Summary
Een
Abstract
Het is algemeen bekend dat volwassen neuronen in het centrale zenuwstelsel (CZS) kunnen niet hun axonen regenereren na blessures als gevolg van verminderde intrinsieke vermogen om axon groei en een vijandige omgeving in de volwassen CZS 1,2 ondersteunen. In tegenstelling tot volwassen neuronen in het perifere zenuwstelsel (PNS) gemakkelijk te regenereren na blessures 3. Volwassen dorsale wortel ganglion (DRG) neuronen zijn goed bekend bij krachtig regenereren na perifere zenuwletsels. Elke DRG neuronen groeit een axon van de cel soma, met vestigingen in twee axonale bedrijfstakken: een perifere tak innerveren perifere doelen en een centrale vestiging zich uitstrekt tot in het ruggenmerg. Letsel van de DRG perifere axonen resulteert in een aanzienlijke regeneratie van axonen, dat de door centrale axonen in het ruggenmerg slecht regenereren na het letsel. Echter, als de perifere axonale schade optreedt voorafgaand aan het ruggenmerg (een proces genaamd de conditionering laesie), regeneratie van het centrum van axonen is greatly verbeterd 4. Bovendien is de centrale axonen van DRG neuronen dezelfde vijandige omgeving als dalende corticospinale axonen in het ruggenmerg. Samen, wordt verondersteld dat de moleculaire mechanismen die regeneratie van axonen van de volwassen DRG neuronen kan worden aangewend om CNS regeneratie van axonen te verbeteren. Als gevolg daarvan zijn volwassen DRG neuronen nu op grote schaal gebruikt als een modelsysteem om te studeren regeneratieve axon groei van 5-7.
Hier beschrijven een werkwijze voor volwassenen DRG neuron cultuur kan worden gebruikt voor genetische studie van axon regeneratie in vitro. In dit model volwassen DRG neuronen zijn genetisch gemanipuleerd via elektroporatie-gemedieerde gen transfectie 6,8. Door transfecteren neuronen met DNA-plasmide of Si / shRNA, deze aanpak maakt zowel winst-en verlies-van-functie experimenten om te onderzoeken de rol van elk gen-of-interest in axon groei van volwassen DRG neuronen. Wanneer neuronen worden getransfecteerd met si / shRNA, de beoogde endogene eiwit ismeestal leeg is na het 3-4 dagen in cultuur, gedurende welke tijd robuuste axongroei al heeft plaatsgevonden, waardoor de verlies-van-functie studies minder effectief. Als oplossing voor dit probleem beschreven methode omvat een resuspensie en opnieuw uitplaten stap na transfectie, waardoor axons opnieuw groeien neuronen in afwezigheid van de gerichte eiwit. Tot slot geven we een voorbeeld van het gebruik van deze in vitro model om de rol van een axon regeneratie-geassocieerde gen, c-Jun, studeren in het bemiddelen axon groei van volwassen DRG neuronen 9.
Protocol
1. Voorbereiding van Dekglaasjes, kweekmedium, en Spijsvertering Enzymen
- De 12 mm rond nr.1 dekglaasjes worden gebruikt voor het neuronale cultuur. De dekglaasjes worden gereinigd met 10% HCl gevolgd door overnacht ultrasone wassen met gedestilleerd en gedeïoniseerd water 3 keer (20 min / uur). De gereinigde dekglaasjes worden opgeslagen in 70% ethanol voor toekomstig gebruik. Voor elke experimenten, de dekglaasjes worden de lucht gedroogd en geplaatst in de cultuur plaat.
- Om de gedroogde laag dekglaasjes, 100 ul coating oplossing die 100 pg / ml poly-D-lysine en 10 pg / ml Laminine werkende oplossing toegevoegd op elk dekglaasje en de petrischaal overgebracht in een 37 ° C incubator. Na 1-2 uur wordt de coating oplossing verwijderd en de dekglaasjes gewassen 3 keer met steriele PBS 1X.
- Om het kweekmedium, de Minimum Essential Medium (MEM) voor te bereiden wordt aangevuld met 5% foetaal bovine serum (FBS), 1x penicilline-streptomycine-oplossing (500 eenheden van penicillin en 500 ug streptomycine), 1X Glutamax I-supplement en mitotische reagentia met 20 uM 5-fluor-2-deoxyuridine en 20 uM uridine (FDU / R). Voor de serum-vrij medium, wordt het FBS vervangen door supplement B27.
- De collagenase Een oplossing wordt bereid door collagenase een poeder MEM een werkend concentratie van 1 mg / ml. Voor de trypsine wordt de 1X TrypLE Express gebruikt.
2. Dissectie en Oogst van volwassen muis DRG neuronen
- Na de euthanasie van de 6 - tot 10-weken oud volwassen muis, verwijder dan de dorsale huid en snijd de hele wervelkolom. Was de verwijderde wervelkolom met 1 x PBS 2-3 keer.
- Speld de verwijderde wervelkolom om de plaat met het ontleden van ventrale kant naar boven, en zorgvuldig verwijdert spieren om de sensorische zenuwen bloot onder een stereomicroscoop. De zenuwen verbonden met DRG's op het hout niveau zijn de dikste en eenvoudig te vinden. Daarom is voor de meeste proeven uitsluitend de lumbaleDRG's worden geoogst.
- Knip elke wervel langs de middellijn met een klein schaartje en verwijder voorzichtig de tussenwervelschijven. Met behulp van een tang om elke wervel te splitsen naar het ruggenmerg bloot te leggen.
- Te ontleden uit het hout DRG's, verhef elk hout zenuw met een pincet en trek in de richting van het ruggenmerg naar de bijbehorende lumbale DRG's (van L1 tot L6) te vinden.
- Snij elke DRG van bijgevoegde perifere zenuwen, dorsale en ventrale wortels met de lente schaar, en bewaar het op microfugebuis met MEM-medium op ijs geplaatst. Meer DRG op verschillende wervelkolom niveau (bijvoorbeeld thoracale DRGs) worden ontleed in een soortgelijke wijze als dat nodig.
3. Spijsvertering en dissociatie van volwassen muis DRG neuronen
- Na verzamelen van alle ontleed DRGs, vervangen MEM medium met 1 ml collagenase Een oplossing en geïncubeerd de microfugebuis bij 37 ° C gedurende 90 minuten.
- Vervang collagenase Een oplossing met 500 ul 1X TrypLE Express zoluchtverontreiniging en incuberen bij 37 ° C gedurende 15-20 minuten.
- Verwijder de TrypLE Express-oplossing en was de DRG's met 1 ml bereide voedingsbodem (met 5% FBS) voor de 3 keer.
- Voeg 600 ul kweekmedium en voorzichtig pipetteer op en neer naar de weefsels fijnstampen voor 20-30 keer met een 1 ml blauw, afgestudeerd pipetpunt.
- Na aanwrijving, zodat het niet gedissocieerde weefsels naar beneden naar de bodem van de microfuge en de celsuspensie over in een 10 ml steriele buis. Voeg nog eens 600 ul kweekmedium en herhaal de trituratie stap tot de meeste weefsels kunnen worden gescheiden. De verkregen celsuspensie bevat zowel neuronen en niet-neuronale cellen. In de meeste gevallen worden de cellen van 6 DRGs (~ 5 x 10 4) voor een elektroporatie reactie.
4. Genetische Manipulatie van neuronen via Elektroporatie
- Bereid de transfectieoplossing door mengen Amaxa nucleofectie oplossing muis neuronen met DNA plasmiden (~ 10 pg) Of siRNA oligo (~ 0,2 nmol) tot een eindvolume van 100 pi voor elke transfectie maken.
- Centrifugeer de gescheiden cellen 680 rpm gedurende 7 min bij kamertemperatuur en verwijderen supernatant zoveel mogelijk. Voeg de voorbereide transfectieoplossing en zachtjes op en neer pipetteren 3-4 keer met 200 ul pipetpunten opnieuw schorsing van de cellen.
- Breng de celsuspensie gemengd met de transfectie oplossing voor de elektroporatie cuvette en electroporate de cellen met behulp van de Amaxa Nucleofector systeemprogramma G-013.
- Na electroporatie, onmiddellijk aan 500 pi van voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium met FBS de cuvet en alle aan de oplossing (ongeveer 600 pi) in de beklede petrischaal op de gewenste celdichtheden. Voor experiment resuspensie en re-plating vereist zijn neuronen direct gekweekt op de kunststof kweekschaal met hoge dichtheid (10.000-20,000 cellen / putje). Voor experiment dat direct onderzoekt axongroei, neuronen zijn vergulde onto gecoat glas dekglaasjes bij een lagere dichtheid (3000-5000 cellen / putje). Plaats de cultuur plaat in de incubator (37 ° C, 5% CO 2).
- Vier uur na plating wanneer neuronen hebben gehecht aan de substraten, voorzichtig op hun plaats het kweekmedium (die de Amaxa nucleofectie oplossing) met 500 ul vers en voorverwarmd kweekmedium, en keer terug de plaat naar de incubator voor extra cultuur (37 ° C , 5% CO2). Beide kweekmedium dat FBS of serum-vrij medium kan worden in deze stap.
5. Het kweken van volwassen DRG neuronen voor Axon Groei Analyse
- Voor neuronen getransfecteerd met DNA-plasmiden, kan de expressie van gen-of-interest (bijv. EGFP) worden waargenomen vanaf een paar uur na elektroporatie. Voor neuronen getransfecteerd zijn met siRNA's, we meestal 3-4 dagen wachten om voldoende uitputting van de endogene eiwitten mogelijk te maken. De gekweekte neuronen hetzij rechtstreeks kan worden vastgesteld voor axongroei analyse op varioons tijdstippen (1-4 dagen na elektroporatie) of opnieuw geschorst en opnieuw bekleed met axon hergroei (zie hieronder) te analyseren.
- Voor RNAi-gemedieerde verlies-van-functie studies kunnen de gekweekte neuronen worden geresuspendeerd en opnieuw geplaat-om axonen naar regrow van neuronen, waarbij de gerichte eiwitten reeds uitgeput. Om dit te doen, vervang de oude kweekmedium van de high-density gekweekte neuronen met 1 ml voorverwarmde vers medium en pipet voorzichtig op en neer voor de 6-10 keer opnieuw te schorten, de bijgevoegde neuronen van de cultuur plaat. Omdat niet-neuronale cellen (bijv. Schwann cellen) veel strakker hechten aan de cultuur schotel dan neuronen, de re-gesuspendeerde cellen zijn meestal neuronen.
- Breng het opnieuw gesuspendeerd neuronen in een microfugebuis en voorzichtig fijnstampen 10-15 keer naar de cel klonten opnieuw distantiëren in de enkele celsuspensie.
- Re-bord van de re-gesplitste neuronen op nieuw bereide dekglaasjes bij een lage dichtheid (3000-5000 cellen / putje) en cultuur 's nachts (16-24 uur).
6. Fixatie, immuno-kleuring, en fluorescentie beeldvorming
- Zuig het medium en voeg 4% paraformaldehyde (PFA) (200 ul / well) om de cellen gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur vast. De vaste cellen worden vervolgens gewassen met PBS 1X 3 keer.
- Zuig het PBS en voeg blokkeeroplossing (1% runderserumalbumine, 0,1% Triton X-100, 2,0% normaal geitenserum in 1X PBS) aan de vaste neuronen 60 min bij kamertemperatuur.
- Om label axonen, de neuronen zijn immuno-gekleurd met anti-neurofilamenten of anti-βIII tubuline antilichaam. Om dit te doen, plaatst u een 30μl daling van de primaire antilichaam-oplossing (1:1200 verwatering voor de-βIII tubuline antilichaam) op een parafilm voor elke dekglaasje aan. Keer de dekglaasjes en plaats deze op het primaire antilichaam oplossing gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
- Keer terug dekglaasjes naar de oorspronkelijke cultuur van bord en was ze met 1X PBS voor de 3 keer.
- Herhaal dezelfde procedure voor de secundaire eentibody.
- Was de dekglaasjes met gedestilleerd water voor 3 keer, en dan dekglaasjes monteren op glas dia's met de montage-oplossing (bijvoorbeeld ProLong Gold Antifade).
- De gebrandschilderde neuronen kunnen worden afgebeeld met een fluorescentie-microscopie-systeem uitgerust met een digitale camera. De axon lengtes worden gemeten en geanalyseerd met beeldvorming analyse software.
7. Representatieve resultaten
Bij het ontbreken van enig toegevoegd extracellulaire groeifactoren, de volwassen DRG neuronen meestal beginnen te groeien axonen 48 uur na de eerste platen. De axonen vertonen vaak vertakte morfologie (figuur 1). In tegenstelling, de re-plated neuronen beginnen te verlengen axons enkele uur na platen, en de langwerpige axonen met veel minder vertakking (figuur 2). Deze resultaten suggereren dat re-plated neuronen vergelijkbare eigenschappen te delen met die van conditionering gelaedeerde neuronen. Door deze aanpak zijn we recent uitgevoerde verliesvan-functie studies naar de rol van de regeneratie van axonen bijbehorende transcriptiefactor c-Jun in axon groei te onderzoeken van volwassen DRG neuronen in vitro. De resultaten toonden aan dat elektroporatie van een groep van 4 verschillende siRNA waarbij verschillende gebieden van c-Jun (ON-TARGETplus) aanzienlijk het eiwitgehalte van c-Jun verlaagd volwassen DRG neuronen 3 dagen na transfectie (Figuur 3) 9. Als de neuronen werden opnieuw verguld en overnacht gekweekt, axon groei van c-Jun knockdown neuronen was significant verminderd (Control: 348,37 ± 16.21mm, si-c-Jun: 262,32 ± 15,69 micrometer, figuur 3) 9. Deze resultaten geven aan dat gekweekte volwassen DRG neuronen een bruikbaar modelsysteem om axongroei bestuderen van volwassen neuronen.
Figuur 1. Volwassen muis DRG neuronen gekweekt bij lage dichtheid voor 3 dagen. De neuronen werden gekleurd met anti - & beta; III tubuline antilichaam. Merk op dat de meeste axonen vertakte morfologie te laten zien. Schaal bar: 125 pm.
Figuur 2. Re-plating volwassen muis DRG neuronen na 3 dagen in de cultuur. (A) Adult DRG neuronen gekweekt bij hoge dichtheid voor 3 dagen. (B) Re-plated volwassen DRG neuronen werden gekweekt bij lage dichtheid voor de overnachting. Merk op dat de meeste axon tonen langwerpige morfologie met weinig axon vertakking. Schaal bar: 250 micrometer in A en 125 micrometer in B.
Figuur 3. De rol van c-Jun in axon groei van volwassen DRG neuronen in vitro. (A) Western blot analyse van c-Jun in volwassen muis DRG neuronen na elektroporatie van c-Jun siRNA's. Het resultaat toont duidelijk verlaagd niveau van c-juni (B) Controle neuronen getransfecteerd met EGFP lange axonen groeide na de re-plating en overnachting cultuur. (C) Co-transFection van c-Jun siRNA's en EGFP verminderde axon groei van volwassen DRG neuronen na re-plating en overnachting cultuur. Rood: tuj-1 kleuring, Groen: EGFP. Schaal bar: 125 pm. Deze resultaten zijn gepubliceerd in Saijilafu et al.. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volwassen DRG neuronen hun axonen regenereren robuust na perifere zenuwschade in vivo en in vitro, en zo een nuttig systeem om regeneratie van axonen studie bij volwassen dieren. In vitro cultuur van volwassen DRG neuronen wordt steeds een veel gebruikte methode om de moleculaire mechanismen te onderzoeken waardoor regeneratie van axonen wordt geregeld. De in vitro procedure van het kweken van volwassen muis DRG neuronen die hier in staat stelt snel en doeltreffend genetische studie van regeneratieve axon groei. De resuspensie en re-plating procedure is met name nuttig voor verlies-van-functie studies omdat het mogelijk maakt axonen opnieuw groeien van neuronen waarin de beoogde eiwit al is uitgeput. Bovendien re-plating gekweekte neuronen DRG nabootst een in vivo conditionering laesie effect, zodat een meer fysiologisch relevante benadering axon regeneratie bestuderen in vitro.
De transfectie-efficiëntie van volwassen DRG neurons de beschreven elektroporatie benadering ongeveer 20-50% van DNA plasmiden, afhankelijk van de grootte van de constructen die voldoende is voor Morfologische analyse van axongroei. Vergeleken met elektroporatie de virale gemedieerde genoverdracht is veel hoger rendement, die geschikt is voor biochemische analyse met zenuwcellen DRG. Echter, de bouw en het produceren van virus voor elk gen-of-interest is veel meer arbeidsintensief en tijdrovend. Voor siRNA oligo, de transfectie-efficiëntie kan bijna 90% gebaseerd op het slopen efficiëntie van de gerichte eiwitten (zie figuur 3A), welke biochemische van volwassen DRG neuronen mogelijk maakt. Het effect van siRNA vermindert na langer door de afbraak van de siRNA oligo.
Wanneer neuronen gecotransfecteerd met 2 plasmiden gemengd in de verhouding 1:1, het plasmide met kleinere heeft gewoonlijk hoger transfectie-efficiëntie dan het plasmide met groter. Als aresultaat zal aanpassing van de verhouding van de twee plasmiden verander dan de co-transfectie-efficiëntie. Voor siRNA transfectie we vaak samen transfecteren de neuronen met EGFP te labelen neuronen. Omdat de siRNA-oligo is veel kleiner dan EGFP, de transfectie-efficiëntie veel hoger. Daarom is in onze experimenten hebben we over het algemeen denken dat alle EGFP positieve neuronen zijn ook positief voor siRNA's.
Veel genetische profielen onderzoeken bij volwassen DRG neuronen na perifere axotomy hebben een groot aantal regeneratie-geassocieerde genen (vodden) 10-12, die worden verondersteld om de regeneratie vermogen van volwassen DRG neuronen ten grondslag liggen. Echter, de functies van deze doeken in het bemiddelen axon groei van de volwassen DRG neuronen niet goed gekarakteriseerd. Hier hebben we gekeken naar de rol van een bekende RAG, c-Jun, in het bemiddelen axon groei van volwassen DRG neuronen via RNAi-gemedieerde verlies-van-functie aanpak. Deze methode levert een belangrijke in vitro hulpmiddel onderzoekente de rol van andere doeken in de regulering van regeneratie van axonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies te FZ uit NIH (R01NS064288) en de Craig H. Neilsen Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
