Summary
Un
Abstract
Es bien sabido que las neuronas maduras en el sistema nervioso central (SNC) no se puede regenerar sus axones después de lesiones debidas a la capacidad disminuida intrínseca para apoyar el crecimiento axonal y un ambiente hostil en el 1,2 SNC maduro. En contraste, las neuronas maduras en el sistema nervioso periférico (PNS) regenerar fácilmente después de las lesiones 3. XXX raíz dorsal (DRG ganglionares) neuronas son bien conocidos para regenerar robustamente después de lesiones de nervios periféricos. Cada neurona DRG crece un axón del soma celular, que se ramifica en dos ramas: una rama axonal periférico que inerva objetivos periféricos y una rama central que se extiende a la médula espinal. Lesiones de los resultados DRG axones periféricos en la regeneración de axones sustancial, mientras que los axones centrales en la médula espinal regenerarse poco después de la lesión. Sin embargo, si la lesión axonal periférica se produce antes de la lesión de la médula espinal (un proceso llamado la lesión acondicionado), la regeneración de los axones centrales es greatly mejora 4. Por otra parte, los axones de las neuronas DRG centrales comparten el mismo ambiente hostil como descendente corticoespinal axones en la médula espinal. En conjunto, es la hipótesis de que los mecanismos moleculares que controlan la regeneración de los axones de las neuronas DRG adultos pueden aprovecharse para mejorar la regeneración del SNC axón. Como resultado, adultos neuronas DRG se utilizan ahora ampliamente como un sistema modelo para estudiar el crecimiento axonal regenerativo 5-7.
Aquí se describe un método de cultivo adulto DRG neurona que puede ser utilizado para el estudio genético de la regeneración axonal in vitro. En este ejemplo de un adulto las neuronas DRG están genéticamente manipulados a través de electroporación mediada por transfección de genes 6,8. Al transfectar neuronas con ADN plásmido o si / shRNA, este enfoque permite a ambos ganancia y la pérdida de la función de los experimentos para investigar el papel de un gen de interés en el crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos. Cuando las neuronas son transfectadas con SI / shRNA, la proteína endógena es dirigidageneralmente agotada después de 3-4 días en cultivo, durante el cual el crecimiento del axón tiempo robusta ya ha ocurrido, por lo que los estudios de pérdida de la función sea menos eficaz. Para resolver este problema, el método aquí descrito incluye un paso de re-suspensión y re-chapado después de la transfección, que permite que los axones para volver a crecer a partir de las neuronas en la ausencia de la proteína específica. Por último, ofrecemos un ejemplo del uso de este modelo in vitro para estudiar el papel de una regeneración axonal asociada a la genética, c-Jun, en la mediación de crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos 9.
Protocol
1. Preparación de cubreobjetos, medio de cultivo, y las enzimas de digestión
- La ronda 12-mm # 1 cubreobjetos de vidrio se utilizan para el cultivo neuronal. Los cubreobjetos se limpian con HCl al 10% durante la noche seguido por lavado ultrasónico con agua destilada y desionizada durante 3 veces (20 minutos / hora). Los cubreobjetos limpios se almacena en 70% de etanol para uso futuro. Antes de cada experimentos, los cubreobjetos se secan al aire y se coloca en la placa de cultivo.
- Para recubrir los cubreobjetos secos, 100 l de solución de revestimiento que contiene 100 mg / ml de poli-D-lisina y 10 ug / ml de solución de trabajo laminina se añade en cada cubreobjetos y la placa de cultivo se transfiere a una incubadora a 37 ° C. Después de 1-2 horas, la solución de revestimiento se retira y los cubreobjetos se lavaron 3 veces con PBS estéril 1X.
- Para preparar el medio de cultivo, el Medio Esencial Mínimo (MEM) se complementa con fetal al 5% de suero bovino (FBS), penicilina-estreptomicina 1X solución (500 unidades de penicilLin y 500 g de estreptomicina), suplemento 1X GlutaMAX-I, y los reactivos antimitóticos que contiene 20 mM de 5-fluoro-2-desoxiuridina y 20 mM uridina (FDU / R). Para el medio libre de suero, el FBS se sustituye con el suplemento de B27.
- La colagenasa Se prepara una solución disolviendo colagenasa Un polvo con MEM para hacer una concentración de trabajo de 1 mg / ml. Para la tripsina, la 1X TrypLE Express se utiliza.
2. Disección y Cosecha de ratón adulto las neuronas DRG
- Después de la eutanasia de los 6 - de ratón adulto de 10 semanas de edad, retire la piel dorsal y le cortó toda la columna. Lavar la columna vertebral eliminado con 1 x PBS 2-3 veces.
- Pin de la columna vertebral para eliminar la placa de la disección con el lado ventral y quita cuidadosamente los músculos para exponer los nervios sensoriales con un microscopio de disección. Los nervios conectados a los GRD a nivel de la madera son los más gruesos y fáciles de localizar. Por lo tanto, sólo para la mayoría de los experimentos lumbarGRD se cosechan.
- Corte a través de cada vértebra a lo largo de la línea central con unas tijeras pequeñas y retire con cuidado los discos intervertebrales. El uso de pinzas para separar las vértebras para exponer la médula espinal.
- Para diseccionar los GRD de madera, levanta cada nervio de madera con una pinza y trazar hacia la médula espinal para localizar a los GRD asociados lumbares (L1 a L6).
- Cortar cada GRD del nervio periférico conectado, las raíces dorsales y ventrales con unas tijeras de primavera, y lo almacena en un tubo de microcentrífuga con medio MEM se coloca en hielo. Más GRD en diferentes niveles espinal (por ejemplo GRD torácica) puede ser disecado cabo de una manera similar, cuando sea necesario.
3. La digestión y la disociación de ratón adulto las neuronas DRG
- Después de recoger todos los GRD disecados, reemplace el medio MEM con colagenasa 1 ml de una solución e incubar el tubo de microcentrífuga a 37 ° C durante 90 min.
- Vuelva a colocar la colagenasa una solución con 500 l Express 1X TrypLE paralución y se incuba a 37 ° C durante 15-20 min.
- Retire la solución de TrypLE Express y lavar los GRD con un medio de cultivo preparado ml (con un 5% de SFB) por 3 veces.
- Añadir 600 l medio de cultivo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo para triturar los tejidos de 20-30 veces con un 1 ml de azul, se graduó punta de la pipeta.
- Después de la trituración, permitir que los tejidos no disociadas a asentarse en el fondo de la microcentrífuga y transferir la suspensión celular a un tubo de 10 ml estéril. Añadir otro medio de 600 l cultura y repita el paso de trituración hasta que la mayoría de los tejidos se disocian. La suspensión celular obtenida contiene tanto neuronas y células no neuronales. En la mayoría de los casos, las células de 6 GRD (~ 5 x 10 4) se utilizan para la reacción electroporación una.
4. La manipulación genética de las neuronas a través de electroporación
- Preparar la solución de transfección mediante la mezcla de la solución nucleofection Amaxa para las neuronas de ratón con plásmidos de ADN (~ 10 mg) O oligos siRNA (~ 0,2 nmol) para hacer un volumen final de 100 l por cada transfección.
- Centrifugar las células disociadas a 680 rpm durante 7 minutos a temperatura ambiente, y desechar el sobrenadante tanto como sea posible. Añadir la solución de transfección preparada y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces con puntas de pipeta de 200 l para volver a suspender las células.
- Transferir la suspensión celular se mezcla con la solución de transfección de la cubeta de electroporación y electroporate las células utilizando el programa Amaxa nucleofector sistema G-013.
- Después de la electroporación, inmediatamente añadir 500 l de pre-calentado (37 ° C) que contenía FBS al medio de cultivo a la cubeta y transferir toda la solución (~ 600 l) en la placa de cultivo recubierto con densidades de células deseadas. Para el experimento que requiere re-suspensión y re-chapado, las neuronas se cultivan directamente sobre la placa de cultivo de plástico a alta densidad (10000-20000 células / pocillo). Para el experimento que se examina directamente el crecimiento del axón, las neuronas son ont plateadoo cubreobjetos de vidrio recubiertas con menor densidad (3000-5000 células / pocillo). Coloque la placa de cultivo en la incubadora (37 ° C, 5% de CO 2).
- Cuatro horas después de placas cuando las neuronas se han unido a los sustratos, vuelva a colocar el medio de cultivo (que contiene la solución nucleofection Amaxa) con 500 l medio de cultivo fresco y pre-calentado, y devolver la placa a la incubadora para el cultivo adicional (37 ° C , 5% CO 2). Tanto medio de cultivo que contiene FBS o el medio libre de suero se puede utilizar en este paso.
5. El cultivo de neuronas DRG para adultos para el Análisis de Axon crecimiento
- Para las neuronas transfectadas con plásmidos de ADN, la expresión del gen de interés (por ejemplo, EGFP) se puede observar ya en una hora unos pocos después de la electroporación. Para las neuronas transfectadas con siRNAs, por lo general esperar 3-4 días para permitir que el agotamiento suficiente de las proteínas endógenas. Los cultivos de neuronas se puede, ya sea directamente fijada para el análisis de crecimiento de los axones en el varionos puntos de tiempo (1-4 días después de la electroporación) o re-suspendido y re-chapada para analizar axón rebrote (véase más adelante).
- Para RNAi mediada por la pérdida de la función de los estudios, los cultivos de neuronas puede ser re-suspendido y vuelto a chapar para permitir que los axones de las neuronas a crecer de nuevo, en los que las proteínas específicas ya están agotadas. Para ello, sustituir el medio de cultivo antiguo de los cultivos de neuronas de alta densidad con 1 ml de pre-calentado medio fresco y la pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para 6-10 veces para volver a suspender las neuronas conectados de la placa de cultivo. Debido a que las células no neuronales (por ejemplo, células de Schwann) adjuntar mucho más ajustada a la placa de cultivo de neuronas, las células suspendidas de re-son principalmente las neuronas.
- Transferir las neuronas de re-suspendida en un tubo de microcentrífuga y se tritura suavemente 10-15 veces para volver a disociar los grupos de células en la suspensión de células individuales.
- Placa de re-re-las neuronas disociadas en cubreobjetos recién preparados en el de baja densidad (3000-5000 células / pocillo) y la cultura durante toda la noche (16-24 horas).
6. Fijación, tinción inmuno-, e imágenes de fluorescencia
- Aspirar el medio y añadir un 4% paraformaldehído (PFA) (200 l / pocillo) para fijar las células durante 15-20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavan entonces con 1X PBS durante 3 veces.
- Aspirar el PBS y añadir la solución de bloqueo (1% de albúmina sérica bovina, 0,1% de Triton X-100, y 2,0% de suero normal de cabra en PBS 1X) a las neuronas fijos durante 60 min a temperatura ambiente.
- Para los axones de la etiqueta, las neuronas son inmuno-teñidas con anti-neurofilamentos o anti-anticuerpos βIII tubulina. Para ello, coloque una gota 30μl de la solución de anticuerpo primario (1:1200 dilución de la tubulina-βIII anticuerpos) en una parafina para cada cubreobjetos. Invertir los cubreobjetos y colocarlos en la solución de anticuerpo primario durante 60 min a temperatura ambiente.
- Volver cubreobjetos a la placa de cultivo original y se lava con PBS 1X durante 3 veces.
- Repita el mismo procedimiento para la una secundariatibody.
- Lavar los cubres con agua destilada por 3 veces, y luego montar cubreobjetos sobre portaobjetos de vidrio con la solución de montaje (por ejemplo, prolongar la Antifade Oro).
- Las neuronas teñidas se pueden visualizar con cualquier sistema de microscopía de fluorescencia equipado con una cámara digital. Las longitudes de los axones se miden y analizan con el software de análisis de imágenes.
7. Los resultados representativos
En la ausencia de factores de crecimiento extracelulares agregado, las neuronas DRG adultos por lo general comienzan a crecer los axones de 48 horas después de sembrar primero. Los axones muestran a menudo morfologías ramificados (Figura 1). En contraste, las neuronas de re-chapados empezar a extender axones sólo una hora pocos después de placas, y los axones alargado con mucho menor ramificación (Figura 2). Estos resultados sugieren que la re-chapados neuronas comparten propiedades similares a las de las neuronas lesionadas acondicionado. Al utilizar este enfoque, hemos realizado recientemente la pérdida de-de la función de los estudios para examinar el papel de la regeneración axonal factor de transcripción c-Jun asociada en el crecimiento de los axones de las neuronas adultas DRG in vitro. Los resultados mostraron que la electroporación de un grupo de 4 diferentes siRNAs dirigidos a diferentes regiones de c-Jun (ON-TARGETplus) reduce notablemente los niveles de proteína de c-Jun en adultos neuronas DRG 3 días después de la transfección (Figura 3) 9. Cuando las neuronas se volvieron a plateado y culta el crecimiento durante la noche, los axones de las neuronas desmontables c-Jun se redujo significativamente (control: 348,37 ± 16.21mm; si-c-Jun: 262,32 ± 15,69 micras, Figura 3) 9. Estos resultados indican que las neuronas adultas cultivadas DRG proporciona un modelo útil para estudiar el crecimiento del axón de las neuronas adultas.
Figura 1. Adultos DRG neuronas de ratón cultivadas en baja densidad durante 3 días. Las neuronas fueron teñidas con anti - & bETA, anticuerpos III tubulina. Tenga en cuenta que la mayoría de los axones muestran morfologías ramificados. Barra de escala: 125 m.
Figura 2. Re-chapado del ratón adulto las neuronas DRG después de 3 días de cultivo. (A), las neuronas cultivadas DRG para adultos en alta densidad de 3 días. (B) re-chapada DRG neuronas adultas fueron cultivados a baja densidad para pasar la noche. Tenga en cuenta que la mayoría de los axones muestran morfologías alargadas con poca ramificación del axón. Barra de escala: 250 m en A y 125 micras en B.
Figura 3. El papel de c-Jun en el crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos in vitro. (A) Western blot de c-Jun en el ratón adulto las neuronas DRG después de la electroporación de c-Jun siRNAs. El resultado muestra el nivel notablemente reducido de c-Jun. (B) Control de las neuronas transfectadas con EGFP creció axones largos después de la re-siembra y el cultivo de una noche. (C) Co-transinfección de c-Jun siRNAs y EGFP crecimiento axonal deterioro de los adultos las neuronas DRG después de la re-siembra y el cultivo de una noche. Rojo: Tuj-1 tinción; Verde: EGFP. Barra de escala: 125 m. Estos resultados han sido publicados en Saijilafu et al. 9.
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Discussion
Adultos DRG neuronas regeneren sus axones firmeza después de la lesión del nervio periférico in vivo e in vitro, lo que proporciona un sistema útil para estudiar la regeneración de axones en los animales adultos. El cultivo in vitro de los adultos las neuronas DRG se está convirtiendo en un método ampliamente utilizado para investigar los mecanismos moleculares por los cuales la regeneración del axón está regulado. El procedimiento in vitro de neuronas de cultivo de ratones adultos DRG que aquí se presenta permite el estudio genético rápida y efectiva de crecimiento de los axones regenerativos. El procedimiento de re-suspensión y re-siembra es particularmente útil para los estudios de la pérdida de función, ya que permite volver a crecer los axones de las neuronas en el que ya ha dirigido la proteína agotadas. Además, galvanoplastia de re-neuronas cultivadas DRG imita un efecto in vivo lesión acondicionado, proporcionando así un enfoque más pertinente fisiológica para estudiar la regeneración axonal in vitro.
La eficacia de transfección de los adultos DRG neurons con el enfoque de electroporación descrito es de aproximadamente 20-50% para los plásmidos de ADN en función de los tamaños de las construcciones, lo cual es suficiente para el análisis morfológico de crecimiento axonal. En comparación con la electroporación, la transferencia génica mediada por virus tiene una eficiencia mucho mayor, que es adecuado para el análisis bioquímico utilizando neuronas DRG. Sin embargo, la construcción y la producción de virus para cada gen de interés está consumiendo mucho más mano de obra y tiempo. Para oligos siRNA, la eficacia de transfección puede llegar a casi el 90% sobre la base de la eficiencia de derribo de las proteínas específicas (ver Figura 3a), lo que hace el análisis bioquímico de los adultos las neuronas DRG posibles. Sin embargo, el efecto de siRNAs reduce después de un período más largo debido a la degradación de los oligonucleótidos de siRNA.
Cuando las neuronas son co-transfectadas con plásmidos 2 mezcladas en una proporción de 1:1, el plásmido con un tamaño más pequeño por lo general tiene una mayor eficiencia de la transfección que el plásmido con mayor tamaño. Como aresultado, ajustando la relación de los dos plásmidos se cambia la eficiencia de co-transfección en consecuencia. Para la transfección de siRNA, a menudo co-transfectar las neuronas con EGFP a las neuronas de la etiqueta. Debido a que los oligos siRNA son mucho menores que EGFP, su eficacia de transfección es mucho mayor. Por lo tanto, en nuestros experimentos por lo general pensamos que todas las neuronas EGFP positivas son también positivas para siRNAs.
Muchos estudios de perfiles genéticos de los adultos las neuronas DRG después de axotomía periférica han identificado un gran número de genes asociados a la regeneración (DAR) 10-12, que se cree que la base de la capacidad de regeneración de las neuronas DRG adultos. Sin embargo, las funciones de estos trapos en la mediación de crecimiento de los axones de las neuronas DRG adultos no han sido bien caracterizadas. Aquí hemos examinado el papel de un trapo bien conocido, c-Jun, en la mediación de crecimiento de los axones de las neuronas DRG para adultos a través de RNAi mediada por la pérdida de la función de enfoque. Dicho método proporciona un valioso en herramienta vitro para investigacioneste las funciones de los otros trapos en la regulación de la regeneración de los axones.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH a FZ (R01NS064288) y la Fundación Craig H. Neilsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
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