Summary
不定冠詞
Abstract
それはよく、中枢神経系（CNS）の成熟したニューロンが成熟した中枢神経系の1,2軸索の成長と敵対的な環境をサポートするために減少した固有の能力に起因する負傷した後に軸索を再生成することができないことが知られている。対照的に、末梢神経系（PNS）の成熟したニューロンが傷害3の後に容易に再生成します。成人後根神経節（DRG）ニューロンはよく末梢神経損傷後、確実に再生することが知られています。周辺ターゲットと脊髄に延びる中央の分岐を支配末梢枝：各DRGニューロンは細胞体から、どの枝2軸索の枝に1軸索を成長します。実質的な軸索再生におけるDRGの末梢軸索結果の損傷は、脊髄の中心的な軸索のに対し、損傷後の不十分な再生成します。末梢軸索損傷は、脊髄損傷（プロセスがコンディショニング病変と呼ばれる）、中央の軸索の再生の前に発生した場合は、greatlです。yは4を改善しました 。また、DRGニューロンの中央の軸索は、脊髄での皮質脊髄軸索を降順同じ敵対的な環境を共有しています。一緒に、それは大人のDRGニューロンの軸索再生を制御する分子メカニズムは中枢神経系の軸索再生を向上させるために利用することができると仮定されています。その結果、成人DRGニューロンは、現在広く再生軸索成長5-7研究するモデル系として使用されています。
ここでは、in vitroでの軸索再生の遺伝学的研究に使用することができる大人のDRGニューロンの培養方法について説明します。このモデルでは、成人DRGニューロンは遺伝的にエレクトロポレーションによる遺伝子トランスフェクション6,8を介して操作されます。 DNAプラスミドまたはSI / shRNAを、このアプローチは大人のDRGニューロンからの軸索成長の任意の目的遺伝子の役割を調べるために、両方のゲインおよび機能喪失実験を可能にすると神経細胞をトランスフェクトすることにより。ニューロンは、SI / shRNAをトランスフェクトされると、対象となる内因性のタンパク質である通常あまり効果的で機能喪失の検討を進め、強固な軸索の成長が既に発生しているその間に、培養中の3-4日後の枯渇。この問題を解決するために、ここで説明する方法では、軸索が標的タンパク質の存在下でニューロンから再成長することができますトランスフェクション後の再懸濁および再メッキステップが含まれています。最後に、我々は成人DRGニューロンの9時から軸索成長を媒介する軸索再生関連遺伝子、c-Junの、の役割を研究するためにin vitroモデルでこれを使用する例を提供しています。
Protocol
1。カバーガラス、培養培地、消化酵素の調製
- の12 mmラウンド第1カバーガラスは、神経細胞の培養に使用されています。カバーガラスは一晩に3回（20分/時間）の蒸留脱イオン水と超音波洗浄、続いて10％塩酸で洗浄されています。きれいにカバースリップは、将来の使用のために70％エタノールに格納されています。各実験前に、カバーガラスは、空気乾燥させ、培養プレートに配置されます。
- コートに乾燥させたカバーガラスを、100μg/ mlのポリ-D-リジンと10μg/ mlのラミニン実用的なソリューションを含む塗布液の100μlを各カバースリップの上に追加され、培養プレートを37℃のインキュベーターに転送されます。 1〜2時間後、コーティング溶液を除去し、カバースリップは、滅菌1X PBSで3回洗浄されています。
- 培地、最小必須培地（MEM）を調製するが5％ウシ胎児血清（FBS）、1Xペニシリン - ストレプトマイシン溶液（房毛の500台で補足されるLINおよびストレプトマイシン500μg）を、1Xグルタミン-Iサプリメント、および20μM5 - フルオロ-2 - デオキシウリジンおよび20μMウリジン（FDU / R）を含む抗有糸分裂試薬。無血清培地では、FBSが補足B27に置き換えられます。
- コラゲナーゼは、溶液を1 mg / mlのワーキング濃度を作るためにコラゲナーゼのMEMと粉末を溶解して調製されています。トリプシンでは、1X TrypLE Expressが使用されています。
2。成体マウスDRGニューロンの解剖と収穫
- 6安楽死した後 - 10週齢の成体マウスに、背部皮膚を除去し、全脊柱を切った。 1 X PBSに2-3回で削除脊柱を洗浄します。
- 腹側アップ、と解剖プレートに削除脊柱を固定し、慎重に解剖顕微鏡下で感覚神経を露出させる筋肉を削除します。木材レベルでDRGSに接続されている神経が太いと見つけやすいです。したがって、ほとんどの実験のために腰椎のみDRGSは、収穫されます。
- 小さなハサミで中心線に沿って各椎骨を切って、慎重に椎間板を除去します。脊髄を露出するために、各椎骨を分割するために鉗子を使用します。
- 木材DRGSを解剖するには、鉗子でそれぞれの木材の神経を持ち上げると、関連腰椎DRGSを（L1からL6まで）を見つけるために脊髄に向かってトレースします。
- 接続された末梢神経、春のはさみで背腹根から各DRGを切断し、氷上に置いたMEM培地で遠心管に入れて保管してください。必要なときに別の脊髄レベル（ 例えば胸部DRGS）でより多くのDRGSは、同様の方法で切り出しすることができます。
3。成体マウスDRGニューロンの消化と解離
- すべての解剖DRGSを収集した後、1 mlのコラゲナーゼ溶液をMEM培地を交換し、90分間37℃で遠心チューブをインキュベートします。
- ので、500μlの1X TrypLE Expressを使用してコラゲナーゼ溶液を交換する37 lutionとインキュベート°C 15〜20分間。
- TrypLE Expressソリューションを削除し、3回のために1ミリリットル準備培地（5％FBSを含む）でDRGSを洗う。
- 600μlの培養液を加え、穏やかに1ミリリットル青を使用して20〜30倍のために組織をひいて粉にするために上下にピペッティングし、ピペットチップは卒業しました。
- 粉砕した後、非解離組織は微量の底に落ち着くと10 mlの滅菌チューブに細胞懸濁液を転送することができます。別の600μlの培養液を追加し、ほとんどの組織が解離されるまで摩手順を繰り返します。得られた細胞懸濁液は神経細胞と非神経細胞の両方が含まれています。ほとんどの場合、6 DRGS（〜5×10 4）からの細胞を1エレクトロポレーション反応に使用されています。
4。エレクトロポレーションを介した神経細胞の遺伝子操作
- DNAプラスミド（〜10μgのマウスニューロンAmaxaのヌクレオソリューションを混合することにより、トランスフェクション溶液を調製場合）またはsiRNAオリゴは（〜0.2 nmol）をそれぞれトランスフェクションのために100μlの最終容量を作る。
- 室温で7分間680 rpmで解離した細胞を遠心し、可能な限り上清を捨てる。準備されたトランスフェクション溶液を加え、穏やかに再懸濁細胞に200μlのピペットチップで3〜4回ピペッティングします。
- エレクトロポレーションキュベットにトランスフェクション溶液と混合した細胞懸濁液を転送しAmaxaのNucleofectorシステムプログラムG-013を用いて細胞をエレクトロポ。
- エレクトロポレーションした後、直ちにあらかじめ温めておいた（37℃）培養液をキュベットにFBSを含有し、所望の細胞密度でコーティングした培養プレートにすべての溶液（〜600μl）を移すの500μlを添加します。再懸濁および再メッキを必要とする実験では、ニューロンは、高密度（10000から20000細胞/ウェル）でプラスチック製の培養皿上で直接培養する。直接軸索の成長を調べた実験では、ニューロンがメッキONTです。低密度（3000-5000細胞/ウェル）でコーティングしたカバーガラスをO。インキュベーター（37℃、5％CO 2）に培養プレートを配置します。
- ニューロンは、基板に接続しためっき後四時間、静かに500μlの新鮮予め温めておいた培地で培養培地（Amaxaのヌクレオソリューションを含む）を交換して、追加の文化インキュベーターにプレートを戻す（37°C 、5％CO 2）。 FBSまたは無血清培地を含む培養培地の両方がこのステップで使用することができます。
5。軸索成長解析のための培養成人DRGニューロン
- DNAプラスミドでトランスフェクションのニューロンについては、目的遺伝子（ 例えば、EGFP）の発現は、エレクトロポレーション後、数時間、早ければ観察することができます。 siRNAでトランスフェニューロンでは、我々は通常内因性タンパク質の十分な枯渇を可能にするために3-4日を待ちます。培養神経細胞は、直接バリオにおける軸索成長解析のために固定することができます我々の時点（エレクトロポレーション後1-4日）または再懸濁させ、軸索の再成長を分析するために再播種します（下記参照）。
- RNAiによる機能喪失研究のために、培養神経細胞を再懸濁することができると軸索が標的タンパク質がすでに枯渇されたニューロンから、再成長できるようにするために再播種した。これを行うには、培養皿から接続された神経細胞を再懸濁するために6-10回のために1ミリリットル予め温めておいた新鮮な培地とピペット優しく上下の高密度培養ニューロンの古い培地を交換してください。非神経細胞（ 例えばシュワン細胞）の神経細胞より培養皿にはるかに厳しい添付するので、再懸濁した細胞は、主に神経細胞があります。
- マイクロチューブに再懸濁した神経細胞を移し、静かに、単一細胞懸濁液中に細胞塊を再解離する10〜15倍をひいて粉にする。
- 低密度（3000-5000細胞/ウェル）および培養で一晩、新しく調製したカバースリップ上に再プレートの再解離ニューロン（16-24時間）。
6。固定、免疫染色し、蛍光イメージング
- 培地を吸引除去し、室温で15〜20分間細胞を固定し、4％パラホルムアルデヒド（PFA）（200μl/ウェル）を追加します。固定した細胞は、その後3回の1X PBSで洗浄されています。
- PBSを吸引除去し、室温で60分間固定ニューロンにブロッキング液（1X PBS中1％ウシ血清アルブミン、0.1％トリトンX-100、2.0％正常ヤギ血清）を追加します。
- ラベルの軸索に、ニューロンは抗ニューロフィラメントまたは抗βIIIチューブリン抗体で免疫染色されている。これを行うには、各カバースリップのためにパラフィルム上で一次抗体溶液（-βIIIチューブリン抗体の1:1200希釈）の30μlドロップを配置します。カバースリップを反転し、室温で60分間一次抗体溶液の上に置きます。
- 元の培養プレートにカバースリップを返し、3回1X PBSで洗い流してください。
- 二次のために同じ手順を繰り返します。tibody。
- 3回蒸留水でカバーガラスを洗浄し、次にマウントソリューション（ 例えば Gold退色防止を延ばす）でスライドガラス上にカバースリップをマウントします。
- 染色されたニューロンは、デジタルカメラを搭載するすべての蛍光顕微鏡システムで撮像することができます。軸索の長さを測定し、画像解析ソフトウェアで解析されています。
7。代表的な結果
追加されたすべての細胞増殖因子の不在下で、成体のDRGニューロンは通常、最初にメッキした後に軸索を48時間の成長を開始します。軸索は、しばしば分枝状の形態（ 図1）を示しています。対照的に、再メッキのニューロンは、めっき後のわずか数時間の軸索を拡張し、軸索は大幅に削減分岐（ 図2）と伸長を開始します。これらの結果は、再メッキニューロンはエアコン病変の神経細胞と同様の特性を共有することをお勧めします。このアプローチを使用することによって、我々は最近、損失を実行したの機能は、研究in vitroでの大人のDRGニューロンから軸索成長の軸索の再生に関連する転写因子c-Junの役割に調べることができます。結果は（-TARGETplus ON）c-Junの異なる領域を標的と4 つの異なるsiRNAの群のエレクトロポレーションを示した顕著な3日間トランスフェクション（ 図3）9後の成人DRGニューロンにc-Junのタンパク質レベルを低下させた。 9：; c-Junのノックダウンニューロンからニューロンが再メッキと一晩培養し、軸索成長が著しく（262.32±15.69μmの、 図3 SI-c-Junの348.37±16.21ミリメートル制御）減少した。これらの結果は、培養された大人のDRGニューロンは成体ニューロンからの軸索成長を研究するための有用なモデルシステムを提供することを示しています。
図1成体マウスのDRGニューロンは3日間低密度で培養した。ニューロンは抗で染色した - ＆Bη、IIIチューブリン抗体。ほとんどの軸索は分枝状の形態を示すことに注意してください。スケールバー：125μmである。
図2。文化の中で3日後にDRGニューロンの再メッキ成体マウス。 （A）大人のDRGニューロンは3日間高い密度で培養した。 （B）再メッキ成人DRGニューロンは一晩のために低密度で培養した。そのほとんどの軸索はほとんど軸索分岐の細長い形態を示して注意してください。スケールバー：B.と125μmのでは250μm
図3。 試験管内で成人DRGニューロンから軸索成長におけるc-Junの役割。 （A）成体マウスにおけるc-Junのウェスタンブロット分析は、c-JunのsiRNAのエレクトロポレーション後のDRGニューロン。その結果、c-Junの著しく低下レベルを示します。 （B）EGFPをトランスフェクションコントロールニューロンは、再メッキ、一晩培養した後、長い軸索を成長した。 （C）のCo-トランスc-JunのsiRNAは、再メッキ、一晩培養後の成人DRGニューロンからEGFP障害軸索の成長クション。赤：TUJ-1染色、緑：EGFP。スケールバー：125μmである。これらの結果はSaijilafuらに公開されている9。
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Discussion
大人のDRGニューロンはこうして大人の動物では軸索の再生を研究するために有用なシステムを提供し、確実にin vivo及び in vitro における末梢神経損傷後に軸索を再生成します。大人のDRGニューロンのin vitro培養の分子メカニズムを調べるために広く使われている方式になってきているから軸索再生が規制されています。培養成体マウスDRGニューロンの in vitro の手順でここで、回生軸索の成長を迅速かつ効果的な遺伝学的研究を可能にし発表した。それは軸索が標的タンパク質が既に枯渇されているのニューロンから再成長することができますので、再懸濁および再メッキの手順では、機能喪失研究のために特に便利です。また、再度メッキ培養DRGニューロンはこのようにin vitroでの軸索の再生を研究する多くの生理学的に関連するアプローチを提供し、in vivoでのコンディショニング病変の効果によく似ています。
成人DRG nのトランスフェクション効率説明したエレクトロポレーションアプローチとeuronsは、軸索成長の形態素解析のために十分である構造体のサイズに応じてDNAプラスミドの場合、約20〜50％です。エレクトロポレーションと比較して、ウイルス媒介遺伝子伝達は、DRGニューロンを用いた生化学的解析に適してはるかに高い効率を持っています。しかし、構築し、各目的遺伝子のウイルスを生産する多くの労働集約的で時間がかかります。 siRNAオリゴの場合は、トランスフェクション効率が可能で大人のDRGニューロンの生化学的解析を行い、標的タンパク質（ 図3Aを参照）のノックダウン効率に基づいて約90％に達することができます。しかし、siRNAの効果は、siRNAオリゴの劣化に起因する長い期間の後に軽減されます。
ニューロンは1:1の比率で混合し2プラスミドで同時トランスフェクトされている場合、より小さいサイズのプラスミドは、通常より大きなサイズのプラスミドより高いトランスフェクション効率を持っています。 Arなどesultは、2つのプラスミドの比率を調整することにより、それに応じてコトランスフェクション効率を変更します。 siRNAのトランスフェクションのために、私たちはしばしばラベルのニューロンにEGFPとニューロンを共トランスフェクション。 siRNAオリゴは、EGFPよりもはるかに小さいので、それらのトランスフェクション効率ははるかに高くなっています。したがって、我々の実験で我々は一般的にすべてのEGFP陽性ニューロンはsiRNAにも陽性であると考えています。
末梢軸索切断後の成体DRGニューロンの多くは遺伝子プロファイリングの研究では、成人DRGニューロンの再生能力の根底にあると考えられている再生関連遺伝子の数が多い（RAGS）10-12を同定した。しかし、成人DRGニューロンの軸索成長を媒介するこれらRAGSの機能は十分に特徴付けされていない。ここでは、RNAiによる機能喪失のアプローチを介して成人DRGニューロンから軸索成長を媒介に、よく知られているRAG、c-Junの役割を検討した。このような方法はinvestigaにin vitroでのツールで、貴重なを提供していますTE軸索再生の調節の他のRAGSの役割。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、NIH（R01NS064288）とクレイグ·H.ニールセン財団からFZへの補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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