Summary
En
Abstract
Det er velkendt, at modne neuroner i centralnervesystemet (CNS) ikke kan regenerere deres axoner efter skader på grund af formindsket iboende evne til at understøtte axon vækst og et fjendtligt miljø for det modne CNS 1,2. I modsætning hertil regenerere modne neuroner i det perifere nervesystem (PNS) let efter skader 3. Voksent dorsale rodganglie (DRG)-neuroner, er velkendte til at regenerere robust efter perifere nervebeskadigelser. Hver DRG neuron vokser en axon fra cellen Soma, der forgrener sig i to aksonal grene: en perifer gren innerverer perifere mål og en central gren strækker sig ind i rygmarven. Skade af DRG perifere axoner resulterer i væsentlig axon regenerering mens centrale axoner i rygmarven regenerere dårligt efter skaden. Hvis den perifere axonal skade forekommer før rygmarvsskade (en proces kaldet konditionering læsionen), regenerering af centrale axoner er greatly forbedret 4. Desuden centrale axoner i DRG-neuroner har samme fjendtlige miljø nedad corticospinal axoner i rygmarven. Sammen er det en hypotese, at de molekylære mekanismer, der styrer Axon regenerering af voksne DRG-neuroner kan udnyttes til at forbedre CNS Axon regenerering. Som et resultat heraf bliver voksne DRG-neuroner nu i vid udstrækning anvendt som et modelsystem til undersøgelse regenerativ axon vækst 5-7.
Her beskriver vi en fremgangsmåde til voksen DRG neuroner kultur, der kan anvendes til genetisk undersøgelse af axon regenerering in vitro. I denne model voksne DRG-neuroner, er genetisk manipulerede via elektroporation-medieret gentransfektion 6,8. Ved transfektion neuroner med DNA-plasmid eller Si / shRNA, er det muligt både gain-og tab af funktion eksperimenter for at undersøge den rolle som helst gen af interesse i axon vækst fra voksne DRG-neuroner. Når neuroner transficeres med Si / shRNA den målrettede endogene protein ersædvanligvis opbrugt efter 3-4 dage i kultur, hvorunder robust axon vækst allerede har fundet sted, hvilket gør tab-af-funktion undersøgelser mindre effektiv. For at løse dette problem, den her beskrevne fremgangsmåde indbefatter et resuspension og re-udpladning trin efter transfektion, hvilket giver axoner på ny vækst af neuroner i fravær af den tilsigtede protein. Endelig har vi et eksempel på anvendelse af denne in vitro-model til at studere rollen af en axon regenerering-associeret gen, c-Jun, i mediering axon vækst fra voksne DRG neuroner 9.
Protocol
1. Fremstillinq af dækglas dyrkningsmedium, og fordøjelsesenzymer
- 12 mm runde # 1 dækglas anvendes til den neuronale kulturen. Dækglassene renses med 10% HCI natten over, efterfulgt af ultralyd vask med destilleret og deioniseret vand til 3 gange (20 min / tid). De rensede dækglas lagret i 70% ethanol til fremtidig brug. Før hver eksperimenter er dækglassene lufttørres og anbringes i dyrkningspladen.
- At coate de tørrede dækglassene, 100 pi af coatingopløsning indeholdende 100 ug / ml poly-D-lysin og 10 ug / ml laminin bearbejdning tilsættes på hvert dækglas, og kulturen pladen overført til en 37 ° C inkubator. Efter 1-2 timer, er coatingopløsningen fjernet og dækglas blev vasket 3 gange med steril 1X PBS.
- Til fremstilling af dyrkningsmedium, Minimum Essential Medium (MEM) suppleret med 5% føtalt bovint serum (FBS), 1X penicillin-streptomycin-opløsning (500 enheder af penicillin og 500 ug streptomycin), 1X Glutamax-I tillæg, og antimitotiske reagenser indeholdende 20 uM 5-fluor-2-deoxyuridin og 20 uM uridin (FdU / R). Til serum-frit medium er FBS erstattet med supplement B27.
- Collagenase En opløsning fremstilles ved at opløse collagenase et pulver med MEM for at gøre en arbejdskoncentration på 1 mg / ml. For trypsin er 1X TrypLE Express anvendes.
2. Dissektion og høst af voksen mus DRG-neuroner
- Efter euthanizing 6 - til 10-uger gamle voksne mus, fjernes den dorsale hud og skæres hele rygsøjlen. Vaske den fjernede rygsøjlen med 1 x PBS 2-3 gange.
- Nål fjernet rygsøjlen til dissekering plade med ventrale side opad, og omhyggeligt fjerner muskler at blotlægge de sensoriske nerver under et dissektionsmikroskop. De nerver forbundet til DRG på tømmer niveau er den tykkeste og nem at finde. Derfor, for de fleste forsøg kun den lumbaleDRG høstes.
- Skær igennem hver ryghvirvel langs centerlinien med en lille saks og forsigtigt fjerne de intervertebrale skiver. Ved hjælp af en pincet til at opdele hver hvirvel for at blotlægge rygmarven.
- At dissekere de tømmer DRG, løft op hver tømmer nerve med en pincet og spore mod rygmarven for at finde de tilknyttede lumbal DRG (fra L1 til L6).
- Skær hver DRG fra vedlagte perifer nerve, dorsale og ventrale rødder med foråret saks, og gemme det i mikrofugerør med MEM medium lagt på is. Flere DRG på forskellige spinale niveauer (fx bryst DRG) kan dissekeret på en lignende måde, når det er nødvendigt.
3. Fordøjelse og Dissociation af voksne mus DRG-neuroner
- Efter opsamling alle de dissekerede DRG, erstatte MEM-medium med 1 ml collagenase En opløsning og inkuber mikrofugerøret ved 37 ° C i 90 min.
- Erstatte collagenase En opløsning af 500 ul 1X TrypLE Express såresolution og inkuber ved 37 ° C i 15-20 min.
- Fjerne TrypLE Express opløsningen og vaskes DRG med 1 ml fremstillet dyrkningsmedium (indeholdende 5% FBS) i 3 gange.
- Tilsættes 600 pi kulturmedium og forsigtigt pipetteres op og ned til tritureres vævene i 20-30 gange med en 1 ml blå gradueret pipettespids.
- Efter triturering, giver de ikke-dissocierede væv til at bundfælde sig på bunden af mikrofuge og overfører cellesuspensionen til 10 ml sterilt rør. Tilføj en 600 gl dyrkningsmedium, og gentag trituration trin, indtil de fleste væv er dissocieret. Den opnåede cellesuspension indeholder både neuroner og ikke-neuronale celler. I de fleste tilfælde er celler fra 6 DRG'er (~ 5 x10 4) anvendes til en elektroporering reaktion.
4. Genmanipulation af neuroner via Elektroporering
- Klargør transfektion opløsning ved at blande Amaxa nucleofection opløsning muse-neuroner med DNA-plasmider (~ 10 ug) Eller siRNA oligoer (~ 0,2 nmol) for at gøre et slutvolumen på 100 ul for hver transfektion.
- Centrifuger de dissocierede celler fra 680 rpm i 7 minutter ved stuetemperatur, og kassere supernatanten så meget som muligt. Tilsæt den forberedte transfektion løsning og forsigtigt pipetteres op og ned 3-4 gange med 200 ul pipettespidser til resuspendere cellerne.
- Overfør cellesuspensionen blandet med transfektion løsning på elektroporering kuvetten og elektroporere cellerne under anvendelse af Amaxa Nucleofector systemprogrammet G-013.
- Efter elektroporering tilsættes umiddelbart 500 ul foropvarmede (37 ° C) dyrkningsmedium indeholdende FBS til kuvetten og overføre hele opløsningen (~ 600 pi) i den overtrukne dyrkningsplade ved ønskede celletætheder. Til eksperiment, der kræver resuspension og re-udpladning er neuroner dyrkes direkte på plasten dyrkningsskålen ved høj densitet (10000-20000 celler / brønd). Til eksperiment, der direkte undersøger axon vækst, er neuroner belagte ONTo overtrukne dækglas ved lavere densitet (3000-5000 celler / brønd). Placer dyrkningspladerne i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2).
- Fire timer efter udpladning ved neuroner har fastgjort til substraterne, forsigtigt erstatte dyrkningsmedium (som indeholder Amaxa nucleofection opløsning) med 500 gl frisk forvarmet dyrkningsmedium, og returnere pladen til inkubatoren i yderligere kultur (37 ° C , 5% CO 2). Både dyrkningsmedium indeholdende FBS eller i serumfrit medium kan anvendes i dette trin.
5. Dyrkning Voksne DRG-neuroner til Axon vækstanalyse
- For neuroner transficeret med DNA-plasmider, kan ekspressionen af genet af interesse (f.eks EGFP) observeres så tidligt som et par timer efter elektroporering. For neuroner transficeret med siRNAs, vi normalt vente 3-4 dage for at tillade tilstrækkelig udtynding af de endogene proteiner. De dyrkede neuroner kan enten direkte fastgjort til Axon vækst analyse på varioos tidspunkter (1-4 dage efter elektroporering) eller re-suspenderes og igen udpladet at analysere axon genvækst (se nedenfor).
- For RNAi-medierede tab af funktion undersøgelser, kan de dyrkede neuroner resuspenderes og genudplades at tillade axoner til regrow fra neuroner, i hvilke målrettede proteiner allerede udtømt. For at gøre dette, skal du udskifte den gamle dyrkningsmediet af high-density dyrkede neuroner med 1 ml forvarmet frisk medium og pipette forsigtigt op og ned for 6-10 gange for at re-suspendere de vedlagte neuroner fra kulturen pladen. Fordi ikke-neuronale celler (f.eks Schwann-celler) knytte meget strammere til dyrkningsskålen end neuroner, re-suspenderes cellerne er for det meste neuroner.
- Overfør resuspenderet neuroner i et mikrofugerør og forsigtigt tritureres 10-15 gange for at re-dissociere celleklumper i enkelt cellesuspension.
- Re-pladen re-dissocierede neuroner over på nyligt fremstillede dækglas ved lav densitet (3000-5000 celler / brønd) og dyrkning natten over (16-24 timer).
6. Fiksering, Immuno-farvning, og fluorescensimagografi
- Aspirer mediet og tilsættes 4% paraformaldehyd (PFA) (200 ul / brønd) for at fastsætte cellerne i 15-20 min ved stuetemperatur. De fikserede celler vaskes derefter med 1X PBS i 3 gange.
- Aspirer PBS, og der tilsættes blokerende opløsning (1% bovint serumalbumin, 0,1% Triton X-100 og 2,0% normalt gedeserum i 1X PBS) til de faste neuroner i 60 minutter ved stuetemperatur.
- At mærke axoner, er neuroner immuno-farvet med anti-neurofilamenter eller anti-βIII tubulin-antistof. For at gøre dette, placere en 30μl dråbe primært antistof opløsning (1:1200 fortynding for-βIII tubulin antistof) på en parafilm for hvert dækglas. Invertere dækglas og placere dem på det primære antistof-opløsning i 60 minutter ved stuetemperatur.
- Tilbage dækglas til den oprindelige kultur pladen og vaske dem med 1X PBS i 3 gange.
- Gentag samme procedure for den sekundære entibody.
- Vaskes dækglassene med destilleret vand til 3 gange, og derefter montere dækpladerne på objektglas med montering opløsning (f.eks Forlæng Gold antiblegemiddel).
- De farvede neuroner kan afbildes med ethvert fluorescensmikroskopi system udstyret med et digitalt kamera. De axon længder måles og analyseres med billeddannelse analyse software.
7. Repræsentative resultater
I fravær af enhver tilsat ekstracellulære vækstfaktorer, som regel de voksne DRG-neuroner begynder at vokse axoner 48 timer efter første plettering. Axonerne udviser ofte forgrenede morfologier (figur 1). I modsætning hertil starte genudplades neuroner til at forlænge axoner kun nogle få timer efter udpladning, og axonerne langstrakt med meget reduceret forgrening (figur 2). Disse resultater antyder, at re-belagte neuroner dele lignende egenskaber som dem af konditioneringsmidler læderede neuroner. Ved hjælp af denne fremgangsmåde, har vi for nylig udført tab-af-funktions studier til undersøgelse af rollen af axon regenerering associeret transkriptionsfaktor c-Jun i axon vækst fra voksne DRG neuroner in vitro. Resultaterne viste, at elektroporering af en gruppe af 4 forskellige siRNAs rettet mod forskellige regioner af c-Jun (ON-TARGETplus) markant reduceret protein niveauer af c-Jun i voksne DRG-neuroner 3 dage efter transfektion (fig. 3) 9. Når neuroner blev igen udpladet og dyrket natten over, Axon vækst fra c-Jun knockdown neuroner blev signifikant reduceret (Kontrol: 348,37 ± 16.21mm; si-c-Jun: 262,32 ± 15,69 um, figur 3) 9. Disse resultater indikerer, at dyrkede voksne DRG-neuroner et nyttigt modelsystem til undersøgelse axon vækst fra voksne neuroner.
Figur 1. Voksen mus DRG-neuroner dyrket ved lav densitet i 3 dage. Neuroner blev farvet med anti - og beta; III tubulin-antistof. Bemærk, at de fleste axoner viser forgrenede morfologier. Målestok: 125 um.
Figur 2. Re-udpladning voksen mus DRG-neuroner efter 3 dage i kultur. (A) Voksne DRG-neuroner dyrket ved høj densitet i 3 dage. (B) Re-belagte voksne DRG-neuroner blev dyrket ved lav tæthed for natten. Bemærk, at de fleste axon viser langstrakte morfologier med ringe axon forgrening. Målestok: 250 um i A og 125 um i B.
Figur 3. Rolle c-Jun i axon vækst fra voksne DRG-neuroner in vitro. (A) Western blot-analyse af c-Jun i voksne mus DRG neuroner efter elektroporering af c-Jun siRNAs. Resultatet viser markant reduceret niveau af c-Jun. (B) Kontrol neuroner transficeret med EGFP voksede lange axoner efter re-plating og natten kultur. (C) Co-transinfektion af c-Jun siRNAs og EGFP nedsat Axon vækst fra voksne DRG-neuroner efter re-plating og natten kultur. Rød: Tuj-1-farvning, Grøn: EGFP. Målestok: 125 um. Disse resultater er blevet offentliggjort i Saijilafu et al. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voksent DRG-neuroner regenerere deres axoner robust efter perifer nerveskade in vivo og in vitro, hvilket giver et nyttigt system til at studere axon regenerering i voksne dyr. In vitro-dyrkning af voksne DRG-neuroner bliver en almindeligt anvendt metode til at undersøge de molekylære mekanismer, hvorved Axon regenerering reguleres. In vitro procedure til dyrkning af voksne mus DRG-neuroner præsenteret her muliggør hurtig og effektiv genetiske undersøgelse af regenerativ axon vækst. Resuspension og re-udpladning fremgangsmåde er især anvendelig til tab-af-funktion undersøgelser, fordi det tillader axoner igen stige fra neuroner i hvilken den tilsigtede protein er allerede blevet udtømt. Desuden re-udpladning dyrkede DRG-neuroner efterligner in vivo konditionering læsion virkning, hvilket således tilvejebringer en mere fysiologisk relevant fremgangsmåde til at studere axon regenerering in vitro.
Transfektionseffektiviteten af voksne DRG neurons med den beskrevne elektroporering fremgangsmåde er omkring 20-50% for DNA-plasmider, afhængigt af størrelsen af de konstruktioner, som er tilstrækkelig til morfologisk analyse af axon vækst. Sammenligning med elektroporering, viral genoverførsel har meget højere effektivitet, der er egnet til biokemisk analyse under anvendelse af DRG-neuroner. Men, konstruktion og produktion af virus for hvert gen-af-interesse er langt mere arbejdskrævende og tidskrævende. For siRNA oligoer kan transfektionseffektivitet når næsten 90% baseret på vælte effektiviteten af de målrettede proteiner (se figur 3A), hvilket gør biokemisk analyse af voksne DRG neuroner mulige. Imidlertid er virkningen af siRNAs reducerer efter længere tidsrum på grund af nedbrydning af siRNA oligoer.
Når neuroner co-transficeret med 2 plasmider blandet i forholdet 1:1, plasmidet med mindre størrelse har sædvanligvis højere transfektionseffektivitet end plasmidet med større størrelse. Som arRK, vil justere forholdet mellem de to plasmider ændre co-transfektionseffektivitet i overensstemmelse hermed. For siRNA transfektion, vi ofte co-transficere neuroner med EGFP at mærke neuroner. Fordi siRNA oligo'er er meget mindre end EGFP deres transfektionseffektivitet er meget højere. Derfor, i vores forsøg, vi generelt tror, at alle EGFP positive neuroner er også positive for siRNAs.
Mange genetiske profilering undersøgelser af voksne DRG-neuroner efter perifer axotomi har identificeret en lang række regeneration-forbundne gener (klude) 10-12, der menes at ligge til grund for regenerering evne voksne DRG-neuroner. Imidlertid har de funktioner af disse klude i mediere Axon vækst af voksne DRG-neuroner ikke blevet godt præget. Her har vi undersøgt, hvilken rolle en velkendt RAG, c-Jun, som mægler Axon vækst fra voksne DRG-neuroner via RNAi-medieret tab af funktion tilgang. En sådan fremgangsmåde tilvejebringer et værdifuldt in vitro værktøj til undersøgelsete roller andre klude i reguleringen af axon regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud til FZ fra NIH (R01NS064288) og Craig H. Neilsen Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
