Summary
Un
Abstract
Il est bien connu que les neurones matures dans le système nerveux central (SNC) ne peuvent se régénérer leurs axones après des blessures dues à la capacité intrinsèque diminuée pour soutenir la croissance des axones et un environnement hostile dans le 1,2 matures du SNC. En revanche, les neurones matures dans le système nerveux périphérique (SNP) de régénérer rapidement après les blessures 3. Adultes dorsales profondes ganglionnaires (DRG) neurones sont bien connus pour régénérer vigoureusement après lésions des nerfs périphériques. Chaque neurone DRG pousse un axone du soma des cellules, qui se divise en deux branches: une branche axonale périphérique innervant cibles périphériques et une branche centrale se prolongeant dans la moelle épinière. Blessures des résultats DRG axones périphériques dans la régénération des axones substantielle, alors que les axones centraux dans la moelle épinière régénérer mal après la blessure. Toutefois, si la lésion périphérique axonale se produit avant la lésion de la moelle épinière (un processus appelé la lésion conditionné), la régénération des axones centraux est greatly améliorée 4. En outre, les axones des neurones centraux DRG partager le même environnement hostile comme descendant des axones cortico dans la moelle épinière. Ensemble, on fait l'hypothèse que les mécanismes moléculaires contrôlant la régénération des axones des neurones DRG adultes peuvent être exploitées pour améliorer la régénération des axones du SNC. En conséquence, adultes neurones DRG sont maintenant largement utilisé comme un système modèle pour étudier la croissance des axones régénérative 5-7.
Ici, nous décrivons une méthode d'adultes DRG neurone culture qui peut être utilisé pour l'étude génétique de la régénération des axones in vitro. Dans ce modèle adulte neurones DRG sont génétiquement manipulés par électroporation à médiation transfection du gène 6,8. Par transfection neurones avec l'ADN plasmidique ou si / shRNA, cette approche permet à la fois à gain et la perte de fonction des expériences pour étudier le rôle de n'importe quel gène d'intérêt dans la croissance axonale des neurones DRG adultes. Lorsque les neurones sont transfectées avec si / shRNA, la protéine endogène ciblée estgénéralement épuisés après 3-4 jours de culture, au cours de laquelle la croissance axonale temps robuste a déjà eu lieu, ce qui rend les études de perte de fonction moins efficace. Pour résoudre ce problème, la méthode décrite ici comprend une étape de remise en suspension et de re-placage après la transfection, les axones qui permet de repousser à partir de neurones dans l'absence de la protéine ciblée. Enfin, nous donnons un exemple d'utilisation de ce modèle in vitro pour étudier le rôle d'une régénération des axones gène associé à, c-Jun, dans la médiation de la croissance des axones des neurones de l'adulte DRG 9.
Protocol
1. Préparation des lamelles, milieu de culture, et les enzymes de digestion
- La ronde de 12 mm n ° 1 des lamelles de verre sont utilisés pour la culture neuronale. Les lamelles sont nettoyées avec 10% HCL nuit suivi d'un lavage à ultrasons avec de l'eau distillée et désionisée pour 3 fois (20 min / heure). Les lamelles nettoyés sont stockés dans l'éthanol à 70% pour une utilisation future. Avant chaque expérience, les lamelles sont séchées à l'air et placé dans la plaque de culture.
- Pour enrober les lamelles séchées, 100 pi de solution de revêtement contenant 100 ug / ml de poly-D-Lysine et 10 pg / ml laminine solution de travail est ajouté sur chaque lamelle et la plaque de culture est transférée dans un incubateur à 37 ° C. Après 1-2 heures, la solution de revêtement est enlevé et les lamelles sont lavées 3 fois avec du PBS 1X stérile.
- Pour préparer le milieu de culture, le milieu essentiel minimum (MEM) est supplémenté avec 5% de sérum bovin (FBS), 1X de pénicilline-streptomycine solution (500 unités de Penicilliumlin et 500 ug de streptomycine), 1X Glutamax-je supplément, et les réactifs antimitotiques contenant 20 pM de 5-fluoro-2-désoxyuridine et 20 uM (FDU / R) uridine. Pour le milieu sans sérum, le FBS est remplacé par le supplément de B27.
- La collagénase Une solution est préparée en dissolvant la collagénase avec une poudre MEM pour obtenir une concentration de travail de 1 mg / ml. Pour la trypsine, la 1X TrypLE Express est utilisé.
2. Dissection et la récolte des adultes neurones DRG de souris
- Après l'euthanasie de la 6 - à la souris adulte de 10 semaines, retirez la peau du dos et couper toute la colonne vertébrale. Laver la colonne vertébrale avec retirés du 1 x PBS 2-3 fois.
- Pin de la colonne vertébrale retiré à la plaque de dissection avec un maximum face ventrale, et enlève soigneusement les muscles afin d'exposer les nerfs sensitifs sous une loupe binoculaire. Les nerfs reliés aux GHM au niveau du bois sont les plus épaisses et facile à localiser. Par conséquent, pour la plupart des expériences que la région lombaireDRG sont récoltés.
- Couper passant par chaque vertèbre le long de la ligne médiane avec de petits ciseaux, et retirez soigneusement les disques intervertébraux. En utilisant des pinces de diviser chaque vertèbre pour exposer la moelle épinière.
- Afin de disséquer les DRG de bois, soulevez chaque nerf du bois avec une pince et de tracer vers la moelle épinière pour localiser les GHM associés lombaires (L1 à L6).
- Coupez chaque DRG du nerf périphérique connecté, les racines dorsales et ventrales avec des ciseaux à ressort, et de le stocker dans un tube de centrifugeuse avec du milieu MEM placé sur la glace. DRG plus à différents niveaux épinière (DRG thoraciques) peut être découpé dans la même manière, si nécessaire.
3. Digestion et dissociation des adultes neurones DRG de souris
- Après avoir recueilli tous les DRG disséqués, remplacer le milieu MEM avec 1 ml de collagénase Une solution et incuber le tube de centrifugeuse à 37 ° C pendant 90 min.
- Remplacer la collagénase Une solution avec 500 pi Express 1X TrypLE afinlution et incuber à 37 ° C pendant 15-20 min.
- Retirer la solution TrypLE Express et laver les GHM avec 1 ml de milieu de culture préparé (contenant 5% de FBS) pour 3 fois.
- Ajouter 600 ul milieu de culture et doucement pipeter haut et en bas de triturer les tissus pour les 20-30 fois en utilisant un 1 ml de bleu, pipette graduée de pointe.
- Après trituration, de permettre aux tissus non dissociés de s'installer au fond de la centrifugeuse et le transfert de la suspension cellulaire dans un tube de 10 ml stérile. Ajouter un autre support 600 ul de la culture et répétez l'étape de trituration jusqu'à la plupart des tissus sont dissociées. La suspension cellulaire obtenue contient deux neurones et des cellules non neuronales. Dans la plupart des cas, les cellules à partir de 6 GHM (~ 5 x10 4) sont utilisés pour une réaction d'électroporation.
4. Manipulation génétique des neurones par électroporation
- Préparer la solution de transfection en mélangeant la solution nucléofection Amaxa pour les neurones de souris avec des plasmides d'ADN (~ 10 pg) Ou oligos siRNA (~ 0,2 nmol) pour obtenir un volume final de 100 pl pour chaque transfection.
- Centrifuger les cellules dissociées à 680 tours par minute pendant 7 min à température ambiante, et éliminer le surnageant autant que possible. Ajouter la solution de transfection préparé et doucement pipeter haut et en bas 3-4 fois avec 200 pointes de pipette ul pour remettre en suspension les cellules.
- Transférer la suspension de cellules mélangée avec la solution de transfection à la cuvette d'électroporation et électroporer des cellules à l'aide du programme de système Amaxa Nucleofector U-013.
- Après électroporation, ajouter immédiatement 500 pl de pré-chauffée (37 ° C) milieu de culture contenant FBS dans la cuvette et de transférer toute la solution (~ 600 pi) dans la plaque de culture revêtue à des densités cellulaires souhaités. Pour l'expérience que requiert la remise en suspension et de re-placage, les neurones sont cultivées directement sur la boîte de culture en plastique à haute densité (10000-20000 cellules / puits). Pour l'expérience, qui examine directement la croissance des axones, les neurones sont en Ontario plaquéo des lamelles de verre enduits à faible densité (3000-5000 cellules / puits). Placez la plaque de culture dans l'incubateur (37 ° C, 5% de CO 2).
- Quatre heures après étalement lorsque les neurones sont attachés à des substrats, doucement remplacer le milieu de culture (qui contient la solution nucléofection Amaxa) avec 500 ul milieu de culture frais et préchauffée, et de retourner la plaque dans l'incubateur pour la culture supplémentaire (37 ° C , 5% CO 2). Les deux milieu de culture contenant FBS ou le milieu sans sérum peut être utilisé à cette étape.
5. La culture de neurones adultes DRG pour l'analyse de la croissance axonale
- Pour les neurones transfectées avec des plasmides d'ADN, l'expression du gène d'intérêt (par exemple EGFP) peuvent être observées dès qu'une heure à peine après l'électroporation. Pour les neurones transfectées avec des siRNA, nous avons l'habitude d'attendre 3-4 jours pour permettre l'épuisement suffisante des protéines endogènes. Les neurones en culture peut être fixé soit directement pour l'analyse de la croissance axonale à varionous le temps des points (1-4 jours après électroporation) ou remis en suspension et ré-étalées à analyser axone repousse (voir ci-dessous).
- Pour l'ARNi à médiation perte de fonction des études, des neurones en culture peuvent être remis en suspension et ré-plaqué afin de permettre aux axones des neurones repousser, dans laquelle les protéines ciblées sont déjà épuisés. Pour ce faire, remplacer le milieu de culture ancienne des neurones à haute densité d'élevage avec 1 ml préchauffé milieu frais et pipette doucement de haut en bas pour les 6-10 fois pour remettre en suspension les neurones sont reliés de la plaque de culture. Parce que les cellules non neuronales (par exemple les cellules de Schwann) attachent beaucoup plus serré de la boîte de culture que les neurones, les cellules remises en suspension sont pour la plupart des neurones.
- Transférer les neurones remises en suspension dans un microtube et doucement triturer 10-15 fois de re-dissocier les amas cellulaires dans la suspension cellulaire unique.
- Re-re de la plaque des neurones dissociés sur des lamelles nouvellement préparés à basse densité (3000-5000 cellules / puits) et de la culture du jour au lendemain (16-24 h).
6. Fixation, immuno-coloration, et imagerie par fluorescence
- Aspirer le milieu et ajouter du paraformaldéhyde à 4% (PFA) (200 pl / puits) pour fixer les cellules pour 15-20 min à température ambiante. Les cellules fixes sont ensuite lavées avec du PBS 1X pour 3 fois.
- Aspirer le PBS et ajouter la solution de blocage (1% de sérum albumine bovine, 0,1% de Triton X-100, et 2,0% de sérum de chèvre normal dans du PBS 1X) pour les neurones fixes pour 60 min à température ambiante.
- Pour les axones de l'étiquette, les neurones sont immuno-teinté avec des anti-neurofilaments ou d'anticorps anti-tubuline βIII. Pour ce faire, déposer une goutte 30μl de solution d'anticorps primaire (1:1200 dilution pour l'anticorps tubuline-βIII) sur un parafilm pour chaque lamelle. Inverser les lamelles et les placer sur la solution d'anticorps primaire pendant 60 min à température ambiante.
- Retour lamelles sur la plaque de culture d'origine et les laver avec du PBS 1X pour 3 fois.
- Répétez la même procédure pour le secondaire unetibody.
- Laver les lamelles avec de l'eau distillée pour 3 fois, puis monter les lamelles sur des lames de verre avec la solution de montage (par exemple ProLong Antifade Or).
- Les neurones colorés peut être visualisé avec n'importe quel système de microscopie par fluorescence équipé d'un appareil photo numérique. Les longueurs des axones sont mesurés et analysés avec le logiciel d'analyse d'imagerie.
7. Les résultats représentatifs
En l'absence de tout facteur de croissance extracellulaires ajoutée, les neurones DRG adultes commencent généralement à se développer axones 48 h après le placage en premier. Les axones montrent souvent des morphologies ramifiées (Figure 1). En revanche, les neurones re-plaqués commencer à étendre les axones seulement quelques heures après le placage, et les axones allongée avec beaucoup réduit la ramification (Figure 2). Ces résultats suggèrent que re-plaqués neurones partagent des propriétés similaires à celles des neurones lésés de conditionnement. En utilisant cette approche, nous avons récemment effectué des pertesde fonction des études visant à examiner le rôle de la régénération des axones facteur de transcription c-Jun associée à la croissance des axones de neurones adultes GHM in vitro. Les résultats ont montré que l'électroporation d'un groupe de 4 siRNA ciblant différentes régions différentes de c-Jun (ON-TARGETplus) réduit significativement les taux de protéines de c-Jun dans les neurones de DRG adultes 3 jours après la transfection (figure 3) 9. Lorsque les neurones ont été ré-plaqué et de culture du jour au lendemain, la croissance des axones des neurones knockdown c-Jun a été significativement réduite (contrôle: 348,37 ± 16.21mm; si-c-Jun: 262,32 ± 15,69 pm, Figure 3) 9. Ces résultats indiquent que les neurones en culture DRG adultes constituent un système modèle utile pour étudier la croissance des axones des neurones adultes.
Figure 1. Neurones adultes de souris cultivées DRG à faible densité pendant 3 jours. Les neurones ont été colorés avec des anticorps anti - & beta; anticorps tubuline III. Notez que la plupart des axones montrent des morphologies ramifiées. La barre d'échelle: 125 um.
Figure 2. Souris adulte Re-placage DRG neurones après 3 jours de culture. (A) des neurones DRG adultes cultivées à haute densité pendant 3 jours. (B) Re-plaqués neurones DRG adultes ont été cultivées à faible densité pour la nuit. Notez que la plupart des axones montrent des morphologies allongées avec peu axone branchement. La barre d'échelle: 250 um à 125 um A et en B.
Figure 3. Rôle de c-Jun dans la croissance axonale des neurones DRG adultes in vitro. (A) l'analyse par Western blot de c-Jun chez la souris adulte DRG neurones après l'électroporation de c-Jun siRNA. Le résultat indique le niveau nettement réduit de c-Jun. (B) neurones de contrôle transfectées avec EGFP a augmenté de longs axones après re-placage et de la culture du jour au lendemain. (C) Co-transfection de c-Jun siRNA et la croissance des axones EGFP avec facultés affaiblies de neurones adultes DRG après re-placage et de la culture du jour au lendemain. Rouge: Tuj-1 coloration; vert: EGFP. La barre d'échelle: 125 um. Ces résultats ont été publiés dans Saijilafu et al. 9.
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Discussion
Adultes neurones DRG régénérer leurs axones robuste après une lésion nerveuse périphérique in vivo et in vitro, fournissant ainsi un système utile pour étudier la régénération des axones chez les animaux adultes. Dans la culture in vitro de neurones DRG adultes devient une méthode largement utilisée pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels les la régénération des axones est réglementée. La procédure in vitro des neurones en culture de souris adultes DRG présenté ici permet rapide et efficace étude génétique de la croissance axonale régénérative. La procédure de remise en suspension et de re-placage est particulièrement utile en cas de perte de fonction des études, car elle permet axones repoussent à partir de neurones dans lequel la protéine ciblée a déjà été épuisés. Par ailleurs, re-placage des cultures de neurones de DRG imite un effet in vivo des lésions conditionné, offrant ainsi une approche plus physiologique pertinent d'étudier la régénération des axones in vitro.
L'efficacité de transfection des adultes DRG neurons avec l'approche électroporation décrite est environ 20-50% pour les plasmides d'ADN en fonction de la taille des constructions, ce qui est suffisant pour l'analyse morphologique de la croissance axonale. Comparer à l'électroporation, le transfert du gène viral à médiation a un rendement plus élevé, qui est approprié pour l'analyse biochimique en utilisant neurones DRG. Toutefois, la construction et la production de virus pour chaque gène d'intérêt est la consommation beaucoup plus de travail et de temps. Pour les oligos siARN, l'efficacité de la transfection peut atteindre près de 90% sur la base de l'efficacité abattre des protéines ciblées (voir figure 3A), ce qui rend l'analyse biochimique des neurones adultes DRG possibles. Cependant, l'effet de siRNA réduit après une longue période en raison de la dégradation des oligos siRNA.
Lorsque neurones sont co-transfectées avec 2 plasmides mélangés à un rapport de 1:1, le plasmide avec une plus petite taille a généralement une plus grande efficacité de transfection que le plasmide avec de plus grande taille. Comme aresult, le réglage du rapport des deux plasmides change l'efficacité de co-transfection en conséquence. Pour transfection de siRNA, nous avons souvent co-transfecter des neurones à l'EGFP pour les neurones de l'étiquette. Parce que les oligos siRNA sont beaucoup plus petits que EGFP, leur efficacité de la transfection est beaucoup plus élevé. Par conséquent, dans nos expériences, nous pensons généralement que tous les neurones EGFP positives sont également positives pour siRNA.
De nombreuses études de profilage génétique de gros neurones DRG après axotomie périphérique ont identifié un grand nombre de gènes associés à la régénération (GRA) 10-12, dont on pense qu'ils sous-tendent la capacité de régénération des neurones DRG adultes. Toutefois, les fonctions de ces chiffons dans la médiation de la croissance axonale des neurones DRG adultes n'ont pas été bien caractérisés. Ici nous avons examiné le rôle d'un RAG bien connu, c-Jun, dans la médiation de la croissance des axones des neurones DRG adultes par l'intermédiaire d'ARNi à médiation perte de fonction d'approche. Une telle méthode fournit un précieux outil in vitro à enquêtete les rôles de chiffons d'autres dans la régulation de la régénération axonale.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH à FZ (R01NS064288) et la Fondation Craig H. Nielsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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