Summary
Abstract
זה ידוע היטב כי נוירונים בוגרים במערכת העצבים המרכזית (CNS) לא יכול להתחדש האקסונים שלהם לאחר פציעות עקב היכולת הפנימית פחתה כדי לתמוך בצמיחה האקסון וסביבה עוינת 1,2 CNS בוגרת. לעומת זאת, נוירונים בוגרים במערכת העצבים ההיקפית (PNS) להתחדש בקלות אחרי 3 פציעות. למבוגרים הגב הגנגליון שורש (DRG) נוירונים ידועים להתחדש וחסונה לאחר פציעות עצבים היקפיים. כל תא עצב DRG גדל האקסון 1 מ סומה התא, אילו ענפים לשני סניפים: הסניף axonal היקפי innervating מטרות הפריפריה והסניף המרכזי הרחבת לתוך חוט השדרה. הפציעה של אקסונים היקפיים תוצאות DRG התחדשות האקסון משמעותי, ואילו אקסונים מרכזיות בחוט השדרה להתחדש גרוע לאחר פציעה. עם זאת, אם הפגיעה axonal היקפי מתרחשת לפני הפגיעה בחוט השדרה (תהליך הנקרא הנגע מיזוג), התחדשות של אקסונים המרכזיים הוא greatlY משופרת 4. יתר על כן, אקסונים המרכזיים של נוירונים DRG לשתף את הסביבה העוינת כמו יורד אקסונים corticospinal בחוט השדרה. יחד, ההשערה היא כי המנגנונים המולקולריים השולטים התחדשות האקסון של נוירונים בוגרים DRG ניתן לרתום כדי לשפר את מערכת העצבים המרכזית התחדשות האקסון. כתוצאה מכך, מבוגרים נוירונים DRG כיום שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד הצמיחה האקסון משובי 5-7.
כאן אנו מתארים את השיטה של תרבות המבוגרים נוירון DRG, שניתן להשתמש בהם למחקר הגנטי של התחדשות האקסון במבחנה. ב הבוגרת מודל זה נוירונים DRG הם מניפולציה גנטית דרך transfection-electroporation בתיווך גן 6,8. על ידי transfecting נוירונים עם ה-DNA פלסמיד או סי / shRNA, גישה זו מאפשרת הן של רווח והפסד של תפקודי ניסויים כדי לבדוק את תפקידו של כל עניין הגנים של בצמיחה האקסון מתא עצב DRG בוגרים. כאשר נוירונים הם transfected עם סי / shRNA, חלבון אנדוגני הוא ממוקדמרוקנת בדרך כלל לאחר 3-4 ימים בתרבות, במהלכם צמיחה איתנה זמן האקסון כבר התרחש, מה שהופך את ההפסד של תפקודי מחקרים פחות יעיל. כדי לפתור בעיה זו, השיטה המתוארת כאן כוללת צעד מחדש ההשעיה מחדש ציפוי לאחר transfection, המאפשר אקסונים מחדש לגדול מ נוירונים בהעדר חלבון מטרה. לבסוף, אנו מספקים דוגמה של שימוש במודל חוץ גופית כדי ללמוד את התפקיד של גנים הקשורים התחדשות האקסון, C-יוני, בתיווך הצמיחה של האקסון למבוגרים DRG נוירונים 9.
Protocol
1. הכנת Coverslips בינוני, תרבות, עיכול ואנזימים
- סיבוב של 12 מ"מ # 1 coverslips זכוכית משמשים תרבות העצבית. Coverslips את מנקים עם 10% HCL לילה ואחריו רחצה קולי עם מים מזוקקים deionized במשך 3 פעמים (20 דקות / שעה). Coverslips את ניקה מאוחסנים אתנול 70% לשימוש עתידי. ניסויים לפני כל אחד, coverslips הם אוויר יבש ו להציב לתוך צלחת התרבות.
- כדי לצפות coverslips את מיובשים, 100 μl של פתרון ציפוי המכיל 100 מיקרוגרם / מ"ל פולי-D-ליזין 10 מיקרוגרם / מ"ל פתרון Laminin עובד נוסף על coverslip כל צלחת תרבות מועבר לתוך 37 ° C חממה. לאחר 1-2 שעות, הפתרון ציפוי מוסר ואת coverslips נשטפים 3 פעמים עם סטרילית 1X PBS.
- כדי להכין את המדיום תרבות, בינוני Essential Minimum (MEM) הוא השלים עם 5% בסרום שור עוברית (FBS), 1X לפניצילין סטרפטומיצין פתרון (500 יחידות penicilלין 500 מיקרוגרם של סטרפטומיצין), 1X GlutaMAX, אני מוסף, ואת ריאגנטים antimitotic המכיל 20 מיקרומטר 5-Fluoro-2-deoxyuridine ו 20 מיקרומטר uridine (FDU / R). עבור בינוני סרום ללא, FBS מוחלף תוסף B27.
- Collagenase פתרון מוכן ידי המסת אבקת collagenase עם MEM לעשות ריכוז העבודה של 1 מ"ג / מ"ל. עבור טריפסין, TrypLE 1X אקספרס משמש.
2. דיסקציה ו קציר של נוירונים עכבר למבוגרים DRG
- לאחר והרדמת חסד 6 - עכבר מבוגר 10-שבועות, להסיר את העור הגב ולנתק את עמוד השדרה כולו. לשטוף את עמוד השדרה להסיר עם 1-X PBS 2-3 פעמים.
- להצמיד את עמוד השדרה הסיר צלחת עם לנתח את הצד הגחוני, ובזהירות מסירה השרירים לחשוף את עצבי התחושה תחת מיקרוסקופ לנתח. את העצבים הקשורים DRGs ברמה עצים הם העבה ביותר וקל לאיתור. לכן, עבור רוב הניסויים רק המותניDRGs נקצרים.
- לחתוך כל חוליה לאורך קו האמצע עם מספריים קטנים להסיר בזהירות את הדיסקים חולייתי. באמצעות מלקחיים לפצל כל חוליה לחשוף את חוט השדרה.
- לנתח את DRGs עצים, להרים את כל העצב עץ עם מלקחיים ואת עקבות לכיוון חוט השדרה כדי לאתר את DRGs המותני נלווים (מ L1 ל L6).
- חותכים את כל DRG מ עצבים היקפיים המצורפת, שורשים הגב ועל הגחון עם מספריים האביב, ולאחסן אותו צינור microfuge עם המדיום MEM דגש על קרח. DRGs שנכתבו ברמות שונות בעמוד השדרה (DRGs החזה למשל) יכול להיות גזור מתוך באופן דומה בעת הצורך.
3. עיכול ודיסוציאציה של נוירונים עכבר למבוגרים DRG
- לאחר איסוף כל DRGs גזור, להחליף את המדיום MEM עם collagenase 1 מ"ל פתרון דגירה צינור microfuge על 37 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות.
- החלף הפתרון collagenase עם 500 μl 1X TrypLE Express כךlution ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 15-20 דקות.
- הסר את הפתרון TrypLE אקספרס ולשטוף את DRGs בינוני עם 1 מ"ל התרבות מוכן (המכיל 5% FBS) במשך 3 פעמים.
- הוסף 600 μl בינוני תרבות בעדינות פיפטה למעלה ולמטה כדי triturate הרקמות של 20-30 פעמים באמצעות 1 מ"ל כחול, סיימה פיפטה עצה.
- לאחר טחינה דקה, לאפשר הלא הסתייגותם רקמות להתיישב לתחתית microfuge ולהעביר את ההשעיה התא צינור סטרילי 10 מ"ל. להוסיף עוד 600 בינוני תרבות μl וחזור על צעד טחינה דקה עד רוב הרקמות הן ניתק. ההשעיה התא המתקבל מכיל שני נוירונים שאינם תאים עצביים. ברוב המקרים, תאים DRGs 6 (~ 5 X10 4) משמשים תגובה 1 electroporation.
4. מניפולציה גנטית של הנוירונים באמצעות electroporation
- מכינים את הפתרון transfection ידי ערבוב פתרון nucleofection Amaxa על נוירונים עכבר עם פלסמידים DNA (~ 10 מיקרוגרם) או oligos siRNA (~ 0.2 nmol) כדי להפוך את נפח הסופי של μl 100 transfection עבור כל אחד.
- בצנטריפוגה תאים הסתייגותם בסל"ד 680 דקות 7 בטמפרטורת החדר, וזורקים supernatant ככל האפשר. מוסיפים את הפתרון transfection מוכן בעדינות פיפטה למעלה ולמטה 3-4 פעמים עם 200 טיפים פיפטה μl מחדש להשעות את התאים.
- מעבירים את ההשעיה תאים משולבים עם פתרון transfection כדי קובט electroporation ו electroporate את התאים באמצעות תוכנית Nucleofector Amaxa מערכת G-013.
- לאחר electroporation, מיד להוסיף 500 μl מראש מחומם (37 מעלות צלזיוס) בינוני תרבות המכיל FBS כדי קובט ולהעביר את כל הפתרון (~ 600 μl) לתוך צלחת תרבות מצופה על צפיפות התאים הרצויים. לצורך ניסוי זה דורש מחדש ההשעיה מחדש ציפוי, הנוירונים מתורבתים ישירות צפיפות גבוהה (10000-20000 תאים / גם) על צלחת פלסטיק התרבות. לצורך ניסוי ישירות בוחן הצמיחה האקסון, הנוירונים הם אונטריו מצופההו coverslips זכוכית מצופה בצפיפות נמוכה (3000-5000 תאים / גם). מניחים את הצלחת התרבות לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2).
- ארבע שעות לאחר ציפוי כאשר נוירונים לא מחובר מצעים, בעדינות להחליף את המדיום תרבות (אשר מכיל את הפתרון nucleofection Amaxa) עם בינוני תרבות μl 500 רעננה מחומם מראש, ולהחזיר את הצלחת חממה לתרבות נוספת (37 ° C , 5% CO 2). בינוני הן בתרבות המכיל FBS או בינוני סרום ללא יכול לשמש בשלב זה.
5. למבוגרים culturing נוירונים DRG עבור ניתוח צמיחה אקסון
- עבור נוירונים transfected עם פלסמידים ה-DNA, הביטוי של הגן ריבית של (למשל EGFP) ניתן לראות כבר לאחר כמה שעות electroporation. עבור נוירונים transfected עם siRNAs, אנחנו בדרך כלל לחכות 3-4 ימים כדי לאפשר התרוקנות מספקת של חלבונים אנדוגניים. הנוירונים בתרבית יכול להיות קבוע ישירות הוריו לניתוח הצמיחה האקסוןלנו זמן נקודות (1-4 ימים לאחר electroporation) או מחדש מושעה מחדש מצופה לנתח האקסון לצמיחה מחודשת (ראו להלן).
- עבור RNAi בתיווך הפסד של תפקודי מחקרים, הנוירונים בתרבית ניתן מחדש על תנאי מחדש מצופה לאפשר אקסונים לצמוח מחדש מתא עצב, שבו חלבונים ממוקדות מתרוקנים כבר. כדי לעשות זאת, להחליף את המדיום התרבות הישנה של צפיפות גבוהה נוירונים בתרבית עם בינוני 1 מחומם מראש מ"ל פיפטה טרי בעדינות מעלה ומטה על 6-10 פעמים מחדש להשעות את נוירונים המחוברים הצלחת התרבות. משום שאינם נוירונים בתאי שוואן תאים (למשל) מייחסים הרבה יותר הדוק לצלחת התרבות מאשר נוירונים, מחדש תאים המרחפים הם בעיקר נוירונים.
- להעביר מחדש מושעה נוירונים לתוך צינור microfuge בעדינות triturate 10-15 פעמים מחדש לנתק את גושי תאים לתוך ההשעיה תא בודד.
- מחדש את הצלחת מחדש הסתייגותם נוירונים גבי coverslips שהוכנו לאחרונה על צפיפות נמוכה (3000-5000 תאים / גם) ותרבות לילה (16-24 שעות).
6. קיבעון, חיסוני מכתים, ו דימות פלואורסצנטי
- Aspirate בינונית ומוסיפים paraformaldehyde 4% (PFA) (200 μl / גם) כדי לתקן את התאים 15-20 דקות בטמפרטורת החדר. התאים קבועים נשטפים מכן עם 1X PBS במשך 3 פעמים.
- Aspirate PBS ולהוסיף הפתרון חוסם (1% שור סרום אלבומין, טריטון 0.1% X-100, ו - 2.0% בדם עזים נורמלית 1X PBS) לתאי העצב קבוע עבור 60 דקות בטמפרטורת החדר.
- כדי אקסונים תווית, הנוירונים הם חיסונית מוכתם עם נוגדי neurofilaments או נגד βIII נוגדנים טובולין. לשם כך, מקם ירידה 30μl של פתרון הנוגדן הראשוני (1:1200 דילול של נוגדנים βIII-טובולין) על parafilm coverslip עבור כל אחד. להפוך את coverslips ומניחים אותם על פתרון נוגדנים העיקרית 60 דקות בטמפרטורת החדר.
- חזור coverslips לצלחת התרבות המקורית ולשטוף אותם עם 1X PBS במשך 3 פעמים.
- לחזור על התהליך זהה משניtibody.
- לשטוף עם מים מזוקקים coverslips במשך 3 פעמים, ולאחר מכן לעלות coverslips על שקופיות זכוכית עם פתרון גובר (למשל להאריך Antifade זהב).
- הנוירונים צבעונית ניתן הדמיה עם כל מערכת מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במצלמה דיגיטלית. מאמצים את האקסון נמדדים ונותחו באמצעות תוכנת ניתוח הדמיה.
7. נציג תוצאות
בהעדר כל גורמי גדילה תאיים מוסף, הנוירונים DRG בוגרים בדרך כלל מתחילים לגדול אקסונים 48 שעות לאחר ציפוי 1. אקסונים לעיתים קרובות להראות מורפולוגיות מסועפות (איור 1). לעומת זאת, מחדש מצופה הנוירונים מתחילים להרחיב את האקסונים רק כמה שעות לאחר ציפוי, וגם את האקסונים להאריך עם מסעף מופחת בהרבה (איור 2). התוצאות מראות כי מחדש מצופה נוירונים חולקים תכונות דומות לאלו של נוירונים מיזוג lesioned. על ידי שימוש בגישה זו, אנו ביצעו לאחרונה הפסדשל תפקודי מחקרים כדי לבחון את התפקיד של גורם שעתוק התחדשות האקסון הקשורים C-יוני בצמיחה האקסון מתא עצב DRG בוגרים במבחנה. התוצאות הראו כי electroporation מקבוצה של 4 siRNAs שונים המתמקדים באזורים שונים של c-יוני (ON-TARGETplus) הקטינה במידה ניכרת את רמות החלבון של C-יוני בנוירונים בוגרים DRG 3 ימים לאחר transfection (איור 3) 9. כאשר נוירונים היו מחדש מצופה תרבותי הצמיחה בין לילה, האקסון מ C-Jun נוירונים מציאה הופחת באופן משמעותי (שליטה: 348.37 ± 16.21mm: si-c-יוני: 262.32 ± 15.69 מיקרומטר, איור 3) 9. תוצאות אלו מצביעות על DRG כי נוירונים בתרבית בוגרים לספק מערכת מודל שימושי ללמוד הצמיחה האקסון של נוירונים בוגרים.
באיור 1. עכבר למבוגרים נוירונים בתרבית DRG בצפיפות נמוכה במשך 3 ימים. הנוירונים הוכתמו אנטי - & BETA, נוגדנים III טובולין. שים לב, רוב האקסונים להראות מורפולוגיות מסועפת. סרגל קנה מידה: 125 מיקרומטר.
איור 2. מחדש ציפוי עכבר מבוגר DRG נוירונים לאחר 3 ימים בתרבות. (א) DRG נוירונים בוגרים בתרבית בצפיפות גבוהה במשך 3 ימים. (ב) Re מצופה DRG נוירונים בוגרים היו בתרבית בצפיפות נמוכה למשך הלילה. שים לב האקסון ביותר להראות מורפולוגיות מאורכים עם מעט האקסון מסעף. סרגל קנה מידה: 250 מיקרומטר בעוד כמה ו 125 מיקרומטר ב '
איור 3. תפקיד C-יוני בצמיחה האקסון מתא עצב DRG בוגרים במבחנה. (א) המערב ניתוח כתם של C-יוני על העכבר למבוגרים DRG נוירונים לאחר electroporation של C-יוני siRNAs. מכך עולה רמת להקטנה ניכרת של כ-יוני (ב) נוירונים בקרה transfected עם EGFP גדל אקסונים ארוכים לאחר ציפוי מחדש ותרבות לילה. (C) Co-טראנסfection של C-יוני siRNAs ו EGFP גידול לקוי האקסון מתא עצב בוגרים DRG לאחר ציפוי מחדש ותרבות לילה. אדום: Tuj-1 מכתים: ירוק: EGFP. סרגל קנה מידה: 125 מיקרומטר. תוצאות אלו פורסמו Saijilafu et al. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למבוגרים נוירונים DRG להתחדש האקסונים שלהם וחסונה לאחר פגיעה עצבית היקפית in vivo ו - in vitro, ובכך לספק מערכת שימושית ללמוד התחדשות האקסון אצל בעלי חיים בוגרים. בתרבות חוץ גופית של נוירונים בוגרים DRG נעשה שימוש נרחב בשיטה לחקור את המנגנונים המולקולריים שבאמצעותם האקסון התחדשות מוסדר. בהליך חוץ גופית של נוירונים בוגרים culturing עכבר DRG המוצג כאן מאפשר המחקר הגנטי מהירה ויעילה של צמיחה האקסון רגנרטיבית. ההליך מחדש ההשעיה מחדש ציפוי שימושי במיוחד על אובדן של תפקודי מחקרים כי זה מאפשר אקסונים מחדש לגדול מ הנוירונים שבו החלבון ממוקד כבר מתרוקנים. יתר על כן, ציפוי מחדש של נוירונים בתרבית DRG מחקה למעשה הנגע vivo אוויר, ובכך לספק גישה רלוונטי פיזיולוגי יותר ללמוד התחדשות האקסון במבחנה.
יעילות transfection של מבוגר DRG neurons עם גישה electroporation תיאר הוא כ 20-50% על פלסמידים דנ"א תלוי בגדלים של מבנים, אשר מספקת ניתוח מורפולוגי של צמיחה האקסון. בהשוואה אל electroporation, העברת ויראלי בתיווך הגן יש יעילות גבוהה הרבה יותר, אשר מתאים ניתוח ביוכימי באמצעות נוירונים DRG. עם זאת, בניית והפקת וירוס עבור כל עניין הגנים של העבודה הוא רב הרבה יותר אינטנסיבי הזמן. עבור oligos siRNA, יעילות transfection יכול להגיע כמעט 90% על בסיס יעילות דריסה של חלבונים ממוקדים (ראה איור 3 א), מה שהופך את ניתוח ביוכימי של נוירונים בוגרים DRG אפשריים. עם זאת, ההשפעה של siRNAs מפחית לאחר פרק זמן ארוך יותר בשל ירידה של oligos siRNA.
כאשר נוירונים הם שיתוף transfected עם 2 פלסמידים מעורבים ביחס 1:1, פלסמיד עם גודל קטן יותר בדרך כלל יש יעילות גבוהה יותר מאשר transfection פלסמיד בגודל גדול יותר. כמו aresult, התאמת יחס של שני פלסמידים ישנה את יעילות שיתוף transfection בהתאם. עבור transfection siRNA, לעתים קרובות אנו לשתף transfect הנוירונים עם EGFP לנוירונים התווית. מאחר oligos siRNA הם הרבה יותר קטנים מאשר EGFP, יעילות transfection שלהם הוא הרבה יותר גבוה. על כן, בניסויים שלנו אנחנו בדרך כלל חושבים כל הנוירונים חיוביות EGFP גם חיובית siRNAs.
מחקרים רבים אפיון גנטי של נוירונים בוגרים DRG לאחר axotomy היקפי זיהו מספר רב של גנים הקשורים התחדשות (סמרטוטים) 10-12, אשר האמין ביסוד יכולת התחדשות של נוירונים בוגרים DRG. עם זאת, פונקציות אלה סמרטוטים בתיווך הצמיחה האקסון של נוירונים בוגרים DRG לא אופיינו היטב. כאן אנו נבחן את תפקידו של סמרטוט ידוע, C-יוני, בתיווך הצמיחה האקסון מתא עצב בוגרים DRG דרך הגישה אובדן-of-RNAi פונקציה מתווכת. שיטה כזו מספקת ערך בכלי חוץ גופית כדי investigaטה את התפקידים של סמרטוטים אחרים רגולציה של התחדשות האקסון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של FZ-NIH (R01NS064288) ואת ה 'קרייג Neilsen קרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
