Summary
Een protocol voor de voorbereiding van robuuste, kleinschalige HeLa nucleaire extracten wordt beschreven. Dit protocol is waardevol voor testen die het gebruik van kleine populaties van cellen, zoals cellen behandeld met medicijnen of RNAi vereisen. De methode moet voor diverse genexpressie assays en andere celtypes, die onder andere cellen.
Abstract
Een groot deel van de vooruitgang in het begrijpen van gen-expressie is gemaakt met behulp van in vitro systemen. Voor de meeste onderzoeken zijn functionele bepalingen uitgevoerd met extracten die in bulk bereid 10-50 of meer liter cellen gekweekt in suspensie. Echter, deze grote preparaten niet vatbaar zijn voor snel in vitro testen die het gevolg is van verschillende in vivo behandeling of cellulaire voorwaarden. Dit blad video artikel wordt een werkwijze voor het bereiden functionele kleine kernextracten met HeLa-cellen als voorbeeld. Deze werkwijze wordt uitgevoerd met slechts drie platen 150 mm van cellen gekweekt in aanhangend monolagen. Om de efficiëntie van de kleinschalige extracten te illustreren, laten we zien dat ze zo actief zijn als bulk nucleaire extracten voor gekoppelde RNA-polymerase II de transcriptie / splicing reacties. Om het nut van het extract protocol aan te tonen, laten we zien dat splicing wordt afgeschaft extracten bereid uit HeLa cels die werden behandeld met de splicing inhibitor drug E7107. De kleinschalige protocol dient te worden over het algemeen van toepassing zijn op een proces of celtype dat kan worden onderzocht in vitro met behulp van cellulaire extracten. Deze omvatten patiënt cellen die slechts in beperkte hoeveelheden of cellen blootgesteld aan verschillende middelen, zoals drugs, DNA beschadigende middelen RNAi of transfectie, wat het gebruik van kleine celpopulaties vereisen. Bovendien kleine hoeveelheden vers gekweekte cellen gemakkelijk en / of voor sommige toepassingen.
Protocol
1. Groeiende HeLa cellen voor Nucleaire Extraction
- Plaat HeLa-cellen in drie 150 mm plaat met DMEM medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline / streptomycine. Groei in een 37 ° C incubator met 5% CO2 tot cellen 90% confluent.
Tip-Split cellen 1:10 van een confluente plaat en oogst 3 dagen na de splitsing.
Tip-een extra plaat kunnen worden gekweekt in het geval er niet genoeg cellen drie platen (bijvoorbeeld als de cellen meer dan 90% confluent).
2. Voorbereiden en Chill kernextract Solutions
- Bereid nieuwe oplossingen zoals aangegeven in tabel 2.
- Aliquot 10 ml van hypotone buffer in een 15 ml Falcon buis. Aliquot 1 ml buffer met hoog zoutgehalte en 1 ml buffer met laag zoutgehalte in 1,5 ml Eppendorf buizen. Koel de buffers op het ijs. Voeg de juiste hoeveelheden PMSF en DTT om elke buffer onmiddellijk voorafgaand aan het gebruik (zie
3. Oogsten HeLa cellen voor Nucleaire Extraction
- Zuig media uit de cellen en een keer was de cellen met 13 ml van de ruimtetemperatuur 1X PBS per plaat.
- Zuig het PBS wassen.
Tip-Zuig zoveel mogelijk van de PBS mogelijk door eerst aanzuigende, dan staat de plaat op zijn kant, wacht een paar seconden, en opzuigen de rest.
- Met een cel tillift schraap cellen de onderkant van de platen en vervolgens over de cellen een Eppendorf buis. Vermijd het maken van bubbels. De 3 platen van geschraapt cellen moeten passen in een 1,5 ml Eppendorf buis.
Tip-is gemakkelijker om de hoeveelheid cellen schatten of een eppendorfbuisje wordt gebruikt. Voor schaal, te gebruiken Falcon buizen.
- Centrifugeer bij 4 ° C in een microcentrifuge gedurende 5 minuten bij 100 xg aan pellet de cellen.
4. Swell HeLa cellen in Hypotone Buffer
5. Lyse cellen door een Dounce Homogenizer
- Gebruik Hypotone Buffer naar de Dounce afspoelen en het chillen op het ijs. Veeg de stamper droog met een delicate opdracht wipER (bijv. Kimwipe). Verwijder de resterende buffer van de Dounce met behulp van een 1000 ui uitgebreide micropipet tip.
- Overdracht gezwollen cellen in de Dounce. Beweeg de strakke stamper van de Dounce op en neer 5 keer aan de cellen lyseren en voorzichtig om luchtbellen te vermijden.
- Test voor cellyse een 5 pi monster van cellen uit de Dounce. Plaats de hoeveelheid in een Eppendorf buis en voeg een gelijk volume van trypaanblauw. Doe het mengsel op een dia en onderzoekt de cellen met behulp van een lichtmicroscoop. De kernen van gelyseerde cellen zal verschijnen blauw. Ongeveer 90% lysis is ideaal.
Tip-Het aantal keren dat de cellen moet worden dounced zal variëren afhankelijk van de dichtheid van de Dounce. Bij de uitvoering van dit protocol voor de eerste keer, bepalen het aantal keren dat Dounce door het uitvoeren van stap 5.3 na elke slag met de Dounce. Niet te lang Dounce, zal overmatige douncing vernietigen van de kernen.
- Breng de gelyseerde cellen een vooraf chilled eppendorfbuisje en draaien in een 4 ° C microfuge 5 min bij 1500 x g. De pellet bevat de kernen. Breng voorzichtig de bovenstaande vloeistof naar een nieuwe buis zonder verstoring van de kernen. De supernatant bevat het cytoplasma.
Tip-Het cytoplasma kan als zodanig worden gebruikt of verder verwerkt tot een S100 met dezelfde snelle rotatie voor bulk extracten (zie 1 voor het bereiden van een actieve S100 van bulk extracten).
6. Salt-Pak de kernen
- Schat de Packed Nuclear Volume (PNV), door te kijken naar de gradatie op de buis. Een PCV van 500 ul levert typisch PNV van 400 ul.
- Voeg ½ X PNV buffer met laag zoutgehalte de kernen door het invoegen van een micropipet tip naar de bodem van de buis langzaam spuiten de buffer in de kernen, terwijl voorzichtig mengen. Pipetteer niet op en neer. Tik zachtjes tegen de buizen om te zorgen dat de pellet volledig geresuspendeerd in de buffer met laag zoutgehalte voordat u verder gaat. <li> Add ½ X PNV van de buffer met hoog zoutgehalte en snel 1 keer meng door het buisje. Niet schudden. Roteren bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
Tip-Wees voorzichtig met de kernen als ze in buffer met hoog zoutgehalte te vermijden lyseren hen.
- Spin bij 4 ° C in een microcentrifuge gedurende 15 min bij 18.000 x g. Het supernatant is de hoge zout nucleaire extract (HS-NE). Drie platen van cellen levert doorgaans 500-600 ul van HS-NE.
7. Concentreer je en Dialyze de Nuclear Extract
- Breng 500 pi van de HS-NE in gekoelde mini-centricons (Amicon) en spin 50 min bij 4 ° C in een microcentrifuge bij 14.000 x g. Omgekeerde de mini-centricon (Amicon) en plaats het in een nieuw Eppendorf buis. Spin gedurende 2 minuten bij 4 ° C 1000 xg om de HS-NE herstellen. De HS-NE worden geconcentreerd tot ongeveer 115 microliter.
- Met behulp van een P200 Pipetman, over te dragen 45 ul porties van de HS-NE in de mini-dialyse Slide-A-Lyzers, en plaats ze in 500 ml koud dialysebuffer. Controleer de bodem van de Slide-A-Lyzer uitgelijnd met de bodem van de drijver. Roer voor 1-2 uur bij 4 ° C. De NO zal bewolkt verschijnen na de dialyse.
Tip-niet gecentrifugeerd om de troebele neerslag die wordt waargenomen na de dialyse te verwijderen, omdat dit centrifugeren vermindert de activiteit van het extract.
- De NO kan onmiddellijk worden gebruikt of porties verdeeld. Aliquots moet flash worden bevroren in vloeibare stikstof en bij -80 ° C. De NE kunnen worden opgeslagen en wordt ten minste twee vries-ontdooi cycli zonder dat activiteit.
8. Representatieve resultaten
Recent werden efficiënt in vitro systemen voor het koppelen RNAP II transcriptie splicing ontwikkeld 2-5. Deze systemen die HeLa cellen gekweekt in bulk en dus niet vatbaar snel testen van de effecten van specifieke cellulaire behandelingen meerdere monsters. Op basis van deze nodignd het algemene nut van een kleinschalig extract protocol (zie Overleg), hebben we een robuust kleinschalige nucleaire extract methode. Representatieve gegevens vergelijken RNAP II transcriptie / splicing reactie in kleine kernextract de bulk kernextract is weergegeven in figuur 2. Een CMV-DNA construct, waarbij de CMV promoter bevat en codeert voor een standaard splicing substraat (FTZ 3, figuur 2A) werd gebruikt voor de analyse. Wanneer deze construct werd geïncubeerd in de bulk (lanen 1-3) of kleine (lanen 4-6) extract werden soortgelijke niveaus van de ontluikende pre-mRNA gesynthetiseerd door 5 min. tijdstip (figuur 2, laan 1 en 4 ). Na toevoeging van α-amanitine verder transcriptie blokkeren de hechting tussenproducten en gesplitst producten opgebouwd in de tijd met vergelijkbare kinetica in beide fragmenten (fig. 2, banen 2, 3, 5, 6). Deze representatieve resultaten tonen aan dat de efficiëntie van de staatsgreep led RNAP II transcriptie / splicing systeem is vergelijkbaar met de bulk-en kleinschalige nucleaire extracten.
Om het nut van de kleinschalige extract aan te tonen, werden extracten bereid uit HeLa cellen behandeld met de splicing-remmer, E7107, of de negatieve controle samengestelde pladienolide F 6,7 en vervolgens de gekoppelde RNAP II transcriptie / splicing test werd uitgevoerd. Zoals getoond in figuur 3 transcriptie bij RNAP II zich efficiënt extracten bereid uit zowel Pladienolide F en E7107 behandelde cellen (10 min tijdstippen). Daarentegen splicing zich gewoonlijk in het extract bereid uit Pladienolide F behandelde cellen, maar opgeheven in de E7107-behandelde cellen (Figuur 3, 20-60 min. tijdstippen). Deze gegevens bieden proof of concept voor het gebruik van de kleinschalige nucleaire extracten voor een speciale behandeling van cellen in kleine schaal.
jpg "/>
Figuur 1. Schematische voorstelling van kleinschalige Extract Protocol. Stap P1. Cellen worden gekweekt als monolagen geoogst platen met een cel heftoestel en gezwollen door toevoeging van hypotone buffer. Stap P2. De cellen worden gelyseerd met een Dounce homogenisator en gecentrifugeerd pellet de kernen. Stap P3. Kernen gescheiden van het cytoplasma ondergaan zoutwinning. Stap P4. De nucleaire extract wordt geconcentreerd en gedialyseerd. Stap P5. De resultaten worden verkregen, waaruit blijkt dat kernextracten functioneel zijn (zie figuur 2 voor meer details).
Figuur 2. Kleinschalige nucleaire extracten zijn robuust in een gekoppelde RNAP II transcriptie / splicing test. A. Schematische voorstelling van de CMV-FTZ DNA-template gebruikt voor gekoppelde RNAP II transcriptie / splitsen. De CMV promoter en de grootte van de exons en intron aangegeven. B. Vergelijking van gekoppelde RNAPII transcriptie / splicing test met behulp van bulk-nucleaire extract of kleinschalige nucleaire extract. α-amanitine toegevoegd na 5 min transcriptie en splicing liet plaatsvinden 30 en 60 minuten. RNA werd geëxtraheerd en gefractioneerd op een 5% polyacrylamidegel denaturerende en gedetecteerd door phosphoimager. De splicing tussenproducten en producten zijn aangegeven. De endogene U6 snRNA en tRNA aanwezig in het extract van 32 P-gelabeld gedurende incubatie aangegeven. Zie 3 voor een gedetailleerd protocol op de gekoppelde RNAP II transcriptie / splicing systeem.
Figuur 3. Kleinschalige nucleaire extracten verkregen uit HeLa cellen behandeld met de hechting inhibitoren E7107 defect in splicing. Cellen werden behandeld met 3 pM Pladienolide F of E7107 alsbeschreven 6 en vervolgens gebruikt om kleinschalige nucleaire extracten voor te bereiden. Een tijdsverloop werd uitgevoerd met dezelfde transcriptie / splicing assay zoals in figuur 2. De splicing tussenproducten en-producten, en U6 snRNA en tRNA worden aangegeven.
Discussion
Wij hebben een snelle en reproduceerbare wijze voor de bereiding van nucleaire extracten van kleine hoeveelheden van HeLa-cellen gekweekt als monolagen. We hebben aangetoond dat deze extracten zijn robuust door te laten zien dat de kinetiek en de efficiëntie van RNAP II transcriptie / splicing tests zijn vergelijkbaar in de kleinschalige en bulk nucleaire extracten. We hebben aangetoond het nut van de extracten door te tonen dat extracten verkregen uit cellen behandeld met een vertakkingsschotel inhibitoren actief zijn voor transcriptie maar gebrekkig splicing.
De werkwijze voor het bereiden kleine kernextracten werd door het combineren en optimaliseren methoden eerder voor het maken extracten van HeLa-cellen gekweekt in suspensie in grote 1,8 en een werkwijze voor kleinschalige bereiden van extracten 9. We stelden ons protocol omdat de vorige kleine fragmenten niet functioneel enige assays, zoals gekoppelde transcriptie / splicing assay. Een belangrijk verschil tussen de vorige kleinschalige protocol 9 en de onze is dat we voorwaarden voor het lyseren cellen met behulp van een mini-Dounce geoptimaliseerd terwijl het vorige protocol gelyseerd cellen door ze door middel van een kleine naald 9. De naald-lyse resulteert in bubbels, wat kan verklaren waarom de extracten niet actief zijn geweest en / of moeilijk te reproduceren voor sommige testen. We hebben ook een concentratiestap onze protocol. Deze stap verhoogt de activiteit van de extracten die zeer gevoelig concentratie en beperkt de verschillen tussen extracten die inherent is aan kleine preparaten. Tenslotte wordt onze voorbereiding routinematig uitgevoerd met slechts drie 150 mm platen van monolaag cellen, zonder enig significant effect op de activiteit in vergelijking met bulk-extracten. Zo is de procedure gemakkelijk vatbaar voor kleinschalige bereidingen die dure reagentia of beperkte cel beschikbaarheid vereisen. Zo hebben wij bereid small-schaal extracten van RNAi knock-down-cellen en van chronische lymfatische leukemie (CLL) patiënt cellen, en deze producten worden gebruikt voor functionele en / of biochemische assays (EGF, JLH, TY en RR, niet gepubliceerd). Wij hebben gevonden dat de extracten belangrijk is voor RNAi door specifieke biochemische assays zoals immunopreciptations, Westerns, en zilverkleuring. Na het bepalen van de werkzaamheid van slopen een bepaalde proteïne een meer gedetailleerde studie uitgevoerd door een stabiele knockdown cellijn, die kan worden gebruikt om extra extracten bereid tegen lagere kosten. Massaspectrometrie eiwitten presenteren immunoprecipitaten verkregen deze knockdown cellijnen ook een nuttige toepassing van de werkwijze. Naast de gekoppelde transcriptie / splicing assay dat we als voorbeeld voor onze protocol beschrijving hier dient de kleine fragmenten in het algemeen van toepassing op vele functionele en biochemische onderzoeken, zoals die voor de verschillende steps in genexpressie (bijvoorbeeld aftopping, lassen, transcriptie, polyadenylatie, microRNA verwerking). Het protocol kan worden aangepast voor de patiënt celtypes die kan worden verkregen suspensie (zoals CLL cellen) of in kweek (zoals fibroblasten patiënt). Tenslotte moet het cytoplasmatische fractie verkregen tijdens de procedure nuttig voor functionele biochemische onderzoeken dat het cytoplasma vereisen.
Disclosures
Productie en gratis toegang tot dit artikel wordt gesponsord door Abcam, Plc.
Acknowledgments
We zijn dankbaar aan M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng voor nuttige discussies. HeLa-cellen werden verkregen uit de Nationale Cultuur van de Cel Center (Minneapolis, MN). We danken ook Eisai Co, Ltd voor het leveren van E7107 en de Nikon Imaging Center aan de Harvard Medical School voor hulp bij lichtmicroscopie. Dit werk werd ondersteund door een NIH-subsidie GM043375 aan RR en EGF en NRSA gemeenschap te JLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
| MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
| KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
| PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
| DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
| EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
| Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
| DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
| FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
| 150mm Plates | VWR | 353025 | |
| Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
| Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
| Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
| Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 | |
| Table 1. Specific Reagents and Equipment. | |||
| Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
| 10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
| 100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
| 20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation. | |||
References
- Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro. Cell. 36, 993-1005 (1984).
- Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts. Rna. 6, 1325-1334 (2000).
- Das, R. Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly. Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).
- Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns. PLoS Biol. 4, e147 (2006).
- Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. A model in vitro system for co-transcriptional splicing. Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).
- Kotake, Y. Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide. Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).
- Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region. Genes. 25, 440-444 (2011).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing. Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).
