Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Microdialysis من الإيثانول خلال فعال الإيثانول الإدارة الذاتية والايثانول تقرير بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

وهناك طريقة لتحديد مسار الوقت للتركيز الإيثانول في أدمغة الفئران من خلال الإيثانول فعال يوصف الإدارة الذاتية. يتم استخدام اللوني للغاز مع الكشف عن تأين اللهب لتحديد الايثانول في عينات ديالة، لأنه لديه حساسية المطلوبة لكميات صغيرة التي يتم إنشاؤها.

Abstract

ويشيع استخدام فعال أساليب الإدارة الذاتية لدراسة التأثيرات السلوكية والدوائية العديد من الأدوية من سوء المعاملة، بما في ذلك الإيثانول. ومع ذلك، الإيثانول هو عادة الذاتي عن طريق الفم، بدلا من الوريد مثل أدوية أخرى عديدة من سوء المعاملة. الدوائية من الأدوية عن طريق الفم هي أكثر تعقيدا من المخدرات تدار عن طريق الوريد. لأن فهم العلاقة بين التأثيرات الدوائية والسلوكية من الإيثانول يتطلب معرفة مسار الوقت من الإيثانول الوصول إلى المخ أثناء وبعد الشرب، ونحن نستخدم في الجسم الحي وmicrodialysis اللوني للغاز مع الكشف عن تأين اللهب لرصد تركيزات الإيثانول ديالة الدماغ مع مرور الوقت.

الجمع بين microdialysis السلوكي التجارب تنطوي على استخدام العديد من التقنيات. في هذه المقالة، والجراحة التجسيمي والتدريب السلوكي وmicrodialysis، والتي يمكن تكييفها لاختبار عدد كبير من الإدارة الذاتية وNEUيتم تضمين rochemical تركز الفرضيات، فقط لتوضيح الكيفية التي تتصل المراحل اللاحقة من جمع العينات والتحليل ديالة الايثانول. يوصف ديالة الإيثانول التحليل اللوني للغاز عبر التركيز مع التأين كشف اللهب، والتي هي محددة لدراسات الإيثانول، بالتفصيل. البيانات التي تنتجها هذه الأساليب تكشف عن نمط من الإيثانول الوصول إلى المخ أثناء إجراء الإدارة الذاتية، وعندما يقترن مع تحليل العينات الكيميائية العصبية من ديالة نفسه، يسمح لتكون الاستنتاجات بشأن الآثار الدوائية والسلوكية من الايثانول.

Protocol

1. التجسيمي جراحة

  1. اتبع جميع الإجراءات دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
  2. باستخدام جهاز التجسيمي، جيدا التعامل مع لونغ إيفانس الفئران، مع تخدير isoflurane، وزرع مع قنية 21-مقياس (لإدراجه في وقت لاحق التحقيق microdilaysis) (بلاستيك واحد، رونوك، VA) فوق منطقة في الدماغ من الفائدة، والحبل على بنيت في المرحلة الترباس الرأس (المعدات المستخدمة لدعم microdialysis).
  3. رصد الفئران بعناية أثناء وبعد الجراحة. تأكد من أن جميع الحيوانات تتلقى ما لا يقل عن أسبوع واحد من بعد الجراحة والإنعاش والعناية في صحة جيدة قبل البدء في الإجراءات التالية. A إن الرب فيديو للأسلوب الجراحة التجسيمي متاح .. 1

2. فعال التدريب

  1. بعد أسبوع من الانتعاش بعد الجراحة، ويتم تدريب الحيوانات إلى الصحافة رافعة للمحلول السكروز 10٪ن في غرفة المنتسبين ميد فعال (MedAssociates، وشركة، فيرمونت، الولايات المتحدة الأمريكية) تجهيزه مع lickometer، رافعة قابل للسحب، وأنبوب sipper (كما هو موضح سابقا في هاوارد وآخرون، 2009). يستخدم من 2 البرمجيات لتصميم جميع MedAssociates برامج فعال (MedAssociates، وشركة، فيرمونت، الولايات المتحدة الأمريكية).
  2. تدريب مرة واحدة للرد على السكروز، تبدأ الفئران على جدول التدريب المناسب خلالها يتم إضافة تدريجيا في المحلول الإيثانول على دورات متعددة الشرب.
  3. على سبيل المثال، يستخدم المختبر حاليا الجدول الزمني للتدريب يوم 8-حيث تلاشى الإيثانول في حل بلغت ذروتها في الايثانول 10٪ / 10٪ محلول السكروز الشرب. الحيوانات لا يحصلون إلا على السيطرة السكروز 10٪ أو أي حل للشرب. يمكن للنوع معين من جدول فعال لاستخدامها تختلف اختلافا كبيرا، ولكن لا يزال من الإجراءات العامة المبينة أدناه لأخذ العينات microdialysis تنفيذها .. 3

3. قبل microdialysis الإجراءات: الربط

في الليلة التي سبقت الثاني لدورة تدريبية الأخيرة (في مثالنا هذا هو دورة تدريبية ال 7)، واعتادوا على الحيوانات ربيع الحبل، والتي تعلقها على حبل الترباس على خشبة المسرح رؤوسهم. ربيع يعلقها على قطب microdialysis ومكافحة ذراع الرافعة التوازن، التي علقت بجانب القفص مع موقف رنين والمشابك ذلك أن الحيوان يمكن ان تتحرك بحرية داخل قفصه. الحيوانات المربوطة قضاء الليل في غرفة فعال، في قفص وطنهم مع الطعام والماء libitum الإعلانية، إلى روض لهم إلى الربط انشاء.
  • في اليوم التالي، والفئران اكتمال برنامجها فعال مع الحبل في المكان، إلى روض الحيوان لشعور من حبل أثناء أداء مهامها السلوكية. تحميل جهاز الربط على جدار غرفة فعال بالقرب من أعلى للسماح للتعليق حبل ودوار فوق وسط سقف الغرفة فعال. يتم وضع كل ذلك داخل غرفة الصوت المخففة. بعد عملية الشراء؟ص الدورة، والعودة إلى قفص الفئران وطنه في غرفة فعال في انتظار microdiaysis الإدراج التحقيق.
  • 4. قبل microdialysis الإجراءات: يتم إدراج التحقيق microdialysis قبل يوم من التجربة microdialysis، بعد اكتمال التدريب الفئران السلوكية لهذا اليوم

    1. قبل يوم من التجربة microdialysis، بعد اكتمال الفئران جلسة فعال في حين المربوطة، تخدير الفئران مع isoflurane وإزالة المسدة من قنية دليل. ببطء (أكثر من 5 دقائق ~) إدراج التحقيق microdialysis، perfused مع السائل الدماغي الشوكي الاصطناعي (ACSF)، من خلال قنية دليل الجمجمة في منطقة الدماغ من الفائدة. نستخدم المختبرات التي شيدت تحقيقات والإجراءات microdialysis على غرار Doyon وآخرون، 2003، وبيتيت والعدالة، 1991. 3، 4
    2. استخدام أجهزة الربط نوقشت سابقا بتعليق مدخل ومخرج خطوط التحقيق أعلاه الحيوان.
    3. تحويل عرداء معدل التدفق أسفل إلى 0.2 ميكرولتر / دقيقة. مرة أخرى، وتنفق الفئران ليلا في غرفة فعال.

    5. إجراءات Microdialysis: جمع عينات خلال الإدارة الذاتية جلسة عمل مع مراحل مشهي وconsummatory فصل

    1. على الأقل 2 ساعة قبل التجربة تبدأ، يحضر التحقيق لسعره تدفق العمل. نستخدم إما 1.0 أو 2.0 ميكرولتر / دقيقة اعتمادا على منطقة في الدماغ. تأكد من أن معدل التدفق التحقيق يتسق، وما لا يقل عن 90٪ من معدل تدفق مجموعة باستخدام حقنة هاميلتون لقياس حجم بمرور الوقت.
    2. يتم أخذ عينات غسيل الكلى (5 دقائق أو 7) قبل وأثناء وبعد الدورة فعال. الفاصل الزمني أخذ العينات تعتمد على منطقة الدماغ، ويجري تحليلها العصبي، ديالة تركيز الحليلة، والحساسية للمعدات الكيمياء التحليلية لاستخدامها في التحليل. المراحل السلوكية هي كما يلي:
      1. خط الأساس: في بداية التجربة،جمع عينات غسيل الكلى في قفص المنزل الحيوان (4 عينات).
      2. نقل: بعد جمع عينات من خط الأساس قفص المنزل، ونقل إلى غرفة الفئران فعال. نقل الفئران المربوطة يتطلب الحذر الشديد للتأكد من أن خط نقل السوائل microdialysis لا تصبح متشابكة، وأن الفئران لا تزال هادئة. مباشرة بعد نقل، وتفعيل برنامج فعال كما قمت بتغيير من العينة الأساسية / نقل إلى الانتظار عينة الأولى.
      3. الانتظار: متابعة لجمع العينات والفأر ينتظر ذراع لتمتد إلى غرفة (3-4 عينات اعتمادا على منطقة في الدماغ).
      4. شراب: بعد عرض ذراع والضغط، يتم إجراء زجاجة من محلول الشرب (10٪ إيثانول sucrose/10٪ أو 10٪ سكروز) المتاحة للالفئران لمدة 20 دقيقة (عينات 3-4).
      5. بعد الشراب وبعد الشراب الفترة، وتتراجع زجاجة، ولكن الفئران بقايا طن الدائرة فعال لحوالي 20 دقيقة (عينات 3-4).

    6. إجراءات Microdialysis: إعداد العينة للتحليل الإيثانول microdialysis

    1. عينتين قبل الحيوانات الذاتي إدارة حل الإيثانول، وجميع العينات بعد، يتم تقييم لتركيز الايثانول. ماصة إما قسامة 1 أو 2 ميكرولتر من العينة التي تهم إلى قارورة زجاجية 2 مل. ثم ختم القنينة مع الحاجز الهواء ضيقة (9 ملم الأحمر كاب برغي بولي، PTFE / سيل الحاجز، اجيلنت تكنولوجيز). حجم الإيثانول قسامة تحليل (1 ميكرولتر أو 2) يعتمد على حجم العينة الكلية، وحجم العينة المطلوبة لأي تحليلات إضافية.
    2. إذا كان سيتم استخدام عينات للتحليل الكيميائية العصبية في وقت لاحق، تخزين العينة بشكل مناسب بعد pipetting وقسامة لالكمي الايثانول.
    3. على سبيل المثال، لدينا مختبر يحلل عينات للدوبامين. لإنجاز هذا، ضع العينات في الثلج الجاف أثناء التجربةومن ثم، تخزين العينات في -80 ° C بعد التجربة. نحن استخدام 2 ميكرولتر مأخوذة من الإيثانول لتحليل عينة جمعت 5 دقائق باستخدام معدل تدفق قدره 2.0 ميكرولتر / دقيقة للتحقيقات وضعت في النواة المتكئة. هذا يسمح لا يقل عن 7 ميكرولتر المتبقية لتحليلها لاحقا من قبل الدوبامين عالية الأداء اللوني السائل مع الكشف الكهروكيميائية.
    4. لعينات أخذت من قشرة الفص الجبهي، التي لديها أقل من ذلك بكثير تركيزات الدوبامين خارج الخلية، ونحن استخدام قسامة 1 ميكرولتر الإيثانول لتحليل عينة أخذت من دقيقة 7-باستخدام معدل تدفق 1.0 ميكرولتر / دقيقة.

    7. إجراءات ما بعد microdialysis

    1. بعد انتهاء التجربة microdialysis، تخدير الفئران وإزالة التحقيق. استبدال المسدة إذا لم يتم على الفور الحيوان الموت الرحيم. جمع الدماغ خلال ثلاثة أيام من التجربة. خلاف ذلك، قد تصور من الجهاز التحقيق لا يكون ممكنا.
    2. يجب إزالة الدماغ طن فقا للبروتوكولات المعتمدة استخدام الحيوانات. نستخدم الصوديوم بنتوباربيتال (150 ملغ / كغ، والملكية الفكرية) جرعة زائدة، تليها التروية القلبية مع المالحة ومن ثم الفورمالين في المياه المالحة. الدماغ يغرق في حل الفورمالين الملوحة مدة لا تقل عن 12 ساعة قبل تقطيع.
    3. Coronally قسم الدماغ إلى 100 ميكرومتر شرائح. وصمة عار مع شرائح البنفسجي الكريزيل، ودراسة لوضع مسبار الصحيح. 5 و 6

    8. تحليل العينات لتركيز الايثانول

    1. العينات التي تم جمعها وكذلك معايير خارجية (0،3125 حتي 20 ملم الإيثانول) يتم تشغيلها على الغاز الكروماتوجرافي لدينا مع نظام كشف اللهب التأين. ويتألف هذا النظام من الكروماتوجرافي الغاز CP فاريان 3800 مع كاشف التأين لهب، و(فاريان) بروكر 8400 headspace سعة الاوتوماتيكى تسخينها إلى 50 درجة مئوية، وعمود شعري Innowax HP (30 متر 0،53 مم × 1.0 ميكرومتر سميكة فيلم)، مع الهيليوم والطور المتحرك.
    2. وتسجل Chromatograms وتحليلها مع chromatogrبرنامج aphy مثل برنامج ستار فاريان محطة العمل اللوني التي سيتم مناقشتها على وجه التحديد هنا.
    3. لإعداد نظام لتحليل الإيثانول، تسخين لوحة الاوتوماتيكى باستخدام حمام اعادة توزيع المياه، وفتح دبابتين الغاز إضافية (الهواء والهيدروجين، ويتم تشغيل الهليوم يترك دائما للحفاظ على العمود الشمع).
    4. تسجيل الضغوط خزان الغاز، فضلا عن عدد من العينات كنت تنوي تشغيل بحيث يمكنك إبقاء عدد من عدد المرات التي استخدمت الألياف والحاجز بحيث يمكن تغييرها عند الاقتضاء (الألياف-500 الحقن؛ الحاجز ثقوب -100).
    5. بدء طريقة البدء، التي تستعد لتشغيل نظام العينات (معلمات البرنامج في الجدول 2). انتظر أن يقدم النظام أنه "جاهز".
    6. بدء 20-دقائق "حرق"، والتي تعد الألياف لتحليل العينات من قبل إخضاعه لدرجة حرارة عالية لأنه يلوث تمج أي استوعبت بينما في بقية.
    7. مصنوعة من المعاييرتمييع 238 ميكرولتر من الايثانول 95٪ مع الماء إلى وحدة تخزين النهائي لل100 مل باستخدام القارورة الحجمية في غطاء الدخان الكيميائي. وهذا يخلق حلا الإيثانول 40 مم. نستخدم التخفيف 01:01 مسلسل لخلق 20، 10، 5، 2.5، 1.25، 0.625، 0.3125 ملي المعايير. لكل معيار تركيز، استخدم نفس الحجم قسامة التي ستتخذ من عينات غسيل الكلى. ماصة للقسامة إلى قارورة زجاجية 2 مل، وختم ثم القارورة مع الحاجز وضيق الهواء.
    8. يتم تسخين جميع العينات الإيثانول في الاوتوماتيكى حتى يتم تبخيرها في قسامة السائل بأكمله. نحن تسخين العينات لدينا حوالي 30 دقيقة.
    9. يصف هذا القسم ستار برنامج محطة العمل التي نستخدمها مع الكروماتوجرافي الغاز لدينا. ويمكن استخدام برامج أخرى، ولكن الوصف أدناه قد لا تكون قابلة للتطبيق.
    10. لتشغيل العينات، إنشاء قائمة عينة مشيرا الى العينة التي الاوتوماتيكى فتحة، وعدد المرات التي ينبغي أن ثقب العينة. تأكد من مسار ملفات البيانات إلى أضعاف اخترتهاإيه. ثم، حدد الأسلوب المفضل لالعينات الخاصة بك، والبدء في التشغيل. نستخدم المعلمات تشغيل لوحظ في الجدول 2.
    11. برنامجنا الإيثانول ديالة تمتص العينة لمدة 3 دقائق وdesorbs في مجرى الهيليوم، والتي تغذي العمود الشمع، لمدة 1 دقيقة. ومع ذلك، يمكن كتابة البرامج لتلبية الاحتياجات المحددة الخاصة بك.
    12. مكونات عينة منفصلة في العمود الشمع، ثم انتقل من خلال كاشف اللهب التأين حيث تحتوي على مركبات الكربون، مثل أيونات الإيثانول، تشتعل والافراج عنهم. وهذا يؤدي إلى زيادة تدفق الإلكترونات من القطب الموجب للكشف عن الكاثود إلى خلق تيار، والتي يتم تحويلها إلى الجهد وسجلت مما أدى إلى chromatograms مثل واحد هو مبين أدناه (الشكل 1). التغيير في الجهد يتناسب مع كمية من الكربون من خلال تمرير جهاز كشف عبر time.7
    13. بعد الانتهاء من نظام تشغيل عينات سوف تحتاج إلى التحقق من تكامل كل الذروة. لبرنامج محطة العمل النجوم،انقر على أيقونة الذروة زرقاء في شريط الأدوات. انقر على لون كل الذروة وسحب الأسهم لضبط خط الأساس. إعادة إدماج كل الذروة قبل الانتقال الى المجموعة التالية من قمم. يمكن للبرنامج تحليل الذروة يكون أي برنامج اللوني العامة.
    14. لبرنامج محطة العمل بالنجوم، انقر على أيقونة تقرير الدفعة في شريط الادوات الخاص بك. سحب كل عينة من مجلد المحدد للتقرير دفعة لطباعة التقارير العينة. يمكن تخصيص برامج الإبلاغ الأكثر شيوعا مع أنظمة البرمجيات اللوني.
    15. يمكن أن تكون مبرمج التقارير لإظهار المعلومات التي تختارها. نستخدم حاليا ارتفاع القمة، ولكن يمكن أيضا أن تكون مبرمج تقارير لاستخدام منطقة الذروة.
    16. لإيقاف تشغيل النظام، والشروع في طريقة إيقاف لأسفل (المعلمات لوحظ في الجدول 2)، إيقاف حمام مائي، وإغلاق خزانات الهيدروجين والهواء عندما تكون درجة حرارة الفرن العمود تصل إلى 30 ° C.

    9. الإيثانول البيانات

    1. رسم ارتفاع القمة كماكل وظيفة من المعروف تركيز الإيثانول القياسية الخارجية (الشكل 2A). استخدم الدالة الخطية التي قدمها هذه النقاط لحساب تركيز الإيثانول من ارتفاع القمة التي قدمها كل عينة ديالة.
    2. من التآمر تركيز الإيثانول في ديالة مع مرور الوقت، يمكننا أن نرى النمط لمستويات الإيثانول في المنطقة الدماغ من خلال دورتنا الفائدة السلوكية. يتم تمثيل البيانات سبيل المثال، هو مبين أدناه (الشكل 2B)، وتركيز الإيثانول في ديالة عبر الزمن خلال الدورة الإدارة الذاتية.

    10. الصيانة العامة: يجب أن يتم تغيير الألياف كل ثقوب 500، والحاجز في كل ثقوب 100

    لتغيير الألياف

    1. على القائمة الرئيسية الغاز الكروماتوجرافي الصحافة وسادة، حدد 8400، ودخول الصحافة، واختيار حقنة التغيير، اضغط ENTER. سوف تضع نفسها الاوتوماتيكى للسماح للألياف (SPME الجمعية الألياف، و 75 ميكرومتر من Carboxen-PDMS، Supelco التحليلية، Bellefoالمراد إزالتها لا يجب تجاوزها، PA).
    2. فتح باب تغطي الألياف. فك قفل الجوز، ونقل مزلاج للسماح للجمعية إزالة الألياف. تأخذ الجمعية من الألياف. انفك فك الجوز الذي يحتوي على الألياف في الجمعية، ومن ثم الألياف.
    3. استبدال الألياف القديمة مع واحدة جديدة، وإعادة تجميع الجمعية الألياف. استبدال التجميع في الاوتوماتيكى، وإعادة الإغلاق والشد الجمعية في مكانها. عند الانتهاء، اضغط على "تغيير عمله" على لوحة رئيسية، وسوف الاوتوماتيكى جاهزة للاستخدام في حد ذاته.

    لتغيير الحاجز

    1. أولا، قم بفك غطاء يغطي الحاجز (مرحبا درجة الحرارة 0.450 ضياء. الحاجز مكيفة عام، فاريان) ثم قم بإزالة الحاجز القديم. مقعد جديد الحاجز إلى أسفل داخل المناسب. إعادة الغطاء المسمار وتشديد عليه مع وجع. ثم، استخدم إبرة الحقن لثقب الحاجز بحيث الألياف لن كسر المرة الأولى التي يتم ثقب الحاجز.
    2. 11. ممثل النتائج

      ويظهر الشكل 1 chromatograms سبيل المثال لمدة ثلاثة تركيزات الإيثانول ومعايير لجمع الفئران عينة ديالة في نهاية الدورة الإدارة الذاتية الايثانول. يجب أن تكون القمم الإيثانول متماثل نسبيا، يكون الاحتفاظ مرات متسقة، وإشارة إلى نسبة الضوضاء> 10. عدم تلبية هذه المعايير يعني أن النظام الخاص بك يتطلب الصيانة. اللوني الجودة والمعايير أعدت بشكل صحيح ينتج منحنى خطي القياسية (R2 ≥ 0،99؛ الشكل 2A) التي يتم استخدامها لحساب تركيز الإيثانول من العينات التي تم جمعها من ديالة الإيثانول الذاتي بالإدارة الحيوانات على مدار الدورة الذاتي إدارتها (الشكل 2B) .

      الشكل 1
      الرقم chromatograms مثال 1. تم تحميل واحد ميكروليتر من عينة القياسية الإيثانول أو ديالة إلى ج الغازhromatograph قارورة وتحليلها كما هو موضح في النص. A) تراكب من قمم ولدت من 5.0، 2.5 و 10 ملي معايير الإيثانول. B) ولدت الذروة من عينة ديالة من الفئران التي لديها ذاتيا الايثانول.

      الشكل 2
      الشكل 2. نتائج الرسومية من تجربة المثال هو موضح في الشكل 1. A) منحنى الإيثانول القياسية. B) طبعا وقت تركيز الإيثانول عبر ديالة دورة الإدارة الذاتية الايثانول.

      <TR>
      خردوات المعلمة بدء الإعداد تشغيل الإعداد يستريح الإعداد
      8400 بروكر (فاريان) الاوتوماتيكى
      حقن وضع SPME SPME N / A
      المذيبات اختراق عمق 20٪ N / A
      عينة اختراق عمق 20٪ 20٪ N / A
      امتصاص الوقت 0،01 دقيقة 3 دقائق N / A
      الامتزاز الوقت 19 دقيقة 1 دقيقة N / A
      تنظيف المذيبات وضع المصدر أنا أنا N / A
      نظيفة وضع الامتزاز الامتزاز والوقت 0،01 دقيقة 0،01 دقيقة N / A
      حمام مائي (تسخين الاوتوماتيكى) * 50 ° C 50 ° C بعيدا
      CP-3800 فاريان الغاز كروماتوجرافيا
      حاقن فرن فرن السلطة في في في
      فرن درجة حرارة 250 ° C 220 ° C 30 ° C
      العمود فرن الاستقرار مرة 0،10 دقيقة 0،10 دقيقة 0.10min
      درجة الحرارة 65 ° C 65 ° C 30 ° C
      عمود معدل تدفق المحمول المرحلة 8،5 مل / دقيقة 8،5 مل / دقيقة N / A
      عمود الضغط ~ 6 PSI ~ 6 PSI ≥ 0،1 رطل
      FID الكاشف فرن السلطة في في في
      درجة الحرارة 220 ° C 220 ° C 120 ° C إلكترونيات في في بعيدا
      الوقت مستمر سريع سريع سريع
      نطاق 11 11 11
      Autozero نعم نعم نعم

      الجدول اللوني للغاز 2. مع معلمات اللهب التأين نظام الكشف. هذا الجدول يبين المعلمات للبرامج الثلاثة المستخدمة لإعداد (إعدادات بدء التشغيل)، تشغيل (تشغيل الإعدادات) والمحافظة على النظام أثناء عدم استخدامها (إعدادات يستريح).

    Discussion

    التطبيقات والقيود

    يتم استخدام المخدرات في الإدارة الذاتية القوارض إلى إدمان المخدرات النموذج. يمكن أن تدار العديد من الأدوية التي يتم الاعتداء على هذا النحو على غرار عن طريق الوريد، حيث يتم تسليم المخدرات مباشرة إلى حجرة المركزية. وهذا يسمح للمراقبة عن كثب من جرعة عبر جلسة عمل الإدارة الذاتية. منذ الإيثانول هو عادة شفويا ذاتيا، فمن أصعب بكثير لمراقبة مستويات الدواء بسبب الفروق الفردية في امتصاص والتمثيل الغذائي. باستخدام عينة من microdialysis إلى المنطقة الدماغ من الفائدة، ونحن ليس فقط قادرة على رصد نمط الإيثانول الوصول إلى المنطقة، ولكن نحن أيضا قادرة على رصد التغيرات في وقت واحد عصبي في نفس المنطقة مع مرور الوقت خلال كل مرحلة الإدارة الذاتية.

    ترتبط التغيرات الكيميائية العصبية واستجابات المخدرات التي يسببها في المخ مع تعاطي المخدرات والاعتماد عليها، وبالتالي فإن القدرة على شركة طيران الشرق الأوسط في وقت واحدوتركيزات الكيميائية العصبية متأكد من المخدرات خلال مراحل معينة من الإدارة الذاتية يوفر أداة قوية جدا وفريدة من نوعها. مسألة واحدة أن نأخذ في الاعتبار لربط تركيزات ديالة من analytes مع السلوك هو الخصائص الفيزيائية للالسباكة microdialysis. على وجه التحديد، والوقت الذي يستغرقه للسوائل على أن يتم تحويلها من تجويف التحقيق microdialysis إلى أنبوب جمع أمر بالغ الأهمية، وأقصر الأوقات أفضل. في المختبر لدينا، ونحن بناء تحقيقات بحيث الساعة حوالي 90 ثانية. باستخدام هذه الشروط، وجدنا أن هناك زيادة الدوبامين accumbal في الشروع في استهلاك الإيثانول، مما يقلل على مدى فترات الشراب والشراب آخر، كما يزيد تركيز الإيثانول ديالة. 2،3،8،9 هذه التجارب ، وعندما يقترن البيانات من الدراسات الدوائية، سمحت لنا باستبعاد الآثار الدوائية بدقة من الإيثانول والإدارة الذاتية العظة البيئية المرتبطة على الفصلanges في تركيزات العصبي.

    تجدر الإشارة إلى أن هذا التطبيق هي مناسبة خاصة للتقنيات سلوكية-microdialysis مجتمعة إلى الاهتمامات البحثية الحالية من مختبرنا. وهي مصممة لتقييم نمط الزمني للالإيثانول الوصول إلى المخ بالمقارنة مع نمط التغييرات العصبي في نفس المنطقة، حتى نتمكن من ربط هذه التدابير إلى سلوكيات الإدارة الذاتية متزامن. عدم معالجة الإيثانول ديالة المستمدة تركيزات لتحقيق الانتعاش في الجسم الحي، وفقط جزء صغير من الأنسجة تركيز الدماغ الايثانول. إذا كان مطلوبا microdialysis الكمية من الإيثانول، ينبغي الكسر استخراج الإيثانول من أن ينشر في الفضاء خارج الخلية التحقيق تحديد تجريبيا. انظر المنشورات السابقة من مختبرنا للطرق ومزيد من المناقشة. 10،11،12

    على الرغم من أن هذا البروتوكول يوضح استخدام الغاز CHromatography جنبا إلى جنب مع microextraction الطور الصلب الإيثانول من فراغ الرأس الموجود لعينات microdialysis، يمكن أن تستخدم أساليب أخرى لتحليل مضمون الإيثانول من العينة microdialysis. ومع ذلك، قد طرق بديلة تعاني من بعض العيوب. على سبيل المثال، قد الأساليب التحليلية أقل حساسية تتطلب حجم عينة أكبر وهو الأمر الذي يتطلب أخذ العينات مرات أكبر من 5-7 دقائق يتضح هنا. نوع نظام مناقشتها هنا يستخدم microextraction المرحلة الصلبة التي تركز على الايثانول في مرحلة البخار في قارورة العينة مختومة من خلال السماح لامتصاص الألياف توضع في فراغ الرأس الموجود القارورة. هذا يحسن من حد الكشف مقارنة مع أخذ العينات فراغ الرأس مباشرة والذي يسمح عادة ليتم حقنه 50-100 microliters من بخار. آخر ميزة كبيرة للطريقة فراغ الرأس هو أن عينة للتحليل حقن نظيفة للغاية وخالية من الأملاح. ويمكن أيضا حقن المباشر للعينة السائل microdialysis أن تستخدم مع ارتفاع sensitivity، ولكن هذا سوف يتطلب المزيد من الوقت لأسفل الصك بسبب الصيانة الدورية اللازمة لتنظيف الأملاح حقن.

    حل المشاكل والملاحظات الأخرى

    1. قبل تجربتك تبدأ، تعطي لنفسك متسع من الوقت للتأكد من أن لديك microdialysis مجموعة عمليات تعمل بشكل صحيح وتبادل لاطلاق النار المتاعب أي قضايا. نقترح أن يكون لديك مبلغ إضافي انشاء، perfused مع ACSF، وعلى استعداد للتبديل خارجا مع خلل انشاء لتوفر على نفسك الوقت، ومعظم دورات فعال تميل إلى أن تحدث في وقت محدد كل يوم.
    2. تأكد من أن يتم إدراج تحقيقات microdialysis على مدى فترة من حوالي 5 دقائق للحد من تلف الأنسجة التي تنتجها القص من نسيج والتحقيق تخترق الدماغ.
    3. عند نقل الفئران الى غرفة فعال فإنه من المفيد أن يكون الشخص الثاني بحيث تساعد خط النقل (جزء من مجموعة microdialysis متابعة) لا تصبح متشابكة، وبحيث يمكن الحرف الأول برنامج فعالiated في الوقت المحدد.
    4. تأكد من إعطاء حمام مائي الاوتوماتيكى متسع من الوقت للوصول إلى درجة الحرارة المناسبة. نظامنا عادة ما يتطلب ساعتين لتصل إلى 50 ° C. أيضا، تأكد من أن يتم تبخيرها العينات الخاصة بك بشكل كامل قبل تحليل العينات. ونحن عادة تأكيد بصريا أن هذا قد حدث قبل بدء تحليل العينة.
    5. وينبغي اتباع الممارسات مستوى جيد الكيمياء التحليلية. هذه تشمل، ولكنها لا تقتصر على، والمصادقة من الأفراد والمعدات والإجراءات. وباختصار، نحن توظيف الإرشادات التالية: يجب أن تظهر للمستخدمين الأفراد القدرة على توليد قيم الارتفاع استنساخه الذروة لتركيزات القياسية والمنحنيات القياسية الخطي (R2 ≥ 0.99) عبر عدة أيام. للتحقق من نظام GC-FID يعمل بشكل صحيح، يجب أن يكون دائما معايير يتم تحليلها قبل أن يتم حقن أي عينات ديالة. ينبغي أن منحنى القياسية ولدت لديها R2 ≥ 0،99.
    6. معظم المعدات التي نستخدمهاتم شراؤها من خلال فاريان، وشركة، والتي تم الحصول عليها بواسطة تقنيات اجيلنت في عام 2010. في هذا الوقت، حصلت بروكر الأدوات العلمية فاريان في مختبر الغاز اللوني الأعمال الصكوك. لمشتريات في المستقبل، إما استشارة الشركة.
    7. هذا البروتوكول يظهر السلوك فعال مع الفئران، ولكن المشاهد أن تكون على علم أن أكثر من اضطراب السلوك من المحتمل أن تحدث مع نموذج أصغر الماوس. وثمة مسألة أخرى ليكون على بينة من هو هذا الموضع من تحقيق microdialysis إلى مناطق أخرى من الدماغ من القشرة قبل الجبهية وسطي أو النواة المتكئة قد يعطل السلوك فعال إلى درجة أكبر من المعروضة هنا. من المهم أن تدرس بدقة المعايير السلوكية عديدة لتحديد ما إذا كان الضرر الناتج عن موضع التحقيق ينتج تغيرات شديدة في السلوك.

    Disclosures

    وقد تم تمويل هذه المادة من قبل شركة ميد والشقيقة

    Acknowledgments

    وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح من / NIAAA (AA11852 وAA007471).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
    2. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).
    3. Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).
    4. Pettit, H. O., Justice, J. B. Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens. Brain Res. 539, 94-102 (1991).
    5. Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. Academic Press Inc. (1998).
    6. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press Inc. (1986).
    7. Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis. 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).
    8. Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens. J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).
    9. Carrillo, J., Gonzales, R. A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling. Alcohol. 45, 559-5566 (2011).
    10. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration. Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).
    11. Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain. J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).
    12. Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum. Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).
    Microdialysis من الإيثانول خلال فعال الإيثانول الإدارة الذاتية والايثانول تقرير بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter