Summary
一个
Abstract
这是众所周知的，成熟的神经元在中枢神经系统（CNS）不能再生它们的轴突受伤后，由于减少的内在能力，以支持在1,2成熟的中枢神经系统轴突生长和充满敌意的环境。相比之下，在成熟的神经元周围神经系统（PNS）的再生容易受伤后3。成年猫背根神经节（DRG）神经元是众所周知的有力周围神经损伤后再生。每背根神经节神经元增长1轴突从胞体，分支成两个轴突分支：外围分支支配外围目标和中央部门，延伸到脊髓。损伤的背根神经节的末梢神经轴突大量的轴突再生的结果，而中央在脊髓轴突再生的受伤后不佳。但是，如果发生周围性轴索损伤脊髓损伤（这个过程被称为空调病变），中央轴突再生前是greatlŸ提高4。此外，中央DRG神经元轴突共享降皮质脊髓轴突充满敌意的环境。在一起，这是假设，控制成年DRG神经元的轴突再生的分子机制可以利用，以提高中枢神经系统轴突再生。因此，现在广泛使用的成人DRG神经元作为一个模型系统研究再生轴突生长5-7。
在这里，我们描述了一个成人，DRG神经元培养轴突再生的基因研究在体外可以使用的方法。在这个模型成年DRG神经元的基因通过电穿孔介导的基因转染6,8操纵。转染神经元的DNA质粒或SI / shRNA的，这种方法能够使增益和亏损的功能试验，以调查任何在成年DRG神经元的轴突生长的基因利益的作用。当神经元与SI / shRNA的转，有针对性的内源性蛋白通常耗尽后3-4天，在文化，在这期间，强大的轴突生长已经发生，减少损失的功能研究有效。为了解决这个问题，这里介绍的方法，包括一个染后的再悬浮和再镀步，使轴突从神经元的目标蛋白质的情况下重新长出。最后，我们利用体外模型研究轴突再生相关基因c-Jun的作用，在调解成年DRG神经元的轴突生长提供了一个例子。
Protocol
1。盖玻片，培养基，消化酶的制备
- 12毫米的圆形＃1盖玻片用于神经元的文化。清洁的盖玻片，10％HCL一夜之间随后用蒸馏水和去离子水超声波清洗3次（20分钟/次）。清洗盖玻片存储在70％乙醇以供将来使用。在每次实验中，盖玻片是空气干燥，并放置到培养皿。
- 涂层干燥的盖玻片，100μL涂层溶液含有100微克/毫升聚-D-赖氨酸和10微克/毫升层粘连工作的解决方案添加到每个盖玻片转移到37℃培养箱培养板。 1-2小时后，被删除的涂层解决方案和盖玻片用无菌1×PBS洗涤3次。
- 准备培养基，最低基本培养基（MEM）的5％胎牛血清（FBS）1X青霉素，链霉素溶液（500单位的青霉素辅以林链霉素和500微克），1X GlutaMAX我的补充，和抗有丝分裂剂含有20μM的5 - 氟-2 - 脱氧和20μM尿苷（复旦/ R）的。无血清培养基，胎牛血清被替换与补充B27的。
- 胶原酶准备一个解决方案所具有的MEM粉末溶解胶原酶的工作浓度为1毫克/毫升。为胰蛋白酶，的1X TrypLE的快速使用。
2。成年小鼠DRG神经元的解剖和收获
- 安乐死的6 - 10周龄成年小鼠后，去除背部皮肤和切断整个脊柱。清洗删除脊柱1×PBS的2-3倍。
- 引脚删除脊柱腹朝上，夹层板和感觉神经暴露在解剖显微镜下仔细去除肌肉。木材一级连接到背根节神经厚，很容易找到。因此，对于大多数实验只腰背根节收获。
- 通过每个椎体沿中心线与小剪刀剪下，小心地取出椎间盘。使用镊子分裂每个椎体暴露脊髓。
- 解剖木材背根节，用钳子举起每个腰神经向脊髓跟踪找到相关的腰病种付费（从L1到L6）。
- 从每个连接的末梢神经，背，腹根弹簧剪刀切断背根神经节，并存储在MEM培养基离心管置于冰上。更多的病种付费在脊髓水平不同（ 如胸病种付费）可以以类似的方式，必要时解剖。
3。成年小鼠DRG神经元的消化和离解
- 收集所有的解剖病种付费后，将用1毫升胶原酶一个解决方案MEM培养基，在37°C孵育90分钟的离心管。
- 取代胶原酶一个解决方案，以便用500μl1X TrypLE快递lution和孵化，在37°C的15-20分钟。
- 删除的TrypLE的Express解决方案和用1毫升准备好的文化中期的3倍（含5％FBS）的病种付费。
- 加入600μL培养基，轻轻吸取向上和向下磨碎使用1毫升蓝色为20-30倍组织，毕业于枪头。
- 研磨后，允许非游离组织落户底部的离心和细胞悬液转移至10毫升无菌管。另外600μL培养基添加和重复的研磨步骤，直到大部分组织是分离的。获得的细胞悬液包含两个神经元和非神经细胞。在大多数情况下，从6背根节（〜5×10 4）细胞用于一个电反应。
4。通过电穿孔神经元遗传操纵
- 准备转染小鼠神经元混合DNA质粒（〜10微克Amaxa核转染的解决方案解决方案）或siRNA寡核苷酸（〜0.2 nmol之间）作出100转每微升的最终体积。
- 在室温下为7分钟680转离心分离细胞，弃上清，尽可能。加入准备转染的解决方案，并轻轻吸取向上和向下与200μL枪头重新挂起细胞的3-4倍。
- 转让与转染溶液电试管混合细胞悬液和electroporate使用的Amaxa Nucleofector系统方案的G-013的细胞。
- 电击后，立即加入500μL预温（37℃）培养液中含有胎牛血清试管和涂在所需的细胞密度培养板转移到所有的解决方案（约600μL）。实验需要再悬浮和再镀，塑料培养皿上培养神经元直接在高密度（10000-20000细胞/孔）。为实验，直接检查轴突生长，神经元是镀金的ONTO在较低的密度（3000-5000细胞/孔）镀膜玻璃盖玻片。培养板放入培养箱（37℃，5％CO 2）。
- 电镀时，神经元连接到基板后的四个小时，轻轻地用500μl新鲜和预热的培养基更换培养基（其中包含的Amaxa核转染的解决方案），并返回为更多的文化板的孵化器（37°C ，5％CO 2）。都培养基中含有胎牛血清或无血清培养基可用于在这一步。
5。培养成人背根神经节神经元轴突生长分析
- DNA质粒转染的神经元，基因表达利益（ 如绿色荧光蛋白），可以观察到，早在几个小时后电。对于与siRNA的转染的神经元，我们通常等待3-4天，以允许足够的内源性蛋白的消耗。培养的神经细胞可以直接固定在VARIO轴突生长分析我们的时间点（电击后1-4天），或重新暂停和重新镀分析轴突再生（见下文）。
- RNAi介导的损失函数研究，培养的神经细胞可以重新暂停，重新镀允许轴突再生神经元，其中有针对性的蛋白已经耗尽。这样做，取代旧的培养基1 ML预热的新鲜培养基和吸管轻轻地，重新暂停从培养板连接的神经元的6-10倍的高密度培养的神经元。由于非神经细胞（ 例如雪旺氏细胞）附加更严格的比神经细胞的培养皿中，重新悬浮细胞主要是神经元。
- 重新悬浮神经元转移到离心管中，轻轻磨碎的10-15倍，重新分解成单细胞悬液的细胞团块。
- 重制版到新制备的盖玻片再分离的神经元密度低（3000-5000细胞/孔），培养过夜（16-24小时）。
6。固定，免疫荧光染色，荧光成像
- 抽吸的介质，并添加4％多聚甲醛（PFA）（200μL/孔），在室温15-20分钟，修复细胞。 1X 3次PBS固定细胞，然后洗净。
- 吸出PBS及加入封闭液（1％牛血清白蛋白，0.1％的Triton X-100，2.0％正常山羊血清中的1X PBS）在室温下60分钟的固定神经元。
- 标签轴突，神经细胞是免疫与抗神经丝或反βIII的微管蛋白抗体染色。这样做，把对每个盖玻片石腊膜初级抗体溶液30μL-βIII微管蛋白抗体（1:1200稀释）下降。反转盖玻片，放置到主抗体溶液在室温下60分钟。
- 返回到原来的培养板盖玻片，用1X PBS洗3次。
- 重复的相同的程序为二级安tibody。
- 的盖玻片，用蒸馏水洗3次，然后装入载玻片，盖玻片与安装的解决方案（ 如延长Gold抗淬灭）。
- 染色的神经元可以与任何荧光显微镜系统配备一台数码相机成像。轴突长度测量和图像分析软件进行分析。
7。代表结果
在没有任何增值外生长因子的情况下，成年DRG神经元通常开始增长轴突先镀后48小时。常常表现出的轴突分支的形态（ 图1）。相比之下，再镀神经元开始电镀后只有几个小时延长轴突，轴突伸长分支（ 图2），大大减少。这些结果表明，再镀神经元损毁神经元的空调有着相似的性质。通过使用这种方法，我们最近进行亏损的功能研究，探讨从成人的背根神经节神经元在体外轴突再生相关的转录因子c-Jun在轴突生长的作用。结果表明，电，一组4种不同的siRNAs，针对不同地区的c-Jun（ON-TARGETplus）显着减少成年DRG神经元中c-Jun的蛋白水平，转染后第3天（ 图3）9。当神经元重新镀和培养过夜，从c-Jun的击倒神经轴突生长，显着降低（控制：348.37±16.21毫米; SI-C君：262.32±15.69微米， 图3）9。这些结果表明，培养的成年DRG神经元提供了一个有用的模型系统研究从成人神经轴突生长。
图1。成年小鼠DRG神经元培养密度低的为3天。具有抗染色的神经元 - ＆BETA;三，微管蛋白的抗体。请注意，大多数轴突显示分支形貌。比例尺：125微米。
图2。再镀成年鼠背根神经节神经元后，3天中文化。 （一）培养成人DRG神经元的高密度为3天。 （二）再镀成年DRG神经元培养过夜低密度。请注意，大多数轴突显示拉长形态与小轴突分支。比例尺：250微米和125微米在B
图3。从体外成人DRG神经元的轴突生长c-Jun的作用。 （一）西方blot分析c-Jun的成年鼠背根神经节神经元的c-Jun的siRNAs的电击后。结果表明：c-Jun的水平显着降低。 （二）长大后重新电镀，过夜培养与EGFP转染的控制神经元的长轴突。 （三）公司的反fection的c-Jun的siRNA和EGFP受损成年后重新电镀，过夜培养背根神经节神经元的轴突生长。红：Tuj-1染色;绿色：绿色荧光蛋白。比例尺：125微米。这些成果已发表 在Saijilafu等9。
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Discussion
成年DRG神经元在体内和体外的周围神经损伤后轴突再生强劲，从而提供了一个有用的系统研究在成年动物的神经轴突再生。成年DRG神经元在体外培养成为一种广泛使用的方法来研究的分子机制轴突再生的调节。 在体外培养成年小鼠DRG神经元的过程中所提出的在这里可以迅速和有效的再生轴突生长的遗传研究。再悬浮和再镀过程是亏损的功能研究特别有用，因为它允许轴突重新长出，从神经元中的目标蛋白已经被耗尽。此外，再镀培养的DRG神经元模仿体内调理病变效果，从而提供了更多的生理有关的方法来研究在体外轴突再生。
转染效率的成人，DRG列印eurons描述电的方法是取决于质粒DNA的结构，这是足够的轴突生长的形态分析，大小约20-50％。病毒介导的基因转移到电相比，具有更高的效率，这是适合使用DRG神经元的生化分析。然而，建设和生产的利益，每个基因的病毒，更劳动密集和费时。的siRNA寡核苷酸，转染效率可达到近90％的基础上击倒目标蛋白质（ 见图3A），这使得成人背根神经节神经元可能的生化分析效率。然而，siRNAs的效果降低后较长时期，由于siRNA的寡核苷酸的降解。
当神经元以1:1的比例混合2质粒共同转染，规模较小的质粒通常具有较高的比规模较大的质粒转染效率。作为AResult，调整两个质粒的比例将相应地改变共同转染效率。转染，我们经常共同转染与绿色荧光蛋白标记的神经元的神经元。由于siRNA的寡核苷酸是比绿色荧光蛋白少得多，他们的转染效率要高得多。因此，在我们的实验中，我们普遍认为所有EGFP阳性神经元也积极的siRNAs。
许多成年DRG的周边切断后神经元的基因分析研究，已经确定了大量的再生相关基因（RAGS）10-12，这被认为是成年DRG神经元的再生能力的基础。然而，这些碎织物在调解成人DRG神经元轴突生长的功能没有得到很好的特点。在这里，我们研究的一个众所周知的抹布，c-Jun的作用，在调解通过RNAi介导的损失函数的方法从成年DRG神经元轴突生长。这种方法提供了一个有价值的体外工具去管理TE其他碎织物调控轴突再生的作用。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
FZ型从NIH（R01NS064288）和克雷格H.尼尔森基金会的赠款，以支持这项工作。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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