Summary
En detaljert beskrivelse av mus holme isolasjon er beskrevet ved hjelp av teknikken i plasstøpt bukspyttkjertelen duktalt kanylering og perfusjon av en kombinasjon av renset kollagenase og nøytral protease.
Abstract
Avhøret av beta celle genuttrykk og funksjon in vitro har holdent skiftet gjennom årene fra studien av gnager tumorigene cellelinjer til studiet av isolerte gnager holmer. Primære holmer tilby klar fordel at de mer trofast reflekterer biologi intracellulære signalveier og sekretoriske svar. Mens fremgangsmåten ifølge holmen isolasjon ved hjelp av vev dissociating enzyme (TDE) preparater har blitt godt etablert i mange laboratorier 1-4, variasjoner i konsistensen av holmen avkastning og kvalitet fra enhver gnager belastning begrense omfanget og gjennomførbarheten av primære holme studier. Disse variasjonene oppstår ofte som et resultat av det urene delvis rensede TDEs brukes i holmen isolasjon prosedyren; TDEs oppviser ofte varen til lot variasjoner i aktivitet og krever ofte justeringer dosen av enzym som brukes. Et lite antall rapporter har brukt renset TDEs for gnagere celle isoleringer 5, 6 7 Gotoh, 8, der TDEs blir perfused direkte inn bukspyttkjertelen duct av mus, etterfulgt av råolje vev fraksjonering gjennom en Histopaque gradient 9, og isolering av renset holmer. En signifikant forskjell i protokoll vårt er bruken av renset kollagenase (CI Zyme MA) og nøytral protease (CI Zyme BP) kombinasjon. Den collagenase ble karakterisert ved bruk av en 6 fluorescens kollagen nedverdigende aktivitet (CDA) analyse som benyttes fluorescensmerkede oppløselige kalveskinn fibriller som substrat 6. Dette substratet er mer prediktivt for kinetikken av kollagen degradering i vev matrise fordi den er avhengig innfødt kollagen som substrat. Proteasen var characterized med en følsom fluorescerende kinetisk analyse 10. Utnytte disse bedre analyser sammen med mer tradisjonelle biokjemisk analyse aktivere TDE skal produseres mer konsekvent, noe som fører til bedre ytelse konsistens mellom partier. Protokollen er beskrevet her er optimalisert for maksimal holme avkastning og optimal holme morfologi med C57BL / 6 mus. Under utviklingen av denne protokollen, ble flere kombinasjoner av collagenase og nøytrale proteaser vurderes på ulike konsentrasjoner, og den endelige forholdet collagenase: nøytral protease av 35:10 representerer enzym ytelse sammenlignes med Sigma Type XI. Fordi betydelig variasjon i gjennomsnittlig holme avkastningen fra ulike stammer av rotter og mus har blitt rapportert, bør ytterligere modifikasjoner av TDE sammensetning gjøres for å forbedre ytelse og kvalitet av holmer utvinnes fra ulike arter og stammer.
Protocol
A. Materialer som trengs: Se tabell 1 (reagenser) før tilberedning
- HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% Penicillin / streptomycin (oppbevares i kjøleskap eller holdt på is).
- 20% BSA lager er laget i vann og alikvoteres og lagret ved -20 ° C.
- HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (endelige BSA konsentrasjoner er 0,3%)
- Islet medium: RPMI + 10% FBS + 1% glutamin + 1% penicillin / streptomycin
- Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque
- 4-0 Sutur (McKesson): skåret i 2 ¾ cm stykker og lagres i en 10 cm petriskål
- Instrumenter: Bøy tang fra fine Science Verktøy til 90 °, og fil ned taggete tenner av alle tre par av tang. Målet er å sløve tenner, for ikke å fjerne dem.
- Kanyle for administrasjon av collagenase / protease blanding: 27 G ½ i. nål, 30 ½ i.nål, PE50 rør skåret i 12 tommer stykker. Fil begge nåler ned til en jevn avrundet ende som ikke har noen skarpe kanter. Sett 27 G nål inn i en ende av en 12 igjen stykke PE50 slange. Fjerne 30G nål fra huset ved å knuse huset med en tang, snu kabinettet ¼ snu hver gang. Fjern nålen med tang fra huset og sette det inn i den andre enden av PE50 slangen under en disseksjon mikroskop. Pass på å ikke knekk slangen når du setter nålen i PE50 slangen. Den 27 G nål er den enden som du vil feste sprøyte med collagenase.
- Kollagenase (CI Zyme MA) og Neutral Protease (CI Zyme BP). Rekonstituer TDE henhold til produsentens anvisninger. Referer til mange konkrete Certificate of Analysis å beregne enzymaktiviteten konsentrasjon. Overføre en total på 350.000 kollagen nedverdigende aktivitet (CDA) enheter av den rekonstituerte collagenase og 100.000 nøytrale protease enheter av reconstituted BP Protease inn en konisk tube og fortynn opptil 15 ml totalt i HBSS (P / S)
B. Step-by-Step Protocol
1. Inflasjon på Pancreas med collagenase / Protease Blanding
- Avlive mus ved cervical forvridning, mette musen torso med 70% EtOH, åpen bukhulen helt fra anus til membranen med noen disseksjon saks og pinsett.
- Plasser musen på plattformen av en disseksjon mikroskop.
- Trekk blindtarm og stigende kolon ut og sette dem utenfor kroppen hulrom til venstre. Se figur 1 for en oversikt over de neste trinnene.
- Plasser fliker av leveren mot mellomgulvet, de bør forbli der hvis kroppshulrommet er åpen langt nok. Finn leverpulsåren, portvenen og galle duct bunt fører til leveren ved å ta tak i tolvfingertarmen med buede tenger. Med et annet par av buede tang, nå under arterie, vene, og kanal bundle og trekke en 2 ¾ i. stykke 4-0 sutur under arterie, vene, gallegang og bind den gang og trekk så nær leveren som mulig.
- Bruk av to par buede tang, nøye tak i tolvfingertarmen og finne gallegang festet til tolvfingertarmen på papilla. Bruk en tang av pinsett for å rote gjennom bukspyttkjertelen og bindevev rett under gallegang nær papilla. Rote tang raskt gjennom orgelet å lage et hull og deretter sette begge tengene av tang gjennom og ta en annen 2 ¾ tommers stykke 4-0 sutur gjennom og bind den gang og trekk den til en liten sirkel, men ikke trekk stramt.
- Bytt til 90 ° tang og til Superfin Vännäs saks. Med de 90 ° tang, nøye klemme og trekk tynntarmen til galle duct er stram. Gjør én horisontale snittet over papilla med saksen ved knivstikking de åpne saks inn i tarmen og deretter kutte med én bevegelse. Prøv å bare gjøre one skjære over papilla uten løsner gallegang fra papilla.
- Mens fortsatt holdes tarmen med de 90 ° tang, setter kanylen inn i gallekanalen opp til halve lengden av galle kanalsystem, og trekk forsiktig sutur stramt rundt kanylen.
- Fyll en 3 ml sprøyte med 2,0 ml collagenase / protease blanding og injiser inn i kanylen på en langsom, konstant tempo.
- Etter inflasjon i bukspyttkjertelen er ferdig, fjernes kanylen fra gallegang og bruke de buede tenger og buede våren saks for å fjerne den oppblåste bukspyttkjertelen ved å starte på synkende kolon og snipping bindevevet som du trekker tarmen opp. Fortsett å fjerne bukspyttkjertelen fra tarmen til du kommer til galle duct, og deretter fjerne bukspyttkjertelen fra milten, deretter magen og deretter fra innvollene i bukhulen. Fullføre fjerningen av snipping bort sting. Legg bukspyttkjertelen til en 50 ml rør inneholdende 5 ml HBSS(P / S). Dette rør bør være på is.
- Gjenta fremgangsmåten ovenfor for hvert dyr opptil fire dyr. For optimale resultater, distansere bare fire pancreata på en gang. Vanligvis, mens den første fire er i 37 ° C vannbad, blåses vi en annen fire pancreata.
2. Pancreas Dissosiasjon
- Plasser 50 ml rør inneholdende pancreata inn en 37 ° C vannbad i 15 min.
- Rist røret og sjekk for vev dissosiasjon, sørg vev kommer fra hverandre lett, så virvel rørene 12 ganger mens du holder røret ved lokket.
- Legg ikke mer enn 30 ml HBSS (BSA) (dette kan være en lavere mengde, avhengig av hvor mye som er nødvendig for å balansere rørene for sentrifugering trinn) og sentrifuger ved 290 xg i en min.
- Aspirer supernatanten forsiktig og la en liten mengde av supernatant (2-3 ml) i bunnen, slik som å ikke forstyrre cellepellet.
- Ved hjelp av en 30 ml sprøyte Attached til 14G nål, legge ikke mer enn 10 ml HBSS (BSA) og aspirere suspensjonen opp og ned to ganger.
- Filtrere celleblanding gjennom en plast tesil til en 50 ml rør og skyll med annen 10 ml HBSS (BSA).
- Sentrifuger ved 330 xg i 2 min.
- Dekanter supernatanten og invertere rør renne av på et absorberende papirhåndkle i 1 min.
- Resuspender hvert rør i 10 ml kaldt 1100 histopaque.
- Overlappe histopaque med 10 ml HBSS (BSA) og sentrifuger ved 900 xg i 18 min.
- Fjerne hele 20 ml supernatant ved hjelp av et stort boring 25 ml pipette og passere supernatanten gjennom en invertert 70 um filter.
- Skyll holmer i en 10 cm petriskål ved pipettering 10 ml holme media gjennom filteret mens du holder den høyre side opp over parabolen.
- Kultur holmene i et 37 ° C, 5% CO 2 vevskultur inkubator inntil klar for eksperimentering. Vanligvis er holmer håndplukket og telles før kompetanseimentation.
3. Representant Resultater
Holmen avkastning, morfologi, og kvalitet er de generelle parametre brukt til å bedømme suksess av holmen isolasjon. I våre hender, holme utbytter fra gjennomsnittlig C57BL / 6 mus, er i området av 150 til 250 ved hjelp av denne holmer protokollen (se tabell 2), og er sammenlignbare med data innhentet ved hjelp av optimalisert Sigma type XI kollagenase. Imidlertid kan rentene variere avhengig musen stamme og alderen av musen. De fleste av dyrene vi ansetter er i 8-16 ukers alderen Denne protokollen har blitt testet på flere musestammer, inkludert C57BL / 6 (180-250 holmer / mus), CD1 (200-300 holmer / mus), 129 / B6 (200-300 holmer / mus), BLKS-db/db (120-200 holmer / mus), NOD (10 uker gamle, 100-150 holmer / mus), og NOD-SCID (100-150 holmer / mus ). Typisk holme morfologi er vist i figur 2, der har en rund holmer å avlang form med relativt ensartet størrelse (selv om størrelsen uniformity kan variere fra stamme til stamme). Figur 3 viser vår typisk analyse av glukose-stimulert insulin sekresjon fra C57BL / 6 mus holmer isolert med rensede TDEs vs Sigma type XI kollagenase. Typisk er en høykvalitets holmen forberedelse resulterer i en insulin stimulering med 25 mM glukose som er 6-20 ganger større enn det som er observert ved 2,5 mM glukose. Andre applikasjoner kan også brukes til å teste kvaliteten av isolerte holmer, og disse inkluderer bruk av perifusion teknikker, Ca 2 + imaging (med Fura2) og revers-transkripsjon PCR bl.a. 11.
Figur 1. En oppsummering av kanylering av galle duct.
Figur 2. Typisk utseende C57BL / 6 holmer ved 24-timers følgende isolasjon. Images ble kjøpt på en ikonverteres mikroskop ved 40X forstørrelse.
Figur 3. Glukose-stimulert insulinsekresjon av C57BL / 6 holmer. På 24 hr følgende isolasjon ble 100 holmer inkubert i et 12-brønn parabolen for en time ved 37 ° C i Krebs-Ringer HEPES-bufret løsning inneholdende 2,5 mM glukose. Holmer ble deretter overført til Krebs-Ringer HEPES ved 2,5 mM glukose for en ekstra time, hvoretter supernatanten ble oppsamlet for insulin måling ved hjelp av en to-site immunospecific enzym-koblet immunosorbent-analyse (ELISA) (Crystal Chem). De samme holmer ble deretter overført til Krebs-Ringer HEPES-bufret løsning inneholdende 25 mM glukose, og insulin release i mediet ble målt ved ELISA etter 1 hr av inkubasjon.
Discussion
I denne protokollen, har vi beskrevet våre prosedyre for kanylering, collagenase perfusjon, og dissosiasjon av murine bukspyttkjertelen, med mål om å isolere holmer av Langerhans. Teknisk, vår metode, når mestret, bør tillate bukspyttkjertelen isolasjon innen 4 minutter av euthanizing dyret, og etter 1 time bør resultere i isolering av holmer fra et enkelt dyr. Hurtigheten av teknikken tillater oss å isolere holmer fra opptil 12 mus ved en typisk strekk, og dermed resulterer i isoleringen av opptil 3000 holmer.
I motsetning til andre protokoller som bruker råolje preparater av collagenase, har vår protokoll bruk av renset proteaser, CI Zyme kollagenase MA og CI Zyme BP Protease. Variasjoner i konsistensen av TDE preparater som er kommersielt tilgjengelig krever at hvert parti individuelt testet og optimalisert før generell bruk. Dette lot til mye variasjon førte oss til å vurdere bruk av puriModifiserte TDEs fra VitaCyte. Disse høyt rensede TDEs kjennetegnes ved flere metoder inkludert bruk av sensitive fluorescence merket substrat-analyser. Fluorescensen CDA-analysen er mer følsomme for ulike molekylære former av kollagenase som har forskjellige kinetikk i nedverdigende innfødt kollagen. Historisk peptid underlaget analyser gir en ufullstendig vurdering av collagenase. Karakterisere collagenase av flere metoder sikrer større enzymaktivitet mellom mange.
Basert på vår in-house testing ved hjelp av en rekke kollagenase forberedelser kommersielt tilgjengelig, fant vi ut at de rensede enzymet kombinasjoner ga reproduserbare lot til lot resultater. De store fordelene ved å bruke svært renset og grundig karakterisert TDEs i denne søknaden er når optimal enzympreparat er definert, blir lot til lot ytelse konsistens trygg. Dette konsistens eliminerer arbeidskrevende prosess for mye kvalifisering normalt krevesfor råolje eller beriket kollagenase produkter. Rensede TDEs også aktivere flere modifikasjoner av preparatet for å forbedre utbytte og kvalitet av holmer utvinnes fra forskjellige musestammer. Rapportering optimale enzym preparater for isolering av holmer fra forskjellige stammer av mus kan være mer effektivt kommunisert. Dette i sin tur fører til mer produktiv bruk av ressurser og bedre fleksibilitet i eksperimentell design.
Det er mange viktige skritt som kan påvirke utfallet av holmen isoleringer ved hjelp av vår protokoll. Den første er behovet for å oppnå en effektiv oppblåsing av bukspyttkjertelen under perfusjon av enzympreparatet. Det er viktig å starte inflasjon med skånsom kraft på sprøyten, og øke kraften som bukspyttkjertelen blåses. Det er nyttig å flytte tarmen og løft bukspyttkjertelen under oppblåsning, slik at kollagenase perfuses hele organ. En annen kritisk trinn er den kraft med hvilken en vibrering rørene after inkubering ved 37 ° C (trinn 2.2). Vi har funnet at risting bukspyttkjertelen hardt mot hetten av røret forårsaker fragmentering av holmer, men uten noen form for mekanisk dissosiasjon på dette trinnet, kan holmen utbytter falle dramatisk. Det er også viktig at under dissosiasjon trinnet med sprøyten (trinn 2.5), er en middels nivå kraften under opp-og ned bevegelse med stempelet, og dette sikrer tilstrekkelig vev dissosiasjon før filtreringen trinn (2.6), der det er svært lite vev bør beholdes på tesil filteret. Endelig, er det siste trinnet for å følge nøye aspirasjon av hele 20 ml av de histopaque fraksjonerte holmer. Selv holmer er vanligvis på grensesnittet til histopaque og HBSS, har vi funnet ut at vi mister holmer når vi prøver å fjerne bare grensesnittet, i stedet har vi nå fjerne hele 20 ml med en stor bar 25 ml pipette. Vi lagt filtrering gjennom inverterte 70 mikrometer filter (trinn 2.11) for å eliminere behovet for å centrifuge holmer gjentatte ganger for å vaske bort histopaque.
Disclosures
NDS, SAT, og RGM har ingenting å avsløre. Forfatter AGB er ansatt ved VitaCyte. Forfatter RCM har en eierandel i VitaCyte.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd DK060581 R01, R01 DK083583 (både RGM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
|||||||||||
References
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. Experience of islet isolation without neutral protease supplementation. Islets. 2, 278-282 (2010).
- Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation. Cell Transplant. , Forthcoming (2012).
- McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation. Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).
- Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets. Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).
- Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting. Transplantation. 51, 566-570 (1991).
- McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3, 144-149 (2011).
- Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment. Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).
- Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure. Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).
