Summary
Bir
Abstract
Biliyorsunuz, merkezi sinir sistemi (MSS) olgun nöronlar olgun MSS 1,2 olarak akson büyüme ve düşmanca bir ortamı desteklemek için azalmış içsel yeteneği nedeniyle yaralanmalar sonra kendi aksonlar rejenere olamaz bilinmektedir. Bunun aksine, periferal sinir sisteminde olgun nöronlar (PNS) yaralanmalar 3 sonra kolaylıkla yeniden. Yetişkin dorsal kök ganglion (DRG) nöronlar da periferik sinir hasarı sonrası sağlam yeniden bilinmektedir. Çevresel hedefler ve omuriliğe uzanan bir merkezi şube innerve eden periferik dalı: Her DRG nöron hücresi soma gelen, hangi dallar iki akson dalları içine bir akson yetişir. Önemli akson rejenerasyonu DRG periferik aksonlar sonuçları Sakatlık, omurilikte aksonlarda ise yaralanma sonrası kötü rejenere. Periferik aksonal yaralanma omurilik yaralanması (bir süreç klima lezyon olarak adlandırılır), aksonlarda rejenerasyon önce oluşur Ancak, greatl olduğunuy 4 artırıldı. Ayrıca, DRG nöronların aksonlarda omurilikte kortikospinal aksonlar inen aynı düşmanca bir ortamda paylaşabilirsiniz. Birlikte, bu yetişkin DRG nöronların akson rejenerasyonu kontrol moleküler mekanizmalar MSS akson rejenerasyonu arttırmak için boyunduruk edilebilir tahminler yapılmıştır. Sonuç olarak, yetişkin DRG nöronlar artık yaygın rejeneratif akson büyüme 5-7 incelemek için bir model sistemi olarak kullanılmaktadır.
Burada, in vitro olarak akson rejenerasyon genetik çalışma için kullanılabilir yetişkin DRG nöron kültürü için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu model yetişkin DRG nöronların genetik elektroporasyon-aracılı gen transfeksiyon 6,8 ile manipüle edilir. DNA plazmid veya si / shRNA, bu yaklaşım yetişkin DRG nöronlardan gelen akson büyüme herhangi bir gen-of-ilgi rolünü araştırmak için hem kazanç ve kayıp fonksiyon-deneyleri ile sağlayan nöronlar transferiyle. Nöronlar si / shRNA ile transfekte edilmiş olduğunda, hedeflenen endojen proteinidirgenellikle-kaybı fonksiyon testlerinde daha az etkili hale, zaman sağlam akson büyüme zaten ortaya sırasında kültür 3-4 gün sonra tükendi. Bu problemi çözmek için, burada tarif edilen yöntem aksonlardan hedef proteinin yokluğunda nöronlar den yeniden büyümesini sağlar transfeksiyon sonrasında yeniden süspansiyon ve re-kaplama adımı da içerir. Son olarak, yetişkin DRG nöronların 9 akson büyüme aracı bir akson rejenerasyonu ile ilişkili gen, c-Jun, rolünü incelemek için in vitro model bu kullanarak bir örnek sağlar.
Protocol
1. Lameller, Kültür, Orta ve Sindirim Enzimler hazırlanması
- 12-mm yuvarlak # 1 bardak lamelleri nöron kültürü için kullanılır. % 10 HCL gecede 3 kez (20 dakika / saat) distile ve deiyonize su ile ultrasonik yıkama takip ile lamelleri temizlenir. Temizlenmiş lamelleri gelecekteki kullanım için% 70'lik etanol içinde depolanır. Her bir deney başlamadan önce, lamelleri hava kültürü plakası içine kurutuldu ve yerleştirilir.
- Kaplanmasına katkıda kurutulmuş lamelleri, 100 ug / ml Poly-D-Lizin ve 10 ug / ml Laminin çalışma çözeltisi içeren kaplama solüsyonu 100 ul her bir coverslip üzerine eklenir ve kültürü plakası, bir 37 ° C inkübatöründe aktarılır. 1-2 saat sonra, kaplama solüsyonu kaldırılır ve lamelleri steril 1X PBS ile 3 defa yıkanır.
- Kültür ortamı, Asgari Temel Orta (MEM) hazırlamak için% 5 fetal sığır serumu (FBS), 1X Penisilin-Streptomisin solüsyonu (penisilin 500 adet ile güçleniyorLin ve streptomisin 500 mg), 1X GlutaMAX-I takviyesi ve antimitotic reaktifleri ihtiva eden 20 uM 5-floro-2-deoksipsödoüridin ve 20 uM üridin (FDU / R). Serum içermeyen aracı için, FBS takviyesi B27 ile değiştirilir.
- Kollajenaz bir çözeltisi, 1 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda çalışma yapmak kollajenaz MEM ile bir toz çözülmesiyle hazırlanmıştır. Tripsin için, 1X TrypLE Hızlı kullanılır.
2. Yetişkin Fare DRG Nöronlar diseksiyonu ve Hasat
- 6 euthanizing sonra - 10 hafta eski yetişkin fare, dorsal deri kaldırmak ve tüm belkemiğine kesti. 1 X PBS 2-3 kez kaldırıldı omurga yıkayın.
- Ventral yüzü yukarı ile diseksiyon plakasına kaldırıldı omurga Pin ve dikkatli bir diseksiyon mikroskobu altında duyu sinirleri açığa kasları kaldırır. Kereste seviyesinde DRG'ler bağlı sinirler bulmak için kalın ve kolaydır. Bu nedenle, çoğu deneyler için lomber sadeceDRG'ler hasat edilir.
- Küçük bir makas ile merkez boyunca her omur boyunca kesin ve dikkatle intervertebral diskleri kaldırın. Omurilik maruz Her omur bölmek forseps kullanma.
- Kereste DRG'ler dışarı incelemek için, forseps ile her kereste sinir yukarı kaldırın ve ilgili DRG'ler lomber (L1 L6 için) bulmak için omuriliğe doğru iz.
- Bağlı periferik sinir, yay makas ile dorsal ve ventral kökleri her DRG kesti ve buz üzerine yerleştirilir MEM orta mikrofuge'de tüp içinde saklayın. Farklı spinal düzeyleri (örneğin göğüs DRG) daha DRG'ler benzer bir şekilde, gerektiğinde dışarı disseke edilebilir.
3. Sindirim ve Erişkin Fare DRG Nöronlar arasında Ayrılma
- Tüm parçalara DRG'ler toplanmasından sonra, 1 ml kollajenaz bir çözeltisi ile MEM ortam değiştirmek ve 90 dakika süreyle 37 ° C'de inkübe edilir mikrofuj tüpü.
- Böylece 500 ul 1X TrypLE Express ile kollajenaz bir çözüm değiştirin37 Direkt Ekspres ve inkübe ° C'de 15-20 dk.
- TrypLE Express çözümü çıkarın ve 3 kez 1 ml hazırlanmış besiyeri (% 5 FBS içeren) ile DRG'ler yıkayın.
- 600 ul kültür ortamı ekleyin ve hafifçe 1 ml mavi kullanarak 20-30 kez dokulara öğütmek için yukarı veya aşağı pipetleme ve pipet mezun oldu.
- Triturasyonun sonra, non-disosiye dokuların mikrofuge'de altına yerleşir ve 10 ml steril tüpe hücre süspansiyonu aktarılmasına olanak tanıyor. Başka bir 600 ul kültür ortamı ekleyin ve en dokular ayrışmış kadar triturasyonun adımı tekrarlayın. Elde edilen hücre süspansiyonu nöronları ve non-nöronal hücrelerde hem de içerir. Çoğu durumda, 6 DRG'ler (~ 5 x10 4) gelen hücreleri bir elektroporasyon reaksiyon için kullanılır.
4. Elektroporasyon ile Nöronlar Genetik Manipülasyon
- DNA plazmidleri (~ 10 ug ile birlikte fare nöronlar için Amaxa nucleofection solüsyonu karıştırılarak transfeksiyon çözeltisi hazırlayın) Veya siRNA oligos (~ 0.2 nmol), her transfeksiyon için 100 ul son hacim yapmak.
- Oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 680 rpm'de santrifüje ayrışmış hücreleri ve mümkün olduğunca süpernatan atılır. Hazırlanan transfeksiyon çözüm ekleyin ve yavaşça yeniden askıya hücrelere 200 ul pipet uçları ile 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ve.
- Elektroporasyon küvetine transfeksiyon çözeltisi ile karıştırılır hücre süspansiyonu transferi ve Amaxa Nucleofector sistemi program G-013 kullanılarak hücrelerin electroporate.
- Elektroporasyon hemen sonra, önceden ısıtılmış 500 ul ekleyin (37 ° C) küvet ve istenilen hücre yoğunluklarında kaplı kültür plaka içine tüm çözüm (~ 600 ul) aktarmak için FBS içeren kültür ortamı. Yeniden süspansiyon ve yeniden kaplanması gerektirir deney için, nöronlar, yüksek yoğunluklu (10.000-20.000 hücre / çukur) azından plastik çanak kültürü üzerinde doğrudan kültürlenmiştir. Doğrudan akson büyüme inceliyor deney için, nöronlar kaplama ont vardırdüşük yoğunluklu (3000-5000 hücre / kuyu) az kaplı cam lamelleri o. Kuluçka (37 ° C'de,% 5 CO2) içine kültürü plakası yerleştirin.
- Nöronlar yüzeye bağlı olan zaman kaplama sonra dört saat, yavaşça 500 ul taze ve önceden ısıtılmış kültür ortamı ile kültür ortamı (Amaxa nucleofection çözüm içerir) yerine ve (37 ° C ilave kültürü için inkübatöre plaka dönmek ,% 5) 2 CO. FBS içeren hem kültür ortamı veya serum içermeyen aracı madde, bu aşamada kullanılır.
5.. Axon Büyüme Analizi için Kültürleme Yetişkin DRG Nöronlar
- DNA plazmid ile transfekte nöronlar için, gen-of-ilgi ifadesi (örneğin EGFP) elektroporasyon sonra bir kaç saat gibi erken görülebilir. SiRNA'lar ile transfekte nöronlar için, genellikle endojen proteinlerin yeterli tükenmesine izin vermek için 3-4 gün bekleyin. Kültüre nöronlar ya doğrudan vario az akson büyüme analizi için sabit olabilirbize zaman noktaları (1-4 gün elektroporasyon sonra) veya yeniden kapanmıştır ve akson büyütme (bkz. aşağıda) analiz etmek için yeniden kaplanmıştır.
- RNAi aracılı-kaybı fonksiyon çalışmaları için, kültürlü nöronlar yeniden askıya alınabilir ve aksonları hedef proteinleri zaten tükenmiş olan nöronlar, gelen regrow izin vermek için yeniden kaplanmıştır. Bunu yapmak için, kültür plakasından ekli nöronlar yeniden askıya 6-10 kez 1 ml önceden ısıtılmış taze orta ve pipet yavaşça yukarı ve aşağı ile yüksek yoğunluklu kültürlü nöron eski kültür ortamı değiştirin. Nöronal olmayan hücrelerde (örneğin Schwann hücreleri) nöronlar daha kültürü çanak çok daha sıkı bağlamak için, yeniden askıda hücreler çoğunlukla nöron vardır.
- Bir mikrofuge'de tüpüne yeniden askıda nöronlar aktarın ve yavaşça tek hücre süspansiyonu haline hücre kümelerinin yeniden ayırmak için 10-15 kez çiğnemek.
- Düşük yoğunluklu (3000-5000 hücre / kuyu) ve kültür gece boyunca yeni hazırlanmış lamelleri üzerine Re-plaka yeniden disosiye nöronlar (16-24 saat).
6. Fiksasyon, Immuno-boyama ve Floresans Görüntüleme
- Ortamı aspire ve oda sıcaklığında 15-20 dakika için hücreler sabitlemek için% 4 paraformaldehid (PFA) (de 200 ul /) ilave edilir. Sabit hücreleri daha sonra 3 defa PBS ile yıkandı, 1X edilir.
- PBS aspire ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sabit bir nöronlara engelleme çözeltisi (% 1 sığır serum albümin,% 0.1 Triton X-100 ve 1X PBS içinde% 2.0 normal keçi serumu) ilave edilir.
- Etiket aksonlardan için, nöronlar anti-nörofilament veya anti-βIII tübülin antikoru ile immüno-lekeli vardır. Bunu yapmak için, her coverslip için bir parafilm birincil antikor çözeltisi (-βIII tubulin antikoru için 1:1200 dilüsyon) bir 30μl damla yerleştirin. Lamelleri tersine ve oda sıcaklığında 60 dakika için primer antikor çözeltisi üzerine yerleştirmek.
- Özgün kültür plakasına lamelleri dönün ve 3 kez 1X PBS ile yıkayın.
- Ikincil bir için aynı işlemi tekrarlayıntibody.
- 3 kez distile su ile lamelleri yıkayın, sonra montaj çözümü (örneğin Altın Antifade Prolong) ile cam lamlara lamelleri monte edin.
- Lekeli nöronlar bir dijital kamera ile donatılmış herhangi bir floresan mikroskobu sistemi ile görüntülenebilir. Akson uzunlukları ölçülür ve görüntü analiz yazılımı ile analiz edilmiştir.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Herhangi bir katma ekstrasellüler büyüme faktörlerinin yokluğunda, yetişkin DRG nöronların genellikle ilk Kaplama sonrası akson 48 saat büyümeye başlar. Aksonlar sık dallı morfolojilere (Şekil 1) göstermektedir. Buna karşılık, yeniden kaplama nöronlar Kaplama sonrası akson sadece bir kaç saat uzatmak başlatın ve aksonlar çok azaldı dallanma (Şekil 2) ile uzatıyoruz. Bu sonuçlar, yeniden kaplama nöronlar conditioning lezyonlanan nöronların benzer özellikleri paylaşan olduğunu düşündürmektedir. Bu yaklaşımı kullanarak, son zamanlarda gerçekleştirdik kaybı-fonksiyon-vitro çalışmalarda erişkin DRG nöronlardan gelen akson büyüme akson rejenerasyonu ilişkili transkripsiyon faktörü c-Jun rolünü incelemek için. Sonuçlar, c-Jun farklı bölgelerinde (ON-TARGETplus) hedefleme 4 siRNA'lar farklı bir grup olduğu elektroporasyon belirgin şekilde (Şekil 3) 3 gün sonra, transfeksiyon yetişkin DRG nöronlarında 9 c-Jun ve protein seviyeleri azaltılmış gösterdi. 9:;: c-Jun Knockdown nöronlardan gelen nöronlar yeniden kaplama ve kültürlü idi gecede, akson büyüme önemli ölçüde (262,32 ± 15.69 mikron, Şekil 3 si-c-Jun 348,37 ± 16.21mm Kontrolü) azalmıştır. Bu sonuçlar kültürlü yetişkin DRG nöronların yetişkin nöronlardan gelen akson büyüme çalışmak için yararlı bir model sistem sağlamak göstermektedir.
Şekil 1. Yetişkin fare DRG nöronlar 3 gün için düşük yoğunluklu kültüre. Nöronlar anti boyandı - & beta; III tubulin antikor. En aksonlar dallı morfolojileri göstermek unutmayın. Ölçek çubuğu: 125 mikron.
Şekil 2. Kültür 3 gün sonra nöronlar DRG Yeniden kaplama yetişkin fare. (A) Yetişkin DRG nöronlar 3 gün boyunca yüksek yoğunlukta kültüre. (B) Yeniden kaplama yetişkin DRG nöronlar gece boyunca düşük yoğunluklu kültüre edildi. Çoğu akson biraz akson dallanma ile uzamış morfolojileri göstermektedir unutmayın. Ölçek çubuğu: B. A ve 125 mikron 250 mikron
Şekil 3. In vitro yetişkin DRG nöronlardan gelen akson büyüme c-Jun Rolü. C-Jun siRNA'lar bir elektroporasyon sonra nöronlar DRG yetişkin fare c-Jun (A) Western Blot analizi. Sonuç c-Jun belirgin olarak azalır seviyesini gösterir. (B) EGFP ile transfekte Kontrol nöronlar yeniden kaplama ve gece kültürden sonra uzun aksonlar büyüdü. (C) Co-transc-Jun siRNA'lar ve yeniden kaplama ve geceleme kültürden sonra yetişkin DRG nöronlardan EGFP bozulmuş akson büyüme memnuniyetsizliktir. Kırmızı: Tuj-1 boyanmasının; Yeşil: EGFP. Ölçek çubuğu: 125 mikron. Bu sonuçlar, Saijilafu ark yayınlanmıştır. 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yetişkin DRG nöronlar böylece yetişkin hayvanlarda akson rejenerasyonu incelemek için yararlı bir sistem sağlayarak, sağlam in vivo ve in vitro periferik sinir hasarı sonrası kendi aksonlar rejenere. Yetişkin DRG nöronların in vitro kültüründe moleküler mekanizmaları araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir yöntem haline geliyor hangi akson rejenerasyonu düzenlenir. Kültür yetişkin fare DRG nöronların in vitro prosedürü burada rejeneratif akson büyüme hızlı ve etkin bir genetik çalışma sağlar sundu. Bu aksonlardan hedef proteinin zaten tükendikten hangi nöronların den yeniden büyümesini sağlar, çünkü tekrar tekrar süspansiyon ve kaplama işlemi-kaybı fonksiyon çalışmaları için özellikle yararlıdır. Ayrıca, yeniden kaplama kültürlü DRG nöron böylece in vitro akson rejenerasyonu çalışmak için daha fizyolojik alakalı bir yaklaşım sağlayarak, in vivo klima lezyon etkisi bir taklit eder.
Yetişkin DRG n transfeksiyon verimtarif elektroporasyon yaklaşımı ile eurons akson büyüme morfolojik analizi için yeterli yapıları, boyutlarına bağlı olarak DNA plazmidlerin yaklaşık% 20-50 olduğunu. Elektroporasyon ile karşılaştırıldığında, viral-aracılı gen aktarımı DRG nöronlar kullanılarak biyokimyasal analizi için uygun olan çok daha yüksek verim, sahiptir. Ancak, inşa ve her gen-of-ilgi için virüs üreten çok daha emek yoğun ve zaman alıcıdır. SiRNA oligos için transfeksiyon verimliliği mümkün olan yetişkin DRG nöronların biyokimyasal analizler yapar hedeflenen proteinleri (Şekil 3A bakınız), aşağı vurma verimliliğine dayalı olarak yaklaşık% 90 ulaşabilirsiniz. Ancak, siRNA'lar etkisi siRNA oligos bozulması nedeniyle uzun süre sonra azalır.
Nöronlar 1:01 oranında karıştırılmasıdır 2 plazmid ile birlikte transfekte edilmiş olduğunda, daha küçük boyutu ile plazmit, genellikle daha büyük bir boyutta plazmid göre daha yüksek verim transfeksiyon sahiptir. Ar gibiesult, iki plazmit olan oranı ayarlanması buna göre eş-transfeksiyon verim değişecektir. SiRNA transfeksiyon için, sık sık etiket nöronlara EGFP ile nöronlar birlikte transfekte. SiRNA oligos EGFP çok daha küçük oldukları için, bunların transfeksiyon verimliliği çok daha yüksektir. Bu nedenle, bizim deneylerde genellikle tüm EGFP pozitif nöron da siRNA'lar için olumlu olduğunu düşünüyorum.
Periferal aksotomi sonra yetişkin DRG nöronların birçok genetik profil çalışmaları yetişkin DRG nöronların rejenerasyon yeteneği altında yatan inanılmaktadır rejenerasyon ilişkili genler, çok sayıda (bezler) 10-12, tanımlamışlardır. Ancak, yetişkin DRG nöronların akson büyüme aracılık bu paçavra fonksiyonları iyi karakterize edilememiştir. Burada RNAi-aracılı-kaybı fonksiyonu yolla yetişkin DRG nöronlarla akson büyüme aracı olarak, bilinen bir RAG, c-Jun rolü incelenmiştir. Bu yöntemi araştırılmak in vitro aracı değerli bir sağlarte akson rejenerasyonu düzenlenmesinde diğer paçavra rolleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH (R01NS064288) ve Craig H. Neilsen Vakfı FZ hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 11090-081 | |
| Poly-D-Lysine hydrobromide | Sigma -Aldrich | P6407 | |
| Laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| 5-fluoro-2-deoxyuridine | Sigma -Aldrich | F0503 | |
| Uridine | Sigma -Aldrich | U3003 | |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604-013 | |
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-098 | |
| Penicillin-streptomycin (100X) | Invitrogen | 15140-122 | |
| GlutaMAX-I (100X) | Invitrogen | 35050-038 | |
| Glass coverslips (#1) | Electron Microscopy sciences | 72196-12 | |
| 24 well cell culture plate | Becton Dickinson | 35-3047 | |
| 1X PBS | Mediatech | 21-040-CV | |
| Sterile, distilled and deionized water | Mediatech | 25-055-CV | |
| Nucleofector and electroporation Kits for Mouse Neurons | Lonza | VPG-1001 | |
| ON-TARGETplus siRNA against c-Jun | Dharmacon | L-043776 | |
| Anti--βIII tubulin antibody (Tuj-1) | Covance | MMS-435P | |
| ProLong Gold Antifade mounting solution | Invitrogen | P36930 |
References
- Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7, 617-627 (2006).
- Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. Neuronal Intrinsic Mechanisms of Axon Regeneration. Annu. Rev. Neurosci. , (2010).
- Zhou, F. Q., Snider, W. D. Intracellular control of developmental and regenerative axon growth. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1575-1592 (2006).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23, 83-91 (1999).
- Liu, R. Y., Snider, W. D. Different signaling pathways mediate regenerative versus developmental sensory axon growth. J. Neurosci. 21, RC164 (2001).
- Zhou, F. Q. Neurotrophins support regenerative axon assembly over CSPGs by an ECM-integrin-independent mechanism. J. Cell Sci. 119, 2787-2796 (2006).
- Zou, H., Ho, C., Wong, K., Tessier-Lavigne, M. Axotomy-induced Smad1 activation promotes axonal growth in adult sensory neurons. J. Neurosci. 29, 7116-7123 (2009).
- Zhou, F. Q., Zhou, J., Dedhar, S., Wu, Y. H., Snider, W. D. NGF-induced axon growth is mediated by localized inactivation of GSK-3beta and functions of the microtubule plus end binding protein APC. Neuron. 42, 897-912 (2004).
- Saijilafu,, Hur, E. M., Zhou, F. Q. Genetic dissection of axon regeneration via in vivo electroporation of adult mouse sensory neurons. Nat. Commun. 2, 543-54 (2011).
- Costigan, M. Replicate high-density rat genome oligonucleotide microarrays reveal hundreds of regulated genes in the dorsal root ganglion after peripheral nerve injury. BMC Neurosci. 3, 16 (2002).
- Xiao, H. S. Identification of gene expression profile of dorsal root ganglion in the rat peripheral axotomy model of neuropathic pain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 8360-8365 (2002).
- Michaelevski, I. Signaling to transcription networks in the neuronal retrograde injury response. Sci. Signal. 3, ra53 (2010).
