Summary
Um
Abstract
É bem conhecido que os neurónios maduros no sistema nervoso central (CNS) não pode regenerar os seus axónios após lesões devido a capacidade intrínseca diminuída para suportar o crescimento axonal e um ambiente hostil no CNS 1,2 madura. Em contraste, os neurónios maduros no sistema nervoso periférico (PNS) regenerar rapidamente após lesões 3. Adultos gânglio da raiz dorsal (DRG) neurónios são bem conhecidos para regenerar vigorosamente após lesões dos nervos periféricos. Cada neurônio DRG cresce um axônio da célula soma, que se divide em dois ramos: um ramo do axônio periférico inervação alvos periféricos e um ramo central se estende para a medula espinhal. Lesão dos DRG resultados periféricos axônios em regeneração do axônio substancial, enquanto os axônios centrais na medula espinhal regenerar mal após a lesão. No entanto, se a lesão periférica axonal ocorre antes da lesão da medula espinal (um processo denominado a lesão condicionado), a regeneração de axónios centrais é greatly melhorado 4. Além disso, os axónios dos neurónios centrais DRG partilham o mesmo ambiente hostil como decrescente axónios corticoespinhais na medula espinal. Juntos, é a hipótese de que os mecanismos moleculares que controlam a regeneração do axônio dos neurônios adultos DRG pode ser aproveitado para melhorar a regeneração do axônio do SNC. Como resultado, os neurónios DRG adultos são agora largamente utilizado como um sistema modelo para estudar o crescimento axonal regenerativo 5-7.
Aqui, descrevemos um método de cultura adulto neurónio de DRG que pode ser usado para o estudo genético de regeneração axonal in vitro. Neste modelo adulto neurônios DRG são geneticamente manipulados por meio de eletroporação transfecção mediada gene 6,8. Por transfecção de neurônios com DNA plasmídeo ou SI / shRNA, esta abordagem permite que as duas de ganho e perda de função de experimentos para investigar o papel de qualquer gene de interesse no crescimento do axônio dos neurônios DRG adultos. Quando os neurónios são transfectadas com SI / shRNA, a proteína endógena é orientadageralmente empobrecido após 3-4 dias em cultura, tempo durante o qual o crescimento axonal robusto já tenha ocorrido, tornando os estudos de perda de função-menos eficaz. Para resolver este problema, o método aqui descrito inclui um passo re-suspensão e re-plating após a transfecção, o que permite axónios de voltar a crescer a partir de neurónios na ausência da proteína alvo. Finalmente, fornecemos um exemplo da utilização deste modelo in vitro para estudar o papel de um gene axónio regeneração-associado, c-Jun, na mediação crescimento axonal de adulto DRG neurónios 9.
Protocol
1. Preparação de Lamelas, meio de cultura, e as enzimas da digestão
- A rodada de 12 mm # 1 lamelas de vidro são usados para a cultura neuronal. As lamelas são limpos com 10% de HCL durante a noite seguido por lavagem de ultra-sons com água destilada e desionizada por 3 vezes (20 minutos / hora). As lamelas limpos são armazenados em etanol a 70% para uso futuro. Antes de cada experimento, as lamelas são secos ao ar e colocado na placa de cultura.
- Para revestir as lamelas secos, 100 ul de solução de revestimento contendo 100 ug / ml de poli-D-lisina e 10 ug / ml de solução de laminina de trabalho é adicionado em cada lamela e da placa de cultura é transferida para uma incubadora a 37 ° C. Após 1-2 horas, a solução de revestimento é removida e as lamelas são lavadas 3 vezes com PBS estéril 1X.
- Para preparar o meio de cultura, o meio essencial mínimo (MEM) é suplementado com 5% de soro fetal bovino (FBS), 1X solução Penicilina-Estreptomicina (500 unidades de penicilinaLin e 500 ug de estreptomicina), 1X suplemento Glutamax-I, e os reagentes antimitóticos contendo 20 uM 5-fluoro-2-desoxiuridina e 20 uM uridina (FDU / R). Para o meio isento de soro, a FBS é substituído com o suplemento de B27.
- A colagenase-se uma solução preparada por dissolução de um pó com colagenase MEM para fazer uma concentração de trabalho de 1 mg / ml. Para a tripsina, a 1X TrypLE expresso é usado.
2. Dissecção e Colheita de neurônios de camundongos adultos DRG
- Após a eutanásia a 6 - para rato adulto de 10 semanas de idade, retire a pele dorsal e cortou toda a coluna vertebral. Lavar a coluna vertebral removido com 1 x PBS 2-3 vezes.
- Pino da coluna vertebral removido para a placa de dissecação com até lado ventral, e remove cuidadosamente músculos para expor os nervos sensoriais sob um microscópio de dissecação. Os nervos conectados ao DRGs a nível madeira são mais grosso e fácil de localizar. Por conseguinte, apenas para a maioria das experiências, a lombarDRGs são colhidos.
- Corte através de cada vértebra ao longo da linha central com uma tesoura pequena e remova cuidadosamente os discos intervertebrais. Utilizando uma pinça para dividir cada vértebra para expor a medula espinhal.
- Para dissecar os DRGs madeira, levante cada nervo madeira com uma pinça e traçar em direção à medula espinhal para localizar os DRGs associados lombares (L1 a L6).
- Corte cada DRG de nervo periférico em anexo, as raízes dorsal e ventral com uma tesoura de primavera, e armazená-lo em tubo de microcentrífuga com meio MEM colocada em gelo. DRGs Mais em diferentes níveis da coluna vertebral torácica (por exemplo, DRGs) pode ser dissecados para fora de uma forma semelhante, quando necessário.
3. Digestão e Dissociação de neurônios de camundongos adultos DRG
- Depois de recolher todos os DRGs dissecados, substituir o meio MEM com 1 ml de colagenase Uma solução e incubar o tubo de microcentrífuga a 37 ° C durante 90 min.
- Substituir solução de colagenase A com 500 uL 1X TrypLE expresso de modolução e incubar a 37 ° C durante 15-20 min.
- Remover a solução expresso TrypLE e lavar os DRGs com um meio de cultura ml preparada (contendo 5% de FBS) por 3 vezes.
- Adicionar 600 uL meio de cultura e suavemente pipetar cima e para baixo para triturar os tecidos durante 20-30 vezes utilizando um 1 ml azul, pipeta graduada ponta.
- Após trituração, permitir que os tecidos não-dissociados para se estabelecer a parte inferior da microcentrífuga e transferir a suspensão de células para um tubo de 10 ml estéril. Adicionar outro meio de cultura 600 ul e repita o passo trituração até a maioria dos tecidos são dissociados. A suspensão de células obtida contém ambos os neurónios e células não neuronais. Na maioria dos casos, as células dos 6 DRGs (~ 5 x10 4) são utilizados para uma reacção electroporação.
4. Manipulação genética de neurônios por meio de Eletroporação
- Preparar a solução de transfecção por mistura da solução nucleofection Amaxa para os neurónios do rato com os plasmídeos de ADN (~ 10 ug) Ou oligos siRNA (~ 0,2 nmol) para fazer um volume final de 100 uL de cada transfecção.
- Centrifugar as células dissociadas a 680 rpm durante 7 minutos à temperatura ambiente, e elimine o sobrenadante, tanto quanto possível. Adicione a solução de transfecção preparado e delicadamente pipetar cima e para baixo 3-4 vezes com 200 dicas Pipetar para re-suspender as células.
- Transferir a suspensão de células misturada com a solução de transfecção para a cuvete de electroporação e electroporate as células usando o programa de sistema Amaxa Nucleofector G-013.
- Após a electroporação, imediatamente adicionar 500 uL de pré-aquecida (37 ° C) meio de cultura contendo FBS a cuvete e transferir toda a solução de (~ 600 ul) para a placa de cultura revestidas com densidades celulares desejadas. Para os experimentos de que requer re-suspensão e re-plaqueamento, os neurónios são cultivadas directamente sobre o prato de cultura de plástico em alta densidade (10000-20000 células / poço). Para experimento que examina diretamente o crescimento do axônio, os neurônios são banhados ontó lamelas de vidro revestidas com menor densidade (3000-5000 células / poço). Colocar a placa de cultura para a incubadora (37 ° C, 5% de CO 2).
- Quatro horas após plaqueamento quando os neurónios foram ligados aos substratos, suavemente substituir o meio de cultura (que contém a solução nucleofection Amaxa) com 500 uL meio de cultura fresco e pré-aquecido, e voltar a placa para a incubadora para a cultura adicional (37 ° C , 5% de CO 2). Tanto o meio de cultura contendo FBS ou o meio isento de soro pode ser utilizada neste passo.
5. Cultura Adulto neurônios DRG para Análise de crescimento do axônio
- Para os neurónios transfectadas com plasmídeos de ADN, a expressão do gene de interesse (por exemplo, EGFP) pode ser observado tão cedo quanto uma hora após poucos electroporação. Para os neurónios transfectadas com siRNAs, normalmente esperar 3-4 dias para permitir que a depleção suficiente das proteínas endógenas. Os neurônios em cultura pode ser diretamente fixado para axônio análise de crescimento em varionos pontos de tempo (1-4 dias após a electroporação) ou re-suspensa e re-plaqueadas para analisar axónio recrescimento (ver abaixo).
- Para RNAi mediadas de perda de função-estudos, os neurónios em cultura pode ser re-suspensa e re-plaqueadas para permitir axónios para regenerar a partir de neurónios, em que as proteínas alvo são já esgotadas. Para fazer isso, substituir o meio de cultura de idade dos neurónios de alta densidade cultivadas com 1 ml de meio pré-aquecido fresco e pipeta suavemente para cima e para baixo para 6-10 vezes para re-suspender os neurónios em anexo da placa de cultura. Devido células não neuronais (eg células de Schwann) anexar muito mais apertado para o prato de cultura de neurónios, as células ressuspensas são principalmente os neurónios.
- Transfira os neurónios re-suspenso em um tubo de microcentrífuga e suavemente triturar 10-15 vezes para re-dissociar os aglomerados de células na suspensão de célula única.
- Re-plate os neurónios re-dissociados em lamelas recém-preparados a baixa densidade (3000-5000 células / poço) e cultura durante a noite (16-24 horas).
6. Fixação, coloração imuno-fluorescência e imagem
- Aspirar o meio e adicionar paraformaldeído a 4% (PFA) (200 ul / poço) para fixar as células para 15-20 min à temperatura ambiente. As células fixas são então lavadas com PBS 1X por 3 vezes.
- Aspirar o PBS e adicionar a solução de bloqueio (1% de albumina de soro bovino, 0,1% Triton X-100, e soro de cabra normal de 2,0% em PBS 1X) para os neurónios fixos para 60 min à temperatura ambiente.
- Para os axônios de etiquetas, os neurônios são imuno-coradas com anti-neurofilamentos ou anticorpos anti-βIII tubulina. Para fazer isso, colocar uma gota 30μl de solução de anticorpo primário (diluição 1:1200 para a-tubulina βIII anticorpo) em um parafilme para cada lamela. Inverta as lamelas e colocá-los para a solução de anticorpo primário durante 60 min à temperatura ambiente.
- Retornar lamelas à placa de cultura original e lavá-las com PBS 1X por 3 vezes.
- Repita o mesmo procedimento para o secundário umatibody.
- Lave as lamelas com água destilada por 3 vezes, e depois montar as lamínulas em lâminas de vidro com a solução de montagem (por exemplo, prolongar Antifade Gold).
- Os neurônios corados podem ser visualizados com qualquer sistema de microscopia de fluorescência equipado com uma câmera digital. Os comprimentos dos axônios são medidos e analisados com software de imagem análise.
7. Os resultados representativos
Na ausência de qualquer adição de factores de crescimento extracelulares, os neurónios DRG adultos geralmente começam a crescer axônios 48 hr após o plaqueamento em primeiro lugar. Os axónios mostram frequentemente morfologias ramificado (Figura 1). Em contraste, os neurónios re banhados começar a estender axónios apenas uns poucos hr após o plaqueamento, e os axónios alongado com ramificação muito reduzida (Figura 2). Estes resultados sugerem que re banhados neurónios partilham propriedades semelhantes às de neurónios lesionados condicionado. Usando essa abordagem, recentemente realizado perda dede função de estudos para examinar o papel do fator de transcrição regeneração do axônio associado c-Jun em crescimento do axônio de adultos neurônios DRG in vitro. Os resultados mostraram que a electroporação de um grupo de 4 siRNAs diferentes de segmentação regiões diferentes de c-Jun (ON-TARGETplus) marcadamente reduzida nos níveis de proteína de c-Jun em neurónios DRG adultos 3 dias após a transfecção (Figura 3) 9. Quando os neurónios foram re-plaqueadas e cultivadas de crescimento, durante a noite axónio de neurónios de c-Jun knockdown foi significativamente reduzida (Controlo: 348,37 ± 16,21 milímetros; SI-c-Jun: 262,32 ± 15,69 uM, a Figura 3) 9. Estes resultados indicam que os neurónios DRG cultivadas adultos proporcionar um sistema modelo útil para estudar o crescimento axonal a partir de neurónios de adultos.
Figura 1. Adulto neurónios DRG de rato cultivadas a baixa densidade durante 3 dias. Os neurônios corados com anti - & beta; III anticorpo tubulina. Note-se que a maioria dos axônios mostram morfologias ramificadas. Barra de escala: 125 mM.
Figura 2. Re-plating rato adulto DRG neurónios após 3 dias em cultura. (A) neurónios DRG Adulto cultivados a alta densidade, durante 3 dias. (B) Re banhados neurônios DRG adultos foram cultivados em baixa densidade para pernoite. Observe que a maioria dos axônios mostram morfologias alongadas com pouca ramificação do axônio. Barra de escala: 250 um em A e 125 M em B.
Figura 3. Papel de c-Jun em axónio crescimento de neurónios DRG adultos in vitro. (A) análise de Western blot de c-Jun em rato adulto DRG neurônios após a eletroporação de siRNAs c-Jun. O resultado mostra o nível marcadamente reduzida de c-Jun. (B) Controle de neurônios transfectadas com EGFP cresceu axônios longos após a re-regulamentação e da cultura durante a noite. (C) Co-transinfecção de c-Jun siRNAs e crescimento do axônio EGFP prejudicada de adultos neurônios DRG após a re-regulamentação e da cultura durante a noite. Vermelho: coloração Tuj-1; Verde: EGFP. Barra de escala: 125 mM. Estes resultados foram publicados em Saijilafu et al. 9.
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Discussion
Neurónios DRG adultos regenerar os seus axónios robustamente após a lesão do nervo periférico in vivo e in vitro, proporcionando assim um sistema útil para estudar a regeneração axonal em animais adultos. In vitro cultura de neurónios DRG adultos se está a tornar um método largamente utilizado para investigar os mecanismos moleculares pelos quais axônio regeneração é regulada. O procedimento in vitro de neurônios adultos cultura do mouse DRG aqui apresentada permite uma rápida e eficaz estudo genético de crescimento do axônio regenerativa. O procedimento de re-suspensão e re-plating é particularmente útil para a perda de função de estudos porque permite axónios re-crescer a partir de neurónios em que a proteína alvo já foi empobrecido. Além disso, re chapeamento-culturas de neurónios DRG imita um efeito in vivo da lesão condicionado, proporcionando assim uma abordagem mais fisiológico relevante para estudar a regeneração axonal in vitro.
A eficiência de transfecção de adulto DRG neurons com a abordagem de electroporação descrito é de cerca de 20-50% para os plasmídeos de ADN, dependendo dos tamanhos das construções, o que é suficiente para a análise morfológica do crescimento axonal. Comparando a electroporação, a transferência de genes mediada por viral tem uma eficiência muito maior, que é adequada para análise bioquímica utilizando neurónios DRG. No entanto, a construção e produção de vírus para cada gene de interesse é consumir muito mais trabalho intensivo e do tempo. Para oligos siRNA, a eficiência de transfecção pode atingir cerca de 90% com base na eficiência derrubando das proteínas alvo (ver Figura 3A), o que torna a análise bioquímica de adultos neurónios DRG possíveis. No entanto, o efeito de siRNAs reduz após período mais longo, devido à degradação dos oligos siRNA.
Quando os neurónios são co-transfectadas com plasmídeos de 2 misturados em proporção de 1:1, o plasmídeo com tamanho menor tem geralmente uma maior eficiência de transfecção do que o plasmídeo com tamanho maior. Como aresult, ajustando a proporção entre os dois plasmídeos irá alterar a eficiência de co-transfecção em conformidade. Para a transfecção siRNA, que muitas vezes co-transfectar os neurônios com EGFP de marcar neurônios. Porque os oligos siRNA são muito menores do que EGFP, a sua eficiência de transfecção é muito maior. Portanto, em nossos experimentos geralmente pensamos que todos os neurônios EGFP positivos também são positivas para siRNAs.
Muitos estudos de perfis genéticos de adultos neurônios DRG após axotomia periférica identificaram um grande número de genes associados à regeneração (trapos) 10-12, que acredita-se que a base da capacidade de regeneração de neurônios adultos. No entanto, as funções de estes trapos na mediação crescimento axonal de neurónios DRG adultos não têm sido bem caracterizado. Aqui examinámos o papel de um RAG bem conhecido, c-Jun, na mediação crescimento axonal a partir de neurónios DRG adultos através RNAi mediada abordagem de perda de função. Tal método fornece uma ferramenta valiosa em vitro para investigaçõeste os papéis de outros trapos na regulação da regeneração do axônio.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado por concessões aos FZ do NIH (R01NS064288) e Craig H. Neilsen Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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