Summary
Ett protokoll för beredning av robusta, småskaliga HeLa nukleära extrakt beskrivs. Detta protokoll är värdefull för analyser som kräver användningen av små populationer av celler, såsom celler som behandlats med läkemedel eller RNAi. Metoden bör vara tillämplig på en mängd olika analyser genuttryck och andra celltyper, inklusive patientens celler.
Abstract
En stor del av framsteg i förståelsen av genuttryck har gjorts med in vitro-system. För de flesta studier har funktionella analyser utfördes med användning av extrakt som framställs i bulk från 10-50 eller flera liter celler odlade i suspension. Dessa storskaliga preparat inte mottagliga för att snabbt testa in vitro effekter som är resultatet av en mängd olika in vivo cellulära behandlingar eller villkor. Denna skrift video artikeln visar en metod för framställning av funktionella småskaliga nukleära extrakt, med användning av HeLa-celler som ett exempel. Denna metod utförs med användning av så få som tre 150 mm plattor av celler odlade såsom vidhäftande monolager. För att illustrera effektiviteten i småskaliga extrakt, visar vi att de är lika aktiva som bulk nukleära extrakt för kopplade RNA-polymeras II transkription / skarvning reaktioner. För att visa användbarheten av extraktet protokoll, visar vi att splitsning upphävs av extrakt framställda från HeLa-cells behandlas med splitsning inhibitorn läkemedlet E7107. Det småskaliga protokoll bör vara allmänt tillämpas på alla processer eller celltyp som kan undersökas in vitro med cellulära extrakt. Dessa inkluderar patientens celler som endast är tillgängliga i begränsade mängder eller celler som utsätts för ett stort antal medel såsom läkemedel, DNA-skadande ämnen, RNAi, eller transfektion, som kräver användning av små cellpopulationer. Dessutom kan små mängder av färskt odlade celler är lämpligt och / eller erfordras för vissa applikationer.
Protocol
1. Växande HeLa Celler för Nuclear Extraction
- Plattan HeLa-celler vid tre 150 mm plattor med DMEM-medium kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin / streptomycin. Växa i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 till dess att cellerna är 90% sammanflytande.
Tip-Dela upp celler 1:10 från en sammanhängande platta och skörd 3 dagar efter delning.
Spets-En extra plattan kan odlas i fall det inte finns tillräckligt celler med tre plattor (t ex om cellerna är mindre än 90% sammanflytande).
2. Förbered och Chill Nuclear extraktlösningar
- Förbered nya lösningar som beskrivs i tabell 2.
- Alikvot av 10 ml hypoton buffert i en 15 ml Falcon-rör. Alikvot 1 ml buffert med hög salthalt och 1 ml buffert med låg salthalt i 1,5 ml Eppendorf-rör. Kyla buffertar på is. Lägga till lämpliga volymer av PMSF och DTT till varje buffert omedelbart före användning (se
3. Skörd HeLa celler för Nuclear Extraction
- Aspirera mediet från cellerna och tvätta cellerna en gång med 13 ml rumstemperatur 1 x PBS per platta.
- Aspirera PBS tvätt.
Tip-Aspirera så mycket av PBS som möjligt genom att först sugande, sedan stod plattan på sin sida, vänta några sekunder och aspirera resten.
- Användning av en cell lyftaren, skrapa cellerna till den nedre kanten av plattorna, och sedan överföra cellerna till ett Eppendorf-rör. Undvik att bubblor. De 3 plattor av skrapade celler bör passa in i en 1,5 ml Eppendorf-rör.
Spets-Det är lättare att beräkna volymen av celler om ett Eppendorf-rör används. För skala, använda Falcon rör.
- Centrifugera vid 4 ° C i en mikrofug under 5 minuter vid 100 xg för att pelletera cellerna.
4. Svälla HeLa cellerna i hypoton buffert
5. Lyse celler med användning av Dounce Homogenizer
- Använd hypoton buffert för att skölja Dounce och sedan kyla den på is. Torka av mortelstöt torrt med en grannlaga uppgift WIPER (t.ex. Kimwipe). Ta bort återstående bufferten från Dounce med en 1000 xl förlängd mikropipett spets.
- Överför svullna celler till Dounce. Flytta långsamt tätt morteln av Dounce upp och ner 5 gånger att lysera cellerna, var noga med att undvika bubblor.
- Analys för cellys med användning av en 5 pl alikvot av celler från Dounce. Placera alikvot i en Eppendorf-rör och tillsätt en lika stor volym av trypanblått. Sätt blandningen på en slid och undersöka celler med användning av ett ljusmikroskop. Kärnorna av lyserade celler visas blå. Cirka 90% lys är perfekt.
Tips-Antalet gånger celler bör dounced kommer att variera beroende på täthet Dounce. När de genomför detta protokoll för första gången bestämma antalet gånger Dounce genom att utföra steg 5,3 efter varje slag med Dounce. Inte över-Dounce, kommer för kraftig douncing förstöra kärnorna.
- Överföra de lyserade cellerna till ett i förväg chilled Eppendorf-rör och centrifugering i en 4 ° C mikrofug under 5 minuter vid 1500 x g. Pelleten innehåller kärnor. Noggrant överföra supernatanten till ett nytt rör utan att störa den kärnor. Supernatanten innehåller cytoplasman.
Tips-Den kan cytoplasman användas som den är eller beredas vidare till en S100 genom att använda samma höga hastighet spinn som används för bulk extrakt (se 1 för att förbereda en aktiv S100 från bulk extrakt).
6. Salt-Extrahera Kärnor
- Uppskatta packat Nuclear Volym (PNV) genom att titta på gradering på röret. En PCV av 500 xl ger normalt en PNV av 400 pl.
- Tillsätt ^ X PNV av buffert med låg salthalt för att kärnorna genom att infoga en mikropipett spets till botten av röret och långsamt spruta bufferten in i kärnorna under varsam blandning. Inte pipett upp och ned. Knacka försiktigt på rören för att se till att pelleten är helt återsuspenderas i lågsaltbuffert innan du fortsätter. <li> Lägg till ½ X PNV av hög saltbuffert och snabbt blanda 1 gång genom att vända röret. Skaka inte. Rotera vid 4 ° C under 30 minuter.
Tip-Var försiktig med kärnorna när de är i hög saltbuffert för att undvika lysera dem.
- Snurra vid 4 ° C i en mikrofug under 15 min vid 18000 x g. Supernatanten är hög salthalt nukleära extrakt (HS-NE). Tre plattor av celler ger vanligen 500-600 il HS-NE.
7. Koncentrera och Dialysera Nuclear Extract
- Överföra 500 pl av HS-NE i kyld mini-centricons (Amicon) och centrifugera i 50 min vid 4 ° C i en mikrofug vid 14000 x g. Vänd mini-Centricon (Amicon) och placera den i ett nytt Eppendorf-rör. Spin under 2 min vid 4 ° C 1000 x g för att återvinna nämnda HS-NE. HS-NO kommer att koncentreras till cirka 115 | il.
- Med hjälp av en P200 Pipetman, överför 45 pl alikvoter av HS-NE i mini-dialys Slide-A-Lyzers, och placera dem i 500 ml kyld dialysbuffert. Säkerställa att botten av Slide-A-analysatorn är inriktad med botten av flottören. Rör om under 1-2 h vid 4 ° C. NE kommer att visas grumlig efter dialys.
Tip-Centrifugera inte att ta bort det grumliga fällning som observeras efter dialys, eftersom detta centrifugering minskar aktiviteten av extraktet.
- NE kan användas omedelbart eller lika delar. Alikvoter bör snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C. NE kan lagras och undergår åtminstone två frys-tö-cykler utan att förlora aktivitet.
8. Representativa resultat
Nyligen var effektiv in vitro-system för att koppla RNAP II transkription till skarvning utvecklats 2-5. Dessa system användes HeLa-celler odlade i bulk och är sålunda inte lämpade för snabb testning av effekterna av specifika cellulära behandlingar på flera prover. Baserat på denna behöver ennd den allmänna nyttan av en småskalig extrakt protokollet (se Diskussion) har vi etablerat en robust småskalig nukleära extrakt metod. Representativa data som jämför den RNAP II transkription / splitsning reaktion i liten skala nukleärt extrakt med huvuddelen kärnextrakt visas i figur 2. En CMV-DNA-konstruktion, som innehåller CMV-promotorn och kodar en vanlig splitsning substrat (Ftz 3, figur 2A) användes för analysen. När denna konstruktion inkuberades i bulken (spår 1-3) eller liten skala (spår 4-6) extrakt erhölls liknande nivåer av den begynnande pre-mRNA syntetiserades genom 5 min tidpunkten (Figur 2, spår 1 och 4 ). Efter tillsats av α-amanitin att blockera ytterligare transkription, till splitsningsintermediärerna och splitsade produkter ackumuleras över tiden med liknande kinetik i båda typerna av extrakt (figur 2, fält 2, 3, 5, 6). Dessa representativa resultat visar att effektiviteten av kuppen ledda RNAP II transkription / skarvning system är liknande i de bulk och småskaligt nukleära extrakt.
För att demonstrera användbarheten av småskalig extrakt metoden framställdes extrakt framställdes från HeLa-celler behandlade med splitsning inhibitor E7107, eller den negativa kontrollen föreningen pladienolide F 6,7 och därefter den kopplade RNAP II transkription / splitsning analysen utfördes. Såsom visas i figur 3, transkription av RNAP II skedde effektivt i extrakt framställda från både Pladienolide F och E7107-behandlade celler (10 min tidpunkterna). I motsats inträffade skarvning normalt i extraktet framställs från Pladienolide F-behandlade celler, men avskaffades i E7107-behandlade celler (Figur 3, 20-60 min tidpunkter). Dessa data ger bevis på konceptet för att använda småskaliga nukleärextrakt särskild behandling av celler i liten skala.
jpg "/>
Figur 1. Schematisk av småskalig Extract protokollet. Steg P1. Celler odlas som monoskikt, skördades från plattor med användning av en cell lyftaren och svälla genom tillsats av hypoton buffert. Steg P2. Cellerna lyseras med användning av en Dounce-homogenisator och centrifugerades för att pelletera kärnor. Steg P3. Kärnor separeras från cytoplasman och genomgår saltextraktion. Steg P4. Det nukleära extraktet koncentreras och dialyseras. Steg P5. Resultat erhålls som visar att nukleära extrakt är funktionella (se figur 2 för mer detaljer).
Figur 2. Småskaliga nukleära extrakt är robust i en kopplad RNAP II transkription / skarvning analys. A. Schematisk bild av CMV-Ftz DNA-mall som används för kopplad RNAP II transkription / skarvning. CMV-promotorn och storlekarna hos exoner och intron indikeras. B. Jämförelse av kopplad RNAPII transkription / skarvning analys med hjälp av antingen bulk nukleärt extrakt eller liten skala nukleära extrakt. α-amanitin tillsattes efter 5 min av transkription och splitsning fick ske under 30 och 60 minuter. RNA extraherades och fraktionerades på en 5% denaturerande polyakrylamidgel och detekterades genom Phosphoimager. De splitsningsintermediärer och produkter anges. Den endogena U6 snRNA och tRNA finns i extraktet och som är 32 P-märkt under inkubation anges. Se 3 för en detaljerad protokoll om kopplade RNAP II transkription / skarvning system.
Figur 3. Småskaliga nukleära extrakt framställda från HeLa-celler behandlade med splitsning inhibitorn läkemedlet E7107 är defekta i splitsning. Cellerna behandlades med 3 | iM Pladienolide F eller E7107 sombeskrivits 6 och sedan användes för att framställa små nukleära extrakt. Ett tidsförlopp utfördes med användning av samma transkription / splitsning analys såsom i figur 2. De splitsningsintermediärer och produkter samt U6 snRNA och tRNA anges.
Discussion
Vi har etablerat en snabb och reproducerbar metod för framställning av nukleära extrakt från små mängder av HeLa-celler odlas som monoskikt. Vi visade att dessa utdrag robusta genom att visa att kinetiken och effektiviteten i RNAP II transkription / skarvning analyser är liknande i de småskaliga och bulk nukleära extrakt. Vi visade användbarheten av extrakt genom att visa att extrakt framställda från celler som behandlats med en splitsning hämmare läkemedel som är aktiva för transkription men defekt i splitsning.
Vår metod för att framställa små nukleära extrakt grundades genom att kombinera och optimera metoder som tidigare fastställts för att göra extrakt från HeLa-celler odlas i suspension i stor skala 1,8 och en metod för småskalig beredning av extrakt 9. Vi etablerat vårt protokoll eftersom de tidigare småskaliga extrakt inte fungerar för vissa analyser, såsom den kopplade transkription / splicing analys. En viktig skillnad mellan den tidigare småskaliga protokoll 9 och vår är att vi optimerat förutsättningarna för lysera celler med användning av mini-Dounce medan det tidigare protokollet lyseras cellerna genom att skjuta dem genom en liten nål 9. Nålen-lys resulterar i bubblor, som kan förklara varför extrakten var inaktiva och / eller svårt att reproducera för vissa analyser. Vi har även lagt en koncentration steg för att våra protokoll. Detta steg ökar aktiviteten av extrakten som är extremt känsliga för koncentration, och även begränsar variationen mellan extrakt som är inneboende i småskaliga preparat. Slutligen våra förberedelser rutinmässigt utföras med endast tre 150 mm plattor av monoskiktceller, utan någon signifikant effekt på aktivitet jämfört med bulk extrakt. Således är förfarandet lätt mottaglig för småskaliga preparat som kräver kostsamma reagenser eller begränsad cell tillgänglighet. Till exempel har vi förberett smaLL-skala extrakt från RNAi knockdown celler och från kronisk lymfatisk leukemi (KLL) patientens celler och använde dessa utdrag funktionella och / eller biokemiska analyser (EGF, JLH, TY och RR, opublicerad). Vi har funnit att de extrakt är värdefulla för RNAi följt av specifika biokemiska analyser, såsom immunopreciptations, Westerns och silverfärgning. Efter att ha utarbetat effekten av riva ned ett visst protein, kan en mer detaljerad studie utföras genom att göra en stabil knockdown cell-linje, som kan användas för att förbereda ytterligare utdrag till lägre kostnad. Masspektrometri av proteiner som förekommer i immunutfällningar som erhållits från dessa linjer knockdown cell kommer också att vara en användbar tillämpning av metoden. Förutom den kopplade transkription / skarvning analys som vi använde som exempel för vår protokollet beskrivning här, bör småskaliga extrakt vara tillämplig för många funktionella och biokemiska analyser, såsom de som används för de olika stEPS i genuttryck (t.ex. capping, splitsning, transkription, polyadenylering, mikroRNA bearbetning). Protokollet kan även anpassas för patientens celltyper som kan vara antingen som erhållits i suspension (såsom CLL-celler) eller odlas i kultur (t.ex. patientens fibroblaster). Slutligen bör den cytoplasmatiska fraktionen som erhållits under förfarandet visa sig vara användbara för både funktionella och biokemiska analyser som kräver cytoplasman.
Disclosures
Produktion och fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Abcam, Plc.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valencia, K. Dufu, H. Cheng för användbara diskussioner. HeLa-celler erhölls från National Cell Culture Center (Minneapolis, MN). Vi tackar också Eisai Co, Ltd för att tillhandahålla E7107 och Nikon Imaging Center vid Harvard Medical School för hjälp med ljusmikroskop. Detta arbete stöddes av en NIH bidrag GM043375 RR och fonden och NRSA gemenskap med JLH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
| MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
| KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
| PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
| DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
| EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
| Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
| DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
| FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
| PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
| Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
| 150mm Plates | VWR | 353025 | |
| Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
| Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
| Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
| Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 | |
| Table 1. Specific Reagents and Equipment. | |||
| Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
| 10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
| 1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
| 1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
| 25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
| Bring up to 100 ml with water | |||
| Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
| 100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
| 0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
| 20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
| 0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
| 0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
| Bring up to 500 ml with water | |||
| Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation. | |||
References
- Krainer, A. R., Maniatis, T., Ruskin, B., Green, M. R. Normal and mutant human beta-globin pre-mRNAs are faithfully and efficiently spliced in vitro. Cell. 36, 993-1005 (1984).
- Ghosh, S., Garcia-Blanco, M. A. Coupled in vitro synthesis and splicing of RNA polymerase II transcripts. Rna. 6, 1325-1334 (2000).
- Das, R. Functional coupling of RNAP II transcription to spliceosome assembly. Genes Dev. 20, 1100-1109 (2006).
- Hicks, M. J., Yang, C. R., Kotlajich, M. V., Hertel, K. J. Linking splicing to Pol II transcription stabilizes pre-mRNAs and influences splicing patterns. PLoS Biol. 4, e147 (2006).
- Yu, Y., Das, R., Folco, E. G., Reed, R. A model in vitro system for co-transcriptional splicing. Nucleic Acids Res. 38, 7570-7578 (2010).
- Kotake, Y. Splicing factor SF3b as a target of the antitumor natural product pladienolide. Nat. Chem Biol. 3, 570-575 (2007).
- Folco, E. G., Coil, K. E., Reed, R. The anti-tumor drug E7107 reveals an essential role for SF3b in remodeling U2 snRNP to expose the branch point-binding region. Genes. 25, 440-444 (2011).
- Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 11, 1475-1489 (1983).
- Lee, K. A., Bindereif, A., Green, M. R. A small-scale procedure for preparation of nuclear extracts that support efficient transcription and pre-mRNA splicing. Gene Anal. Tech. 5, 22-31 (1988).
