Summary
En
Abstract
Det er velkjent at modne nevroner i sentralnervesystemet (CNS) ikke kan regenerere sine aksoner etter skader på grunn av redusert egenverdi evne til å støtte axon vekst og et fiendtlig miljø i modne CNS 1,2. I motsetning, modne nevroner i det perifere nervesystemet (PNS) regenerere lett etter skader 3. Voksen dorsal root ganglion (DRG) nevronene er godt kjent for å regenerere robust etter perifere nerveskader. Hver DRG neuron vokser en axon fra cellen soma, som grener seg i to aksonale grener: en perifer gren innervating perifere mål og en sentral avdelingskontorer strekker i ryggmargen. Skade av DRG perifere aksoner resulterer i betydelig axon gjenfødelse, mens sentrale axoner i ryggmargen regenerere dårlig etter skaden. Men hvis perifere aksonal skade inntreffer før den ryggmargsskade (en prosess kalt condition lesjon), regenerering av sentrale axoner er greatly forbedret fire. Videre de sentrale axons av DRG nevroner som deler samme fiendtlig miljø som synkende corticospinal axoner i ryggmargen. Sammen blir det en hypotese at de molekylære mekanismene som styrer axon regenerering av voksne DRG nevroner kan bli brukt til å forbedre CNS axon gjenfødelse. Som et resultat, er voksne DRG nevroner nå mye brukt som et modellsystem for å studere regenerative axon vekst 5-7.
Her beskriver vi en metode for voksen DRG nervecellen kultur som kan brukes til genetisk undersøkelse av axon regenerering in vitro. I denne modellen voksen DRG nevroner er genetisk manipulert via electroporation-mediert genet transfeksjon 6,8. Ved transfecting nevroner med DNA plasmid eller si / shRNA, gjør denne tilnærmingen både gevinst-og tap-av-funksjon eksperimenter for å undersøke hvilken rolle en gen-of-interesse i axon vekst fra voksne DRG nerveceller. Når nevroner tilført med Si / shRNA, er målrettet endogene proteinetvanligvis oppbrukt etter 3-4 dager i kultur, der tiden robust axon veksten allerede har skjedd, noe som gjør tap-av-funksjon studier mindre effektiv. For å løse dette problemet, omfatter metoden beskrevet her en re-suspensjon og re-plating steg etter transfeksjon, som lar axons å re-vokse fra nevroner i fravær av den målrettede protein. Til slutt gir vi et eksempel på bruk denne in vitro modell for å studere rollen til en axon gjenfødelse-assosiert genet, c-Jun, i formidling axon vekst fra voksen DRG nerveceller 9.
Protocol
1. Utarbeidelse av Dekkglass, Kultur Medium, og fordøyelse enzymer
- Den 12-mm runde # 1 glass Dekkglass brukes for nevronale kultur. De Dekkglass rengjøres med 10% HCl natten etterfulgt av ultralyd vask med destillert og avionisert vann for 3 ganger (20 min / tid). De rensede Dekkglass lagres i 70% etanol for fremtidig bruk. Før hver eksperimenter, Dekkglass er luft tørket og plassert inn i kulturen plate.
- Å belegge de tørkede Dekkglass, 100 mL av belegg løsning som inneholder 100 mikrogram / ml Poly-D-Lysine og 10 mikrogram / ml Laminin arbeider løsningen er lagt inn på hver dekkglass og kultur plate er overført til en 37 ° C inkubator. Etter 1-2 timer er det belegg løsningen fjernes og Dekkglass er vasket 3 ganger med sterilt 1X PBS.
- For å forberede kulturen medium, den Minimum Essential Medium (MEM) er supplert med 5% fosterets storfe serum (FBS), 1X Penicillin-Streptomycin løsning (500 enheter av penicillin og 500 mikrogram av streptomycin), 1X GlutaMAX-I supplement, og de antimitotic reagenser inneholder 20 mM 5-fluoro-2-deoxyuridine og 20 mM uridine (FDU / R). For serum-fri medium er FBS erstattet med supplement B27.
- Den collagenase En løsning er utarbeidet ved oppløsning collagenase Et pulver med MEM å lage en fungerende konsentrasjon på 1 mg / ml. For trypsin er 1X TrypLE Express benyttes.
2. Disseksjon og hausting av Voksen Mus DRG Neurons
- Etter euthanizing den 6 - til 10-uker gammel voksen mus, fjerne dorsal huden og kuttet av hele ryggsøylen. Vask fjernet ryggsøylen med 1 x PBS 2-3 ganger.
- Pin fjernet ryggsøylen til dissekere plate med ventral siden opp, og nøye fjerner muskler til å avdekke de sensoriske nerver under et dissekere mikroskop. Nervene knyttet til DRGs på tømmer nivå er den tykkeste og lett å finne. Derfor, for de fleste eksperimenter bare lumbarDRGs høstes.
- Skjær gjennom hver virvel langs midtlinjen med liten saks og fjern forsiktig mellomvirvelskiver. Bruk pinsett for å splitte hver ryggvirvel å avsløre ryggmargen.
- Til å dissekere ut trelast DRGs, løfte opp hver trelast nerve med pinsett og spore mot ryggmargen å finne de tilknyttede lumbale DRGs (fra L1 til L6).
- Avskåret hver DRG fra vedlagte perifer nerve, dorsal og ventral røtter med våren saks, og lagre den i microfuge tube med MEM medium plasseres på is. Flere DRGs på ulike spinale nivåer (f.eks thorax DRGs) kan dissekert ut på en lignende måte når det er nødvendig.
3. Fordøyelse og dissosiasjon av Voksen Mus DRG Neurons
- Etter å ha samlet alle de dissekerte DRGs, erstatte MEM medium med 1 ml collagenase en løsning og Inkuber microfuge røret ved 37 ° C i 90 min.
- Bytt collagenase En løsning med 500 mL 1X TrypLE Express slikforurensning og Inkuber ved 37 ° C i 15-20 min.
- Fjern TrypLE Express løsningen og vaske DRGs med 1 ml forberedt kultur medium (som inneholder 5% FBS) i 3 ganger.
- Legg 600 mL kultur medium og forsiktig pipetter opp og ned til triturate vev for 20-30 ganger med en 1 ml blå, uteksaminert pipettespissen.
- Etter trituration, la de ikke-dissosiert vev å slå seg ned til bunnen av microfuge og overføre cellesuspensjon til en 10 ml sterilt rør. Legg til en annen 600 mL kultur medium og gjenta trituration trinnet til de fleste vev er dissosiert. Den innhentet cellesuspensjon inneholder både nerveceller og ikke-nevronale celler. I de fleste tilfeller er celler fra 6 DRGs (~ 5 x10 4) benyttes til en electroporation reaksjon.
4. Genetisk manipulering av nerveceller via electroporation
- Klargjør transfeksjon løsningen ved å blande Amaxa nucleofection løsning for mus nevroner med DNA plasmider (~ 10 mikrogram) Eller siRNA oligos (~ 0,2 nmol) å foreta en endelig volum på 100 mL for hver transfeksjon.
- Sentrifuger dissosiert cellene ved 680 rpm for 7 minutter ved romtemperatur, og kast supernatant så mye som mulig. Legg den tilberedte transfeksjon løsning og forsiktig pipetter opp og ned 3-4 ganger med 200 mL pipettespisser å re-suspendere cellene.
- Overfør cellesuspensjon blandet med transfeksjon løsning til electroporation kyvette electroporate cellene ved hjelp av Amaxa Nucleofector systemet program G-013.
- Etter electroporation, straks legge til 500 mL av forvarmes (37 ° C) kultur medium med FBS til kyvetten og overføre all løsningen (~ 600 mL) i den belagte kulturen platen på ønskede celle tettheter. For eksperiment som krever re-suspensjon og re-plating, er nervecellene dyrkes direkte på plast kulturen fatet ved høy tetthet (10000-20000 celler / brønn). For eksperiment som direkte undersøker axon vekst, nevroner er belagt onto belagte glass Dekkglass ved lavere tetthet (3000-5000 celler / brønn). Plasser kulturen platen inn i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2).
- Fire time etter plating når nevronene har festet til underlag, forsiktig erstatte den kulturen medium (som inneholder Amaxa nucleofection løsning) med 500 mL frisk og forvarmes kultur medium, og returnere platen til inkubator for ytterligere kultur (37 ° C , CO 5% 2). Både kultur medium med FBS eller serum-fri medium kan brukes på dette trinnet.
5. Dyrkning Voksen DRG Neurons for Axon Growth Analysis
- For nevroner transfekterte med DNA plasmider, kan uttrykket av genet-of-interesse (f.eks EGFP) bli observert så tidlig som noen time etter electroporation. For nevroner transfekterte med siRNAs, vi vanligvis vente 3-4 dager for å tillate tilstrekkelig uttømming av de endogene proteiner. De dyrkede nerveceller kan enten direkte fastsettes for axon vekst analyse på Variooss tid poeng (1-4 dager etter electroporation) eller re-suspendert og re-belagt å analysere axon gjenvekst (se nedenfor).
- For RNAi-medierte tap-av-funksjon studier, kan de dyrkede nerveceller bli re-suspendert og re-belagt å tillate axons å vokse fra nevroner, hvor målrettet proteiner er allerede oppbrukt. For å gjøre dette, erstatte den gamle kulturen medium av høy tetthet dyrkede nerveceller med 1 ml forvarmes frisk medium og pipette forsiktig opp og ned for 6-10 ganger for å re-suspendere vedlagte nerveceller fra kulturen plate. Fordi ikke-nevronale celler (f.eks Schwann celler) fester mye strammere til kultur fatet enn nerveceller, de re-suspenderte celler er stort sett nevroner.
- Overfør re-suspendert nevroner i en microfuge rør og forsiktig triturate 10-15 ganger for å re-dissociate cellen klumper i én celle suspensjon.
- Re-plate de re-dissosiert nevroner inn på nylig utarbeidet Dekkglass ved lav tetthet (3000-5000 celler / brønn) og kultur over natten (16-24 timer).
6. Fiksering, Immuno-farging, og fluorescens Imaging
- Aspirer medium og tilsett 4% paraformaldehyde (PFA) (200 mL / brønn) for å fikse de cellene i 15-20 minutter ved romtemperatur. De faste cellene blir deretter vasket med 1X PBS til 3 ganger.
- Aspirer PBS og tilsett blokkering løsningen (1% bovint serum albumin, 0,1% Triton X-100, og 2,0% normal geit serum i 1X PBS) til de faste nervecellene i 60 min ved romtemperatur.
- Å merke aksoner, nervecellene er immuno-beiset med anti-neurofilaments eller anti-βIII tubulin antistoff. For å gjøre dette, plasserer en 30μl dråpe primær antistoff løsning (1:1200 fortynning for-βIII tubulin antistoff) på en Parafilm for hver dekkglass. Invertere Dekkglass og plasser dem på den primære antistoffet løsningen i 60 min ved romtemperatur.
- Tilbake Dekkglass til den opprinnelige kulturen plate og vask dem med 1X PBS til 3 ganger.
- Gjenta samme prosedyre for den sekundære entibody.
- Vask Dekkglass med destillert vann for 3 ganger, og deretter montere Dekkglass på glassplater med montering løsningen (f.eks Forleng Gold Antifade).
- De fargede nevroner kan avbildes med alle fluorescensmikroskopi system utstyrt med et digitalt kamera. Aksonet lengder måles og analyseres med bildebehandling analyse programvare.
7. Representative Resultater
I fravær av eventuelle tilleggstjenester ekstracellulære vekstfaktorer, de voksne DRG nervecellene vanligvis begynner å vokse axoner 48 time etter første platekledning. Axoner viser ofte forgrenede morfologi (Figur 1). I motsetning til re-belagte neurons begynne å forlenge axoner bare noen time etter plating, og axoner forlenge med mye redusert forgrening (figur 2). Disse resultatene tyder på at re-belagte nevroner dele lignende egenskaper til de av condition lesioned nerveceller. Ved å bruke denne tilnærmingen, har vi nylig utført tap-av-funksjon studier for å undersøke hvilken rolle axon gjenfødelse tilhørende transkripsjonsfaktor c-Jun i axon vekst fra voksne DRG nevroner in vitro. Resultatene viste at electroporation av en gruppe på 4 forskjellige siRNAs målretting forskjellige regioner av c-Jun (ON-TARGETplus) merkbart redusert protein nivåene av C-Jun hos voksne DRG nevroner 3 dager etter transfeksjon (figur 3) 9. Når nervecellene ble re-belagt og kultivert over natten, axon vekst fra c-Jun knockdown nevroner ble betydelig redusert (Control: 348,37 ± 16.21mm; SI-c-jun: 262,32 ± 15,69 mikrometer, figur 3) 9. Disse resultatene indikerer fastsette at dyrkede voksne DRG nevroner en nyttig modellsystem for å studere axon vekst fra voksne nerveceller.
Figur 1. Voksen mus DRG nevroner dyrket ved lav tetthet i 3 dager. Nervecellene ble farget med anti - & beta; III tubulin antistoff. Merk at de fleste axoner viser forgrenede morfologi. Scale bar: 125 mikrometer.
Figur 2. Re-plating voksen mus DRG nevroner etter 3 dager i kultur. (A) Voksne DRG nevronene dyrkes ved høy tetthet i 3 dager. (B) Re gullbelagte voksne DRG nevronene ble dyrket ved lav tetthet for natten. Merk at de fleste axon viser langstrakte morfologi med lite axon forgrening. Scale bar: 250 mikrometer i A og 125 mikrometer i B.
Figur 3. Rolle c-jun i axon vekst fra voksne DRG nevroner in vitro. (A) Western blot analyse av c-Jun i voksen mus DRG nevroner etter electroporation av c-jun siRNAs. Resultatet viser kraftig redusert nivå av C-juni (B) Kontroll nevroner transfekterte med EGFP vokste lange aksoner etter re-plating og overnatter kultur. (C) Co-transsjon av c-Jun siRNAs og EGFP nedsatt axon vekst fra voksne DRG nevroner etter re-plating og overnatter kultur. Red: Tuj-1 flekker; Green: EGFP. Scale bar: 125 mikrometer. Disse resultatene er publisert i Saijilafu et al. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voksen DRG nevroner regenerere sine axoner robust etter perifer nerveskade in vivo og in vitro, og dermed gi et nyttig system for å studere axon regenerering hos voksne dyr. In vitro kultur av voksne DRG nevroner er blitt en mye brukt metode for å undersøke de molekylære mekanismer som axon gjenfødelse er regulert. In vitro prosedyren for dyrking voksne mus DRG nevroner presenteres her muliggjør rask og effektiv genetisk studie av regenerativ axon vekst. Det re-suspensjon og re-plating prosedyre er spesielt nyttig for tap-av-funksjon studier fordi den tillater axoner re-vokse fra nevroner i hvor målrettet protein er allerede oppbrukt. Dessuten etterligner re-plating dyrkede DRG nevroner en in vivo condition lesjon effekt, og dermed gi en mer fysiologisk relevant tilnærming for å studere axon regenerering in vitro.
Den transfeksjon effektivitet voksen DRG neurons med den beskrevne electroporation tilnærmingen er ca 20-50% for DNA plasmider avhengig av størrelsen på konstruksjoner, som er tilstrekkelig for morfologisk analyse av axon vekst. Sammenlignet med electroporation har viral-mediert genoverføring mye høyere effektivitet, noe som er egnet for biokjemisk analyse ved hjelp av DRG nerveceller. Men konstruere og produsere virus for hvert gen-of-interesse er mye mer arbeidskrevende og tidkrevende. For siRNA oligos kan transfeksjon effektivitet nå nesten 90% basert på den slå ned effektiviteten av de målrettede proteiner (se figur 3A), som gjør biokjemisk analyse av voksne DRG nevroner mulige. Men reduserer effekten av siRNAs etter lengre periode på grunn av nedbrytning av siRNA oligos.
Når nevroner samtidig tilført med 2 plasmider blandet i forholdet 1:1, har plasmidet med mindre størrelsen vanligvis høyere transfeksjon effektivitet enn plasmidet med større størrelse. Som aresult vil justere forholdet mellom de to plasmider endre co-transfeksjon effektivitet tilsvarende. For siRNA transfeksjon, vi ofte sammen transfektere nervecellene med EGFP å merke nerveceller. Fordi siRNA oligos er mye mindre enn EGFP, er deres transfeksjon effektivitet mye høyere. Derfor, i våre eksperimenter generelt tror vi at alle EGFP positive nevroner er også positivt for siRNAs.
Mange genetiske profilering studier av voksne DRG nevroner etter perifer axotomy har identifisert et stort antall rehabiliteringsprosjekter-tilknyttede gener (RAGS) 10-12, som antas å ligge til grunn regenerering evne voksne DRG nerveceller. Imidlertid har funksjonene til disse filler i formidling axon vekst av voksne DRG nevroner ikke blitt godt karakterisert. Her har vi undersøkt hvilken rolle en velkjent RAG, c-Jun, i formidling axon vekst fra voksne DRG nevronene via RNAi-mediert tap-av-funksjon tilnærming. En slik metode gir en verdifull in vitro verktøy til etterforskningTe rollene til andre filler i reguleringen av axon gjenfødelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd til FZ fra NIH (R01NS064288) og Craig H. Neilsen Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
