a 37 ° C durante 15 min.
- Agite suavemente o tubo e verificar se há dissociação tecido, certifique-se de tecido se desprende facilmente, então redemoinho os tubos de 12 vezes, enquanto você está segurando o tubo pela tampa.
- Adicionar um máximo de 30 ml de HBSS (BSA) (esta pode ser uma quantidade menor, dependendo de quanto é necessário para equilibrar os tubos durante o passo de centrifugação), e centrifugar a 290 xg durante um min.
- Aspirar o sobrenadante cuidadosamente e deixar uma pequena quantidade de sobrenadante (2-3 ml), na parte inferior, de modo a não perturbar o sedimento celular.
- Utilizando uma seringa de 30 ml attached a agulha 14G, adicionar um máximo de 10 ml de HBSS (BSA) e aspirar a suspensão para cima e para baixo duas vezes.
- Filtra-se a mistura de células através de um coador de chá dentro de um tubo de plástico de 50 ml e enxaguar com outros 10 ml de HBSS (BSA).
- Centrifugar a 330 xg durante 2 min.
- Decantar o sobrenadante e inverter os tubos de drenagem sobre uma toalha de papel absorvente por 1 min.
- Ressuspender em cada tubo de 10 ml 1,100 histopaque frio.
- Sobrepor o histopaque com 10 ml de HBSS (BSA) e centrifugar a 900 xg durante 18 min.
- Remover os 20 ml de todo o sobrenadante utilizando uma pipeta de 25 ml grande furo e passar o sobrenadante através de um filtro de 70 um invertidas.
- Lavar as ilhotas em uma placa de 10 cm de Petri, pipetando 10 ml de mídia ilhotas através do filtro, mantendo-o do lado direito por cima do prato.
- Cultura das ilhotas em um de 37 ° C, 5% de CO 2 da cultura de tecidos incubadora até estar pronto para a experimentação. Tipicamente, os ilhéus são colhidas e contadas antes experimentation.
3. Resultados representativos
Rendimentos ilhotas, morfologia e qualidade são os parâmetros gerais utilizados para julgar o sucesso de isolamento de ilhotas. Nas nossas mãos, o rendimento das ilhotas do C57BL média / 6 de rato estão na gama de 150-250 ilhotas utilizando este protocolo (ver Tabela 2), e são comparáveis com os dados obtidos utilizando optimizada Sigma tipo XI colagenase. No entanto, os rendimentos podem variar, dependendo da estirpe de ratinho utilizada e da idade do rato. A maioria dos animais que empregamos estão no intervalo de 8-16 semanas de idade Este protocolo foi testado em várias estirpes de ratinhos, incluindo C57BL / 6 (180-250 ilhotas / ratinho), CD1 (200-300 ilhotas / ratinho), 129 / B6 (200-300 ilhotas / ratinho), BLKS-db/db (120-200 ilhotas / ratinho), NOD (10 semanas de idade, 100-150 ilhotas / ratinho), e NOD-SCID (100-150 ilhotas / murganho ). Morfologia das ilhotas típico é mostrado na Figura 2, em que as ilhotas ter uma rodada de forma oblonga, com tamanho relativamente uniforme (apesar de tamanho UNIFormity pode variar de estirpe para estirpe). A Figura 3 mostra a análise típica de glucose estimulada a secreção de insulina a partir de ratinhos C57BL / 6 ilhéus isolados de rato usando TDES purificadas vs Sigma tipo colagenase XI. Tipicamente, os resultados de uma alta qualidade de ilhotas de preparação de uma estimulação com insulina, 25 mM de glucose, que é 6-20 vezes maior do que a observada em 2,5 mM de glucose. Outras aplicações podem também ser usadas para testar a qualidade dos ilhéus isolados, e estes incluem a utilização de técnicas de perifusion, Ca 2 + de imagem (com Fura2), e transcrição reversa-PCR, entre outros 11.
Figura 1. Um resumo da canulação do ducto biliar.
Figura 2. Aparência típica de ilhotas C57BL / 6 a 24 horas isolamento seguinte. Imagens foram adquiridas em um emconvertida microscópio com uma ampliação de 40X.
Figura 3. Glucose-secreção de insulina estimulada de C57BL / 6 ilhotas. Aos 24 hr isolamento seguinte, 100 ilhotas foram incubadas em um prato de 12 poços durante 1 hora a 37 ° C em solução de Krebs-Ringer tamponada com HEPES-contendo 2,5 mM de glucose. Ilhéus foram então transferidos para solução de Krebs-Ringer HEPES, 2,5 mM de glicose por uma hora adicional, após o que o sobrenadante foi recolhido para a medição de insulina usando um local de dois imuno ensaio de imunossorvente ligado a enzima (ELISA) (Crystal Chem). As ilhotas mesmos foram subsequentemente transferidos para solução de Krebs-Ringer tamponada com HEPES-contendo 25 mM de glucose, e a libertação de insulina para o meio foi medida por ELISA após 1 h de incubação.
Discussion
Neste protocolo, descrevemos o nosso procedimento para a canulação, a perfusão com colagenase, e a dissociação do pâncreas de murino, com a finalidade de isolar as ilhotas de Langerhans. Tecnicamente, o nosso método, uma vez que domina, devem permitir o isolamento no interior do pâncreas 4 min de eutanásia do animal, e por 1 hr deve resultar no isolamento de ilhotas de um único animal. A rapidez da técnica nos permite isolar ilhotas de até 12 ratinhos a um estiramento normal, resultando no isolamento de até 3.000 ilhotas.
Ao contrário de outros protocolos que utilizam preparações cruas de colagenase, o nosso protocolo apresenta a utilização de proteases purificadas, zyme CI MA colagenase e protease zyme CI BP. As variações na consistência da preparação TDE que estão disponíveis comercialmente requer que cada lote individualmente ser testada e optimizada antes de uso geral. Esta variabilidade de lote para lote nos levou a considerar o uso de puriTDES ficados de VitaCyte. Estes TDES altamente purificados são caracterizados por vários métodos, incluindo a utilização de ensaios de fluorescência sensíveis ao substrato marcado. O ensaio de fluorescência CDA é mais sensível a diferentes formas moleculares de colagenase que têm diferentes cinéticas de colagénio nativo degradante. Históricos ensaios substrato peptídico fornecer uma avaliação incompleta de colagenase. Caracterizando colagenase por vários métodos garante uma maior atividade da enzima entre os lotes.
Com base no nosso teste em casa utilizando uma variedade de preparações de colagenase comercialmente disponíveis, verificou-se que as combinações de enzimas purificadas resultou reprodutíveis de lote para lote-resultados. As vantagens principais de usar TDES altamente purificados e caracterizados com rigor no presente pedido são uma vez que a composição de enzima óptimo é definido, a consistência do desempenho lote para lote é garantida. Esta consistência elimina o processo de trabalho intensivo de qualificação muito normalmente necessáriopara produtos de colagenase em bruto ou enriquecido. TDES purificadas também permitir modificações adicionais da composição para melhorar o rendimento e a qualidade das ilhotas recuperadas a partir de estirpes de ratinho diferentes. Relatórios composições enzimáticas óptimas para o isolamento de ilhotas de diferentes estirpes de ratos pode ser mais eficazmente comunicadas. Este, por sua vez, leva a um uso mais produtivo dos recursos e maior flexibilidade no projeto experimental.
Há muitos passos críticos que podem afetar o resultado do isolamento de ilhotas usando nosso protocolo. A primeira é a necessidade de atingir a inflação eficaz do pâncreas durante a perfusão da preparação enzimática. É importante para iniciar a inflação com força suave na seringa, e aumentar a força como se inflar pâncreas. É útil para mover os intestinos e levante o pâncreas durante a inflação, de modo que a colagenase perfunde o órgão inteiro. Outro passo importante é a força com que um sacode o afte tubosr incubação a 37 ° C (passo 2.2). Descobrimos que a agitação do pâncreas com força contra a tampa do tubo faz com que a fragmentação de ilhotas, mas sem qualquer forma de dissociação mecânica, neste passo, a produção de ilhotas pode cair drasticamente. Também é imperativo que durante o passo de dissociação com a seringa (passo 2.5), uma força de nível médio é aplicado durante o movimento para cima e para baixo com o êmbolo, o que garante a dissociação do tecido adequado, antes da etapa de filtragem (2.6), em que muito pouco tecido deve ser retida no filtro coador de chá. Finalmente, o último passo para seguir com atenção é a aspiração de todo os 20 ml das ilhotas Histopaque fracionados. Embora as ilhotas estão tipicamente na interface do histopaque e HBSS, nós descobrimos que podemos perder ilhotas quando se tenta remover apenas a interface, em vez disso, nós agora remover os 20 ml inteiro usando uma pipeta ml grande furo 25. Adicionamos a filtração através de filtro invertido a 70 uM (passo 2.11) para eliminar a necessidade de centrifuge as ilhotas várias vezes para lavar o histopaque.
Disclosures
NDS, SAT, e RGM tem nada a revelar. AGB autor é empregado por VitaCyte. Autor RCM tem uma participação acionária na VitaCyte.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte pelo NIH R01 DK060581, R01 DK083583 (tanto para a RGM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
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Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
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References
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