Summary
En protokoll for utarbeidelse av robuste, småskala Jakten kjernefysiske ekstrakter er beskrevet. Denne protokollen er verdifullt for analyser som krever bruk av små bestander av celler, for eksempel celler behandlet med medikamenter eller RNAi. Metoden bør være knyttet til et bredt utvalg av genuttrykk analyser og andre celletyper, inkludert pasientens celler.
Abstract
En stor del av fremskritt i forståelsen av genuttrykk er gjort ved hjelp av in vitro-systemer. For de fleste studiene er funksjonelle analyser utført ved hjelp av ekstrakter som er utarbeidet i bulk fra 10-50 eller flere liter av celler dyrket i suspensjon. Men disse store preparater er ikke mottagelig for raskt testing in vitro effekter som følge av en rekke in vivo cellulære behandlinger eller vilkår. Denne journalen video artikkelen viser en metode for å utarbeide funksjonelle småskala kjernefysiske ekstrakter, bruker Jakten celler som et eksempel. Denne metoden utføres med så få som tre 150 mm plater av celler dyrket som heftende monolayers. For å illustrere effektiviteten av småskala ekstrakter, viser vi at de er så aktiv som bulk kjernefysiske ekstrakter for koblede RNA polymerase II transkripsjon / skjøting reaksjoner. For å demonstrere nytten av ekstraktet protokollen, viser vi at spleising er avskaffet i ekstrakter fremstilt fra Jakten celles behandlet med skjøting inhibitor stoffet E7107. Den småskala-protokollen bør være generelt gjeldende for enhver prosess eller celletype som kan undersøkes in vitro ved hjelp av mobilnettet ekstrakter. Disse inkluderer pasientens celler som kun er tilgjengelig i begrensede mengder eller celler som eksponeres for en rekke stoffer som narkotika, DNA skadende agenter, RNAi, eller transfeksjon, som krever bruk av småcellet populasjoner. I tillegg, små mengder fersk dyrket cellene er praktisk og / eller kreves for enkelte applikasjoner.
Protocol
1. Voksende Jakten celler for Nuclear Extraction
- Plate Jakten celler på tre 150 mm plater med DMEM media supplert med 10% FBS og 1% Penicillin / Streptomycin. Vokse i et 37 ° C inkubator med 5% CO 2 til cellene er 90% konfluent.
Tip-Split celler 1:10 fra en konfluent plate og innhøsting 3 dager etter splitting.
Tips-En ekstra plate kan dyrkes i tilfelle det ikke er nok celler med tre plater (for eksempel hvis cellene er mindre enn 90% konfluent).
2. Utarbeide og Chill Nuclear Extract Solutions
- Forbered ferske løsninger som er skissert i tabell 2.
- Delmengde 10 ml Hypoton buffer i en 15 ml Falcon rør. Delmengde 1 ml av High Salt buffer og 1 ml av Low Salt buffer til 1,5 ml Eppendorf-rør. Chill bufferne på isen. Legg de aktuelle volumene av PMSF og DTT til hver buffer umiddelbart før bruk (se
3. Høsting Jakten Celler for Nuclear Extraction
- Sug media fra cellene og vaske cellene gang med 13 ml romtemperatur 1X PBS per plate.
- Aspirer PBS vask.
Tip-Aspirer så mye av PBS som mulig ved første aspirere, deretter stående platen på sin side, venter noen sekunder, og aspirere resten.
- Ved hjelp av en celle løfter, skrape celler til underkanten av platene, og deretter overføre cellene til en Eppendorf rør. Unngå å lage bobler. De 3 plater av skrapt cellene skal passe inn i en 1,5 ml Eppendorf rør.
Tip-Det er lettere å anslå volumet av celler hvis en Eppendorf rør brukes. For skala, bruke Falcon rør.
- Sentrifuger ved 4 ° C i en microfuge i 5 min ved 100 xg til pelletskaminer cellene.
4. Swell Jakten Celler i Hypoton Buffer
5. Lyse celler ved hjelp av en Dounce homogenizer
- Bruk Hypoton Buffer å skylle dounce og deretter kjøle det på is. Tørk stampe tørr med en delikat oppgave WIPER (f.eks Kimwipe). Fjern resterende buffer fra dounce bruke en 1000 mL utvidet mikropipette tips.
- Overfør hovne celler i dounce. Beveg tett stampe av dounce opp og ned 5 ganger for å lyse cellene, er forsiktig med å unngå bobler.
- Assay for cellelyse med en 5 mL delmengde av celler fra dounce. Plasser delmengde i en Eppendorf rør og legg en tilsvarende volum Trypan Blue. Ha blandingen på et lysbilde og undersøke cellene ved hjelp av et lysmikroskop. Kjerner av lyserte celler vises blå. Omtrent 90% lysis er ideelt.
Tips-Antall ganger cellene bør dounced vil variere avhengig av tetthet av dounce. Når du utfører denne protokollen for første gang, bestemme antall ganger til dounce ved å gjennomføre steg 5,3 etter hvert strøk med dounce. Ikke over-dounce, vil overdreven douncing ødelegge kjerner.
- Overfør lyserte cellene til en pre-Chilled Eppendorf rør og spinn i en 4 ° C microfuge i 5 min ved 1500 x g. Den pellet inneholder kjerner. Forsiktig overføre supernatanten til et nytt rør uten å forstyrre kjerner. Supernatanten inneholder cytoplasma.
Tips-cytoplasma kan brukes som den er eller videreforedles til en S100 med den samme høye hastighet spin brukes for bulk ekstrakter (se 1 for å utarbeide en aktiv S100 fra bulk ekstrakter).
6. Salt-Pakk kjerner
- Anslå Pakket Nuclear Volume (PNV) ved å se på graderingen på røret. En PCV av 500 mL gir vanligvis en PNV på 400 mL.
- Legg ½ X PNV av Low Salt buffer til kjernene ved å sette inn en mikropipette tips til bunnen av røret og sakte squirting buffer i kjernen mens forsiktig miksing. Ikke pipette opp og ned. Forsiktig flick rørene for å sørge for at pellets er helt resuspendert i Low Salt buffer før du fortsetter. <li> Legg ½ X PNV av High Salt buffer og raskt blande en gang ved å snu røret. Ikke rist. Roter ved 4 ° C i 30 min.
Tip-Vær forsiktig med kjernene når de er i høy Salt Buffer for å unngå Lysing dem.
- Spinn ved 4 ° C i en microfuge for 15 min på 18 000 x g.. Supernatanten er den høye salt kjernefysiske ekstrakt (HS-NE). Tre plater av celler gir vanligvis 500-600 mL av HS-NE.
7. Konsentrere og Dialyser Nuclear Extract
- Overføring 500 mL av HS-NE i en nedkjølt mini-centricons (Amicon) og spinn i 50 min ved 4 ° C i en microfuge på 14000 x g.. Inverter mini-centricon (Amicon) og legg den i en ny Eppendorf rør. Spinn i 2 min ved 4 ° C 1000 xg å gjenopprette HS-NE. HS-NE vil bli konsentrert til ca 115 mL.
- Ved hjelp av en P200 Pipetman, overføre 45 mL alikvoter av HS-NE inn mini-dialyse lysbilde-A-Lyzers, og plassere dem i 500 ml kjølt Dialyse buffer. Pass på at bunnen av Slide-A-Lyzer er på linje med bunnen av flottør. Rør i 1-2 timer ved 4 ° C. NE vil vises skyet etter dialyse.
Tip-Ikke sentrifuger for å fjerne skyet bunnfallet som er observert etter dialyse, da dette sentrifugering reduserer aktiviteten av ekstraktet.
- NE kan brukes umiddelbart eller alikvoteres. Alikvoter bør flash frosset i flytende nitrogen og lagret ved -80 ° C. NE kan lagres og gjennomgår minst to fryse-tine sykluser uten å miste aktivitet.
8. Representative Resultater
Nylig ble effektivt in vitro systemer for kopling RNAP II transkripsjon til skjøting utviklet 2-5. Disse systemene benyttes Jakten celler dyrket i bulk og dermed er ikke mottagelig for raskt å teste effekten av spesifikke cellulære behandlinger på flere prøver. Basert på dette må ennd den generelle nytten av en småskala ekstrakt protokollen (se omtale), etablerte vi en robust liten skala kjernefysisk ekstrakt metode. Representative data som sammenligner RNAP II transkripsjon / skjøting reaksjon i den lille skala kjernefysisk ekstrakt med hoveddelen kjernefysiske ekstraktet er vist i figur 2. En CMV-DNA konstruksjon, som inneholder CMV arrangøren og koder for et standard spleising substrat (3 FTZ, figur 2A) ble brukt for analyse. Når dette begrepet ble inkubert i bulk (kjørefelt 1-3) eller liten skala (kjørefelt 4-6) ekstrakt, ble tilsvarende nivåer av den gryende pre-mRNA syntetisert av 5 min tidspunkt (Figur 2, baner 1 og 4 ). Etter tilsetting av α-amanitin å blokkere videre transkripsjon, de skjøting mellomprodukter og skjøtes produkter akkumulert over tid med tilsvarende kinetikk i begge typer ekstrakter (figur 2, kjørefelt 2, 3, 5, 6). Disse representative resultatene viser at effektiviteten av kuppet ledede RNAP II transkripsjon / skjøting system er lik i bulk og småskala kjernefysiske ekstrakter.
For å demonstrere nytten av småskala ekstrakt metoden, ble utdrag forberedt fra Jakten celler behandlet med skjøting inhibitor, E7107, eller den negative kontrollen sammensatte pladienolide F 6,7 og deretter koblet RNAP II transkripsjon / skjøting analysen ble gjennomført. Som vist i figur 3, transkripsjon av RNAP II skjedde effektivt i ekstrakter fremstilt fra både Pladienolide F og E7107 behandlet celler (10 min tidspunkter). I motsetning skjedde spleising normalt i ekstraktet tilberedt av de Pladienolide F-behandlede celler, men ble avskaffet i de E7107-behandlede celler (figur 3, 20-60 min tidspunkter). Disse dataene gir bevis for bruk av småskala kjernefysiske ekstrakter for spesiell behandling av celler i liten skala.
jpg "/>
Figur 1. Skjematisk av småskala Extract protokoll. Trinn P1. Cellene dyrkes som monolayers, høstes fra plater ved hjelp av en celle løfter og hovne ved tilsetning av hypoton buffer. Trinn P2. Cellene er lysert ved hjelp av en Dounce homogenizer og sentrifugeres til pellet kjerner. Trinn P3. Atomkjerner er atskilt fra cytoplasma og gjennomgår salt utvinning. Trinn P4. Den kjernefysiske ekstrakt er konsentrert og dialyzed. Trinn P5. Resultatene er hentet som viser at kjernefysiske ekstrakter er funksjonelle (se figur 2 for større detalj).
Figur 2. Småskala kjernefysiske ekstrakter er robust i en kombinert RNAP II transkripsjon / skjøting analysen. A. Skjematisk av CMV-FTZ DNA mal som brukes til kombinert RNAP II transkripsjon / skjøting. Den CMV promoter og størrelsen på den eksoner og intron er indikert. B. Sammenligning av coupled RNAPII transkripsjon / skjøting analysen ved hjelp av enten bulk kjernefysisk ekstrakt eller små-skala kjernefysisk ekstrakt. α-amanitin ble lagt på etter 5 min av transkripsjon og skjøting fikk lov til å skje for 30 og 60 min. RNA ble ekstrahert og fraksjonert på en 5% denaturering polyakrylamid gel og oppdaget av phosphoimager. De skjøting mellomprodukter og produkter er indikert. Den endogene U6 snRNA og tRNA presentere i ekstraktet, og som er er 32 P-merket under inkubering indikert. Se 3 for en detaljert protokoll på coupled RNAP II transkripsjon / skjøting system.
Figur 3. Småskala kjernefysiske ekstrakter fremstilt fra Jakten celler behandlet med skjøting hemmer stoffet E7107 er defekte i spleising. Celler ble behandlet med 3 mM Pladienolide F eller E7107 sombeskrevet 6 og deretter brukt til å forberede små kjernefysiske ekstrakter. En tid kurset ble gjennomført med samme transkripsjon / skjøting analysen som i figur 2. De skjøting mellomprodukter og produkter, og U6 snRNA og tRNA er indikert.
Discussion
Vi har etablert en rask og reproduserbar metode for utarbeidelse av kjernefysiske utdrag fra små mengder Jakten celler dyrket som monolayers. Vi viste at disse ekstrakter er robust ved å vise at kinetikken og effektivitet RNAP II transkripsjon / skjøting analysene er lik i de små og bulk kjernefysiske ekstrakter. Vi viste nytten av ekstraktene ved å demonstrere at ekstrakter fremstilt av celler behandlet med en spleising hemmer stoffet er aktive for transkripsjon men defekt i spleising.
Vår metode for å forberede småskala kjernefysiske ekstrakter ble etablert ved å kombinere og optimalisere metoder tidligere etablerte for å lage utdrag fra Jakten celler dyrket i suspensjon i stor skala 1,8 og en metode for småskala utarbeidelse av ekstrakter 9. Vi etablerte vårt protokollen fordi de tidligere småskala ekstrakter var ikke funksjonell for noen analyser, for eksempel kombinert transkripsjon / splicing analysen. En viktig forskjell mellom den tidligere småskala protokoll 9 og vår er at vi optimalisert vilkårene for Lysing celler ved hjelp av en mini-dounce mens den forrige protokollen lyseres cellene ved å dytte dem gjennom en liten-gauge nål 9. Nålen-lysis resulterer i bobler, som kan forklare hvorfor de ekstraktene var inaktive og / eller vanskelig å reprodusere for noen analyser. Vi har også lagt til en konsentrasjon steg til protokollen vår. Dette trinnet øker aktiviteten av ekstraktene, som er ekstremt følsomme for konsentrasjon, og også begrenser variasjonen mellom ekstrakter som er iboende til småskala preparater. Endelig er vår forberedelse rutinemessig utføres med bare tre 150 mm plater av monolayer celler, uten noen vesentlig effekt på aktiviteten i forhold til bulk ekstrakter. Dermed er prosedyren lett mottagelig for småskala preparater som krever kostbare reagenser eller begrenset celle tilgjengelighet. For eksempel har vi forberedt SMALL-skala ekstrakter fra RNAi knockdown celler og fra kronisk lymfatisk leukemi (KLL) pasientens celler, og brukt disse ekstrakter for funksjonelle og / eller biokjemiske analyser (EGF, JLH, TY og RR, upublisert). Vi har funnet at ekstrakter er verdifulle for RNAi etterfulgt av spesifikke biokjemiske analyser, for eksempel immunopreciptations og Westernfilmer og sølv flekker. Etter etablering av effekten av å slå ned et bestemt protein, kan en mer detaljert undersøkelse utføres ved å lage en stabil knockdown celle-linje, som kan brukes til å forberede flere utdrag til en lavere kostnad. Massespektrometri av proteiner som finnes i immunoprecipitates hentet fra disse knockdown cellelinjer vil også være en nyttig bruk av metoden. I tillegg til kombinert transkripsjon / skjøting assay som vi brukte som et eksempel for vår protokoll beskrivelse her, bør småskala ekstrakter være generelt gjeldende for mange funksjonelle og biokjemiske analyser, slik som de som brukes for de ulike steps i genuttrykk (f.eks tildekking, spleising, transkripsjon, polyadenylation, mikroRNA behandling). Protokollen kan også tilpasses for pasienten celletyper som kan enten innhentet i suspensjon (for eksempel KLL celler) eller dyrket i kultur (for eksempel pasientens fibroblaster). Til slutt skal cytoplasmisk brøkdel innhentet under prosedyren være nyttig for både funksjonelle og biokjemiske analyser som krever cytoplasma.
Disclosures
Produksjon og Fri tilgang til denne artikkelen er sponset av Abcam, Plc.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng for nyttige diskusjoner. Jakten celler ble hentet fra National Cell Culture Center (Minneapolis, MN). Vi takker også Eisai Co Ltd for å gi E7107 og Nikon Imaging Center ved Harvard Medical School for hjelp med lysmikroskopi. Dette arbeidet ble støttet av en NIH stipend GM043375 til RR og EGF og NRSA fellesskap til JLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
| MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
| KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
| PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
| DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
| EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
| Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
| DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
| FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
| 150mm Plates | VWR | 353025 | |
| Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
| Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
| Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
| Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 | |
| Table 1. Specific Reagents and Equipment. | |||
| Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
| 10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
| 100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
| 20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation. | |||
References
- Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro. Cell. 36, 993-1005 (1984).
- Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts. Rna. 6, 1325-1334 (2000).
- Das, R. Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly. Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).
- Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns. PLoS Biol. 4, e147 (2006).
- Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. A model in vitro system for co-transcriptional splicing. Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).
- Kotake, Y. Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide. Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).
- Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region. Genes. 25, 440-444 (2011).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing. Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).
