Summary
En detaljerad beskrivning av mus ö isolering beskrivs användning av tekniken av in situ pankreas duktal kanylering och perfusion av en kombination av renat kollagenas och neutralt proteas.
Abstract
Förhören av beta-cell genuttryck och funktion in vitro har rakt skiftat under åren från studien av cell gnagare tumorogena linjer till studiet av isolerade gnagare holmar. Primära öar erbjuder den distinkta fördelen att de mer rättvisande bild biologi intracellulära signalvägar och svar sekretoriska. Metoden för ö isolering med vävnad dissocierande enzym (TDE) preparat har väl etablerad i många laboratorier 1-4, variationer i konsistensen av ö avkastning och kvalitet från en viss gnagare stam begränsa omfattningen och genomförbarheten av primära ö studier. Dessa variationer förekommer ofta som ett resultat av de råa delvis renade TDES används i ö isoleringsförfarandet, TDES ofta uppvisar mycket till parti variationer i aktivitet och kräver ofta justeringar av dosen enzym som används. Ett litet antal rapporter har använt renade TDES för isoleringar gnagarcellinjer 5, 6 7, 8, i vilken TDES är perfuseras direkt i pankreas kanalen hos möss, följt av råolja vävnad fraktionering genom en Histopaque lutning 9, och isolering av renade öar. En signifikant skillnad i vår protokoll är användningen av renat kollagenas (Cl zyme MA) och neutralt proteas (Cl zyme BP) kombination. Den kollagenas kännetecknas av användningen av en 6 fluorescens kollagen nedbrytande aktivitet (CDA) analys som utnyttjade fluorescensmärkta lösliga fibriller kalvskinn som substrat 6. Detta substrat är mer förutsägande av kinetiken för kollagennedbrytning i vävnadsmatrisen eftersom det bygger på nativt kollagen som substrat. Proteaset var characterized med en känslig fluorescerande kinetisk analys 10. Med hjälp av dessa förbättrade analyser tillsammans med mer traditionella biokemisk analys möjliggöra TDE skall tillverkas mer konsekvent, vilket leder till förbättrad prestanda överensstämmelse mellan partier. Protokollet som beskrivs här var optimerad för maximal holme avkastning och optimal holme morfologi med C57BL / 6 möss. Under utvecklingen av detta protokoll har flera kombinationer av kollagenas och neutrala proteaser utvärderades olika koncentrationer, och den slutliga förhållandet kollagenas: neutralt proteas av 35:10 representerar enzym prestanda jämförbar med Sigma typ XI. Eftersom betydande variabilitet i genomsnittliga holme avkastningen från olika stammar av råttor och möss har rapporterats bör ytterligare modifieringar av TDE sammansättningen göras för att förbättra utbytet och kvaliteten på öar som återvunnits från olika arter och stammar.
Protocol
A. Material som behövs: Se tabell 1 (reagenser) före beredning
- HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% penicillin / streptomycin (förvaras i kylskåp eller hålls på is).
- 20% BSA mälden görs i vatten och alikvoterades och lagrades vid -20 ° C.
- HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA slutliga koncentrationerna är 0,3%)
- Islet-medium: RPMI + 10% FBS + 1% glutamin + 1% penicillin / streptomycin
- Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque
- 4-0 suture (McKesson): skuren i 2 ¾ tums bitar och lagras i en 10 cm petriskål
- Instrument: Böj tången från Fine Science Tools till 90 °, och fila ner de tandade tänder av alla tre par av pincetten. Målet är att tråkig tänderna, inte att ta bort dem.
- Kanyl för administration av kollagenas / proteas blandning: 27G ½ tum nål, 30 ½ tumnål, PE50 rör skars i 12 tum bitar. Arkiv båda nålarna ner till en slät rundad ände som inte har några vassa kanter. Sätt 27G nål i ena änden av en 12 i. bit PE50 rör. Ta bort 30G nålen från höljet genom att krossa höljet med en tång, vrida höljet ¼ varv varje gång. Ta bort nålen med tång från höljet och sätt in det i den andra änden av PE50 rör under ett dissektion mikroskop. Var noga med att inte trassla slangen när du sätter in nålen i PE50 slangen. Den 27G nålen är slut som du kommer att fästa sprutan i kollagenas.
- Kollagenas (CI zyme MA) och neutralt proteas (CI zyme BP). Rekonstituera TDE enligt tillverkarens instruktioner. Se partiet specifika Certificate of Analysis för att beräkna enzymaktiviteten koncentrationen. Överför totalt 350.000 kollagen nedbrytning aktivitet (CDA) enheter av rekonstituerade kollagenas och 100.000 neutrala enheter proteas i reconstitutdelade BP Proteas i ett koniskt rör och späd upp till 15 ml totalt i HBSS (P / S)
B. Steg-för-steg Protocol
1. Inflationen i bukspottkörteln med kollagenas / proteas Blandning
- Euthanize musen genom cervikal dislokation, mätta mus bålen med 70% EtOH, öppna bukhålan helt från anus till membran med eventuella dissektion sax och pincett.
- Placera musen på plattformen av en dissektion mikroskop.
- Dra blindtarmen och colon ascendens ut och ställa dem utanför kroppen hålighet till vänster. Se figur 1 för en sammanfattning av följande steg.
- Placera lober i levern mot membranet, de bör vara där om kroppen hålighet är öppen tillräckligt långt. Hitta levern artär, portal ven och gallgången bunt som leder in i levern genom att ta tag i tolvfingertarmen med böjda pincett. Med ett annat par av krökta tång, når under artär, ven, och kanal bundle och dra en 2 ¾ tum bit 4-0 sutur under artär, ven, gallgång och slips det en gång och dra åt så nära levern som möjligt.
- Med hjälp av två par av krökta tång, försiktigt tag i tolvfingertarmen och hitta gallgången fäst till duodenum vid papillen. Använd en tång av tången för att peta igenom bukspottkörteln och bindväv rätt enligt gallgången nära papillen. Peta dina tång snabbt genom organet att göra ett hål och sedan lägga båda tungorna av pincett genom och ta en annan 2 ¾ tums bit 4-0 sutur igenom och knyta den en gång och dra den till en liten cirkel, men dra inte hårt.
- Byt till 90 ° pincett och till Superfine Vännäs sax. Med 90 ° pincett försiktigt nypa och dra tunntarmen tills gallgången är spänd. Gör en horisontell snitt över papilla med saxen genom att hugga de öppna saxen i tarmen och sedan skära med en rörelse. Försök att bara göra one skär över papilla utan att rubba gallgången från papillen.
- Medan du håller tarmen med 90 ° pincett sätter kanylen i gallgången upp till halva längden av gallgången, och dra sedan försiktigt suturen tätt runt kanylen.
- Fyll en 3 ml spruta med 2,0 ml kollagenas / proteas blandningen och injicera i kanylen i en långsam, konstant takt.
- Efter inflationen i bukspottkörteln är klar tar kanylen från gallgången och använda de böjda pincett och böjda sax våren för att ta bort den uppblåsta bukspottkörteln genom att starta vid fallande tjocktarmen och snipping bindväven som du drar tarmarna uppåt. Fortsätt att ta bort bukspottkörteln från tarmarna tills du kommer till gallgången, ta sedan bort bukspottkörteln från mjälten, sedan magen och sedan från inälvor i bukhålan. Avsluta bort genom snipping bort suturer. Lägg bukspottkörteln till en 50 ml rör innehållande 5 ml HBSS(P / S). Detta rör ska vara på is.
- Upprepa proceduren ovan för varje djur upp till fyra djur. För bästa resultat, ta avstånd bara fyra pankreata på en gång. Vanligtvis, medan den första fyra är i 37 ° C vattenbad, blåsa vi en annan fyra pankreata.
2. Pancreas Dissociation
- Placera 50 ml rör innehållande pankreata till en 37 ° C vattenbad i 15 minuter.
- Skaka röret och kontrollera vävnadsdissociering, se vävnad kommer isär lätt då snurra rören 12 gånger medan du håller röret genom locket.
- Lägg inte mer än 30 ml HBSS (BSA) (detta kan vara ett lägre belopp, beroende på hur mycket som krävs för att balansera rören för centrifugeringssteget) och centrifugera vid 290 xg under en minut.
- Sug supernatanten försiktigt och lämna en liten mängd av supernatanten (2-3 ml) vid botten för att inte störa cellpelleten.
- Använd en 30 ml spruta Attached till 14G nål, lägg inte mer än 10 ml HBSS (BSA) och aspirera suspensionen upp och ner 2 gånger.
- Filtrera cellblandningen genom en plast te sil i ett 50 ml rör och skölj med ytterligare 10 ml HBSS (BSA).
- Centrifugera vid 330 x g under 2 minuter.
- Dekantera supernatanten och invertera rören rinna på en absorberande pappershandduk i 1 min.
- Resuspendera varje rör i 10 ml kallt 1100 HISTOPAQUE.
- Överlagra HISTOPAQUE med 10 ml HBSS (BSA) och centrifugera vid 900 x g under 18 minuter.
- Ta bort hela 20 ml supematant med användning av en stor borrning 25 ml pipett och passera supernatanten genom en inverterad 70 pm filter.
- Skölj holmar i en 10 cm petriskål genom att pipettera 10 ml ö medier genom filtret medan du håller det rätt sida upp över skålen.
- Kultur cellöarna i en 37 ° C, 5% CO 2 vävnadsodlingsinkubator tills för experiment. Normalt är öar handplockats och räknas före kompetensimentation.
3. Representativa resultat
Holme avkastning, morfologi och kvalitet är de allmänna parametrar som används för att bedöma framgången för ö isolering. I våra händer, holme avkastning från den genomsnittliga C57BL / 6 mus är i intervallet 150-250 öar med detta protokoll (se tabell 2), och är jämförbara med data som erhållits med optimerad Sigma typ XI kollagenas. Emellertid kan utbytena variera beroende på den använda musstammen och ålder hos musen. De flesta av de djur vi använder är i 8-16 veckor åldersgrupp Detta protokoll har testats på flera musstammar, inklusive C57BL / 6 (180-250 öar / mus), CD1 (200-300 öar / mus), 129 / B6 (200-300 öar / mus), BLKS-db/db (120-200 öar / mus), NOD (10 veckor gamla, 100-150 öar / mus), och NOD-SCID (100-150 öar / mus ). Typisk ö morfologi visas i figur 2, i vilken cellöar har en rund att avlång form med relativt likformig storlek (även om storlek uniformity kan variera från stam till stam). Figur 3 visar vår typisk analys av glukos-stimulerad insulinutsöndring från C57BL / 6 mus isolerade cellöar användning av renade TDES vs Sigma typ XI kollagenas. Typiskt, en hög kvalitet ö förberedelse resulterar i en insulinstimulering vid 25 mM glukos som är 6-20 gånger större än den som observerades vid 2,5 mM glukos. Andra program kan också användas för att testa kvaliteten på isolerade öar, och dessa inkluderar användning av perifusion tekniker, Ca 2 + imaging (med fura2) och omvänd transkription PCR, bland annat 11.
Figur 1. En sammanfattning av kanylering av gallgången.
Figur 2. Typisk utseende C57BL / 6 öar vid 24 timmar efter isolering. Bilder förvärvades på en ikonverteras mikroskop vid 40X förstoring.
Figur 3. Glukos-stimulerad insulinutsöndring hos C57BL / 6 cellöar. Vid 24 h efter isolering, var 100 cellöar inkuberades i en 12-brunnars skål under 1 timme vid 37 ° C i Krebs-Ringer HEPES-buffrad lösning innehållande 2,5 mM glukos. Cellöar överfördes sedan till Krebs-Ringer HEPES vid 2,5 mM glukos för en ytterligare timme, varefter supernatanten uppsamlades för insulin mätning med en två-plats immunspecifika enzymkopplad immunosorbentanalys (ELISA) (Crystal Chem). Samma Cellöarna överfördes därefter till Krebs-Ringer HEPES-buffrad lösning innehållande 25 mM glukos, och insulinfrisättning i mediet mättes med ELISA efter 1 h inkubation.
Discussion
I detta protokoll, har vi beskrivit vår procedur för kanylering kollagenas perfusion, och dissociation av den murina pankreas, med målet att isolera de Langerhanska öarna. Tekniskt vår metod, en gång bemästrat, bör medge bukspottkörteln isolering inom 4 minuter efter euthanizing djuret och med 1 timme bör resultera i isolering av öar från ett enda djur. Snabbheten av tekniken tillåter oss att isolera öar från upp till 12 möss vid en typisk sträck, vilket resulterar i isolering av upp till 3.000 öar.
Till skillnad från andra protokoll som använder råa beredningar av kollagenas, har vår protokoll att använda renade proteaser, CI zyme kollagenas MA och CI zyme BP proteas. Variationer i konsistens TDE preparat som är kommersiellt tillgängliga kräver att varje del för sig testas och optimeras innan allmän användning. Denna vara till mycket variation fick oss att anse att användningen av purirade TDES från VitaCyte. Dessa högrenade TDES kännetecknas av flera metoder inklusive användning av känsliga märkta fluorescens substrat analyser. Fluorescensen CDA analysen är mer känsliga för olika molekylära former av kollagenas som har olika kinetik i förnedrande nativt kollagen. Historiska peptidsubstrat analyser ger en ofullständig bedömning av kollagenas. Karakterisera kollagenas av flera metoder ger större enzymaktivitet mellan partier.
Baserat på vår egen test med hjälp av olika kollagenas preparat kommersiellt tillgängliga, fann vi att de renade enzymkombinationer gav reproducerbara parti till parti resultat. De stora fördelarna med att använda höggradigt renade och noggrant karaktäriseras TDES i denna ansökan en gång är den optimala enzymkompositionen definieras, är mycket till parti prestanda konsistens garanteras. Denna konsekvens eliminerar arbetskrävande process parti kvalifikationer som normalt krävsför råolja eller berikad kollagenas produkter. Renade TDES möjliggör också ytterligare modifieringar av sammansättningen för att förbättra avkastningen och kvaliteten på öar som återvunnits från olika musstammar. Rapportering optimala enzymkompositioner för isolering av öar från olika stammar av möss kan vara mer effektivt kommuniceras. Detta i sin tur leder till mer produktiv användning av resurser och en förbättrad flexibilitet i experimentell design.
Det finns många viktiga steg som kan påverka resultatet av ö isoleringar med vår protokollet. Den första är behovet av att uppnå en effektiv inflationen i bukspottkörteln under perfusionen av enzympreparatet. Det är viktigt att börja med inflationen mild kraft på sprutan, och öka kraften som bukspottkörteln blåses. Det är till hjälp att flytta tarmarna och lyft bukspottkörteln under uppblåsning så att kollagenas perfuses hela organet. En annan kritisk steg är den kraft med vilken en skakar rören afteR inkubation vid 37 ° C (steg 2,2). Vi har funnit att skaka bukspottkörteln hårt mot locket på tuben orsakar fragmentering av öar, men utan någon form av mekanisk dissociation i detta steg kan holme avkastning falla dramatiskt. Det är också viktigt att under dissociationssteget med sprutan (steg 2,5), en medelhög nivå kraft som appliceras under upp och ner rörelse med kolven, vilket ger tillräcklig vävnadsdissociering före filtreringssteget (2,6), där mycket lite vävnad bör behållas på tesil filtret. Slutligen är det sista steget för att följa noga strävan av hela 20 ml av HISTOPAQUE fraktionerade holmar. Även holmar är vanligtvis i gränssnittet för HISTOPAQUE och HBSS, har vi funnit att vi förlorar öar när vi försöker ta bort endast gränssnittet, utan vi nu ta bort hela 20 ml med en stor borrning 25 ml pipett. Vi har lagt till filtrering genom den inverterade 70 pm filter (steg 2,11) för att eliminera behovet av till centrifuge öarna flera gånger för att tvätta bort HISTOPAQUE.
Disclosures
NDS, SAT, och RGM har inget att lämna ut. Författare AGB är anställd av VitaCyte. Författare RCM har en ägarandel i VitaCyte.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av NIH bidrag R01 DK060581, R01 DK083583 (både RGM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||
| 10X HBSS | Life Technologies | 14065 | |||||||||
| RPMI | Fisher Scientific | 10-040 | |||||||||
| BSA | Sigma Aldrich | any | |||||||||
| Histopaque 1077 | Sigma Aldrich | 10771 | |||||||||
| Histopaque 1119 | Sigma Aldrich | 11191 | |||||||||
| 4-0 Suture 100 yd roll | McKesson | 451521 | |||||||||
| 14 g blunt end needle | Fisher Scientific | 14-8216M | |||||||||
| Vannas Superfine Sciss | Fisher Scientific | 501778 | |||||||||
| Curved Spring Scissors | Fisher Scientific | 14127 | |||||||||
| Curved Forceps (2) | Fisher Scientific | 15914G | |||||||||
| Curved forceps (for 90 °) | Fine Science Tools | 11052-10 | |||||||||
| 27G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305109 | |||||||||
| 30G 1/2 inch needle | Fisher Scientific | 305106 | |||||||||
| PE tubing | Becton Dickinson | 427411 | |||||||||
| Collagenase MA | Vitacyte, LLC | 001-2030 | |||||||||
| BP Protease | Vitacyte, LLC | 003-1000 | |||||||||
| 3 ml syringe | Fisher Scientific | 309585 | |||||||||
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | 309650 | |||||||||
| 70 μm filter | Fisher Scientific | 352350 | |||||||||
| 10 cm2 Petri Dish | Fisher Scientific | 351005 | |||||||||
| Plastic tea strainer | Any kitchen supply | ||||||||||
| Table 1. Reagents and Equipment | |||||||||||
|
|||||||||||
Table 2. Average islet yields (±SD) using different TDE lots* *Data represent average islet yields from at least 10 mice. Lot numbers in parentheses |
|||||||||||
References
- Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).
- Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. Experience of islet isolation without neutral protease supplementation. Islets. 2, 278-282 (2010).
- Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation. Cell Transplant. , Forthcoming (2012).
- McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation. Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).
- Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets. Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).
- Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting. Transplantation. 51, 566-570 (1991).
- McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran. Islets. 3, 144-149 (2011).
- Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment. Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).
- Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure. Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).
