Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrodialyse af ethanol under operant ethanol selvforvaltning og ethanol bestemmelse ved gaschromatografi

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

En fremgangsmåde til bestemmelse af tidsforløbet for ethanolkoncentration i hjernen på rotter under operant ethanol selvadministration er beskrevet. Gaskromatografi med flammeioniseringsdetektion anvendes til at kvantificere ethanol i dialysatprøver, fordi den har den følsomhed, der kræves til de små mængder, der genereres.

Abstract

Operant selvadministration metoder er almindeligt anvendt til at undersøge de adfærdsmæssige og farmakologiske virkninger af mange misbrugsmedikamenter, herunder ethanol. Imidlertid ethanol typisk selv administreres oralt i stedet for intravenøst ​​som mange andre misbrugsstoffer. Farmakokinetikken af ​​oralt administreret medicin er mere komplekse end intravenøst ​​administrerede lægemidler. Fordi forstå forholdet mellem de farmakologiske og adfærdsmæssige virkninger af ethanol kræver viden om tidsforløbet af ethanol til hjernen under og efter at have drukket, bruger vi in ​​vivo mikrodialyse og gaskromatografi med flammeioniseringsdetektion at overvåge hjernen dialysat ethanolkoncentrationer over tid.

Kombineret mikrodialyse-adfærdsmæssige eksperimenter indebærer brug af flere teknikker. I denne artikel, stereotaktisk kirurgi, adfærdsmæssige uddannelse og mikrodialyse, som kan tilpasses til at teste et væld af selvforvaltning og neurochemical centreret hypoteser, er kun medtaget for at illustrere, hvordan de relaterer sig til de efterfølgende faser af prøvetagning og dialysat ethanol analyse. Dialysat ethanolkoncentration analyse via gaskromatografi med flamme-ionisering detektion, som er specifik for ethanol undersøgelser, er beskrevet i detaljer. Data produceret ved disse fremgangsmåder viser mønstret af ethanol til hjernen under selv-administration procedure, og når parret med neurokemisk analyse af de samme dialysatprøver, tillader konklusioner der skal foretages i de farmakologiske og adfærdsmæssige virkninger af ethanol.

Protocol

1. Stereotaktisk kirurgi

  1. Alle procedurer følger NIH Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af Institutional Animal Care og Use Udvalg.
  2. Ved hjælp af et stereotaktisk apparat, well-håndteres Long-Evans-rotter, anæsteserede med isofluran, er implanteret med en 21-gauge kanyle (til senere microdilaysis probe insertion) (Plastics One, Roanoke, VA) over hjerne område af interesse og en tether bolt er indbygget i hoved fase (anvendt til at støtte mikrodialyse udstyr).
  3. Overvåg rotter omhyggeligt under og efter operationen. Sørg for, at alle dyr får mindst en uge af post-kirurgisk behandling og nyttiggørelse og er sunde, før du begynder følgende procedurer. En Jové video af stereotaktisk kirurgi metode er til rådighed. 1

2. Operant træning

  1. Efter en uge med post-kirurgisk opsving, dyrene trænes til løftestang presse på for 10% sucrose Solution i et Med Associates operant kammer (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) udstyret med en lickometer, udtrækkeligt håndtag, og sipper røret (som tidligere beskrevet i Howard et al., 2009). 2 Software fra MedAssociates bruges til at designe alle operant programmer (MedAssociates, Inc., Vermont, USA).
  2. Når uddannet til at reagere for saccharose, begynder rotter på en passende træningsskema, hvor ethanol tilsættes gradvist til opløsningen over flere drikke sessioner.
  3. For eksempel øjeblikket vores laboratorium anvender en 8-dages træningsskema hvor ethanol falmet i opløsningen som afsluttes med en 10% ethanol / 10% sucrose drikke opløsning. Kontroldyr modtager kun 10% saccharose eller ikke drikke løsning. Den specifikke type af operant tidsplan, der skal anvendes, kan variere meget, men de generelle fremgangsmåder beskrevet nedenfor for mikrodialyse prøveudtagning kan stadig finde sted. Tre

3. Pre-mikrodialysen Procedure: Tethering

Natten før den næstsidste træning (i vores eksempel er det 7 th træningen) er dyr vant til tether foråret, som tillægger den tether bolt på hovedet scene. Fjederen tillægger mikrodialyse drejelige og counter balance vægtarm, som er ophængt ved siden af ​​buret med en ring stativ og klemmer, så dyret kan bevæge sig frit inden for sit bur. Tøjrede dyr tilbringer natten i operant rum i deres hjem bur med ad libitum mad og vand, for at vænne dem til tøjring set-up.
  • Den følgende dag rotten afslutter sit operant program med tøjret på plads, at vænne dyret til følelsen af ​​linen under udførelsen af ​​sine adfærdsmæssige opgaver. Montere tethering apparat til væggen af ​​operant kammer nær toppen for at tillade suspensionen af ​​tøjret og drejelig over midten af ​​taget af operant kammer. Alt dette er placeret i det lyddæmpende kammer. After den session vende rotten til sit hjem bur i operant plads til at afvente microdiaysis sonde indsættelse.
  • 4. Pre-mikrodialysen Procedure: The mikrodialysesonde indsættes dagen før mikrodialyse forsøget, efter at rotten har afsluttet adfærdstræning for dagen

    1. Dagen før mikrodialyse forsøget, efter at rotten gennemført en operant session, mens tøjret, bedøve rotter med isofluran og fjerner obturatoren fra guide kanyle. Langsomt (over ~ 5 min) indsætte en mikrodialysesonde, perfunderet med kunstig cerebrospinalvæske (ACSF), gennem den kraniale guide kanylen ind i hjernen regionen af ​​interesse. Vi bruger laboratorie-fremstillede sonder og mikrodialysen procedurer modelleret efter Doyon et al., 2003, og Pettit og retfærdighed, 1991. 3, 4
    2. Anvende den tidligere beskrevne tethering apparat til at suspendere indgangs-og udgangslinier af sonden over dyret.
    3. Drej probe strømningshastighed ned til 0,2 gl / min. Igen rotten tilbringer natten i operant rum.

    5. Mikrodialyse Procedure: Indsamling af prøver under selvadministration session med appetitive og consummatory adskilte faser

    1. Mindst 2 timer før forsøget påbegyndes, skru op for sonden til dens arbejde flow. Vi bruger enten 1,0 eller 2,0 ul / min afhængig af hjernen regionen. Kontroller at sonden strømningshastighed er konsistent, og mindst 90% af den indstillede strømningshastighed ved hjælp af en Hamilton-sprøjte til måling af volumen over tid.
    2. Dialyse prøver (5 eller 7 min) er taget før, under og efter operant session. Sampleintervallet afhænger af hjerneregion, der neurotransmitter analyseres, dialysat koncentration af analytten, og følsomheden af ​​analytiske kemi udstyr, der skal anvendes til analysen. De adfærdsmæssige faser er som følger:
      1. Baseline: I begyndelsen af forsøget,indsamle dialyse prøver i dyrets eget bur (4 prøver).
      2. Transfer: Efter opsamling af hjembur baseline prøver, rotten overføre til operant kammer. Overførsel af den bundne rotte kræver ekstrem omhu for at sikre, at mikrodialyse væskeoverførselsmediet linje ikke bliver sammenfiltrede, og at rotten forbliver rolig. Umiddelbart efter overførslen, skal du aktivere operant program som du skifter fra baseline / overførsel prøve til den første ventetid prøven.
      3. Wait: Fortsæt med at indsamle prøver som rotte venter på håndtaget for at strække sig ind i kammeret (3-4 prøver afhængigt af hjerneregion).
      4. Alkohol: Efter armen er præsenteret og trykket, en flaske drikkevand opløsning (10% sucrose/10% ethanol eller 10% saccharose) stilles til rådighed for rotten i omkring 20 minutter (3-4 prøver).
      5. Post-drik: Efter drink periode forbliver flasken trækker, men rotte in den operant kammer for omkring 20 minutter (3-4 prøver).

    6. Mikrodialyse Procedure: Forberedelse af mikrodialyse prøve til ethanol analyse

    1. To prøver før dyrene selv at administrere ethanolopløsningen, og alle prøver efter, evalueres for ethanolkoncentration. Pipette enten 1 eller 2 pi aliquot fra prøven af ​​interesse i et 2 ml hætteglas. Derefter forsegle hætteglasset med en lufttæt skillevæg (9 mm Rød Poly skruelåg, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Volumenet af ethanol analyse aliquot (1 eller 2 ul) afhænger af den samlede prøvevolumen, og prøvevolumenet kræves til yderligere analyser.
    2. Hvis prøverne skal bruges til senere neurokemisk analyse, opbevares prøven passende efter afpipettering portionen for ethanol kvantificering.
    3. For eksempel analyserer vores laboratorium prøverne til dopamin. For at opnå dette ved at placere prøverne på tøris under eksperimentetog derefter opbevare prøverne ved -80 ° C efter forsøget. Vi bruger 2 pi alikvoter for ethanol analyse af en 5 min prøve indsamlet ved anvendelse af en strømningshastighed på 2,0 ul / min for prober placeret i nucleus accumbens. Dette tillader mindst 7 pi tilbage til senere analyse af dopamin ved højtydende væskekromatografi med elektrokemisk detektion.
    4. Til prøver taget fra den præfrontale cortex, som har meget lavere ekstracellulære dopamin-koncentrationer, anvender vi en 1 pi alikvot af ethanol analyse taget fra en 7-min prøve ved anvendelse af en strømningshastighed på 1,0 ul / min.

    7. Post-mikrodialysen procedurer

    1. Efter indgåelse af mikrodialyse eksperiment, anesthetize rotten og fjerne sonden. Udskift obturator, hvis dyret ikke straks aflivet. Saml hjernen inden for tre dage af forsøget. Ellers kan visualisering af sonden tarmkanalen ikke være mulig.
    2. Hjernen bør fjernes in overensstemmelse med godkendte brug af dyr protokoller. Vi anvender natriumpentobarbital (150 mg / kg, ip) overdosering, efterfulgt af kardiel perfusion med saltopløsning og derefter formalin i saltvand. Nedsænkes hjerne i en formalin-saltvandsopløsning i mindst 12 timer før skæring.
    3. Coronally sektion hjernen i 100 um skiver. Farv skiver med cresylviolet, og undersøge for korrekt sonde placering. 5, 6

    8. Analyse af prøver til ethanolkoncentration

    1. De indsamlede prøver samt eksterne standarder (0,3125 til 20 mM ethanol) køres på vores gaskromatograf med flammeioniseringsdetektion system. Dette system består af et Varian CP 3800 gaskromatograf med en flammeioniseringsdetektor, et Bruker (Varian) 8400 headspace autosampler opvarmet til 50 ° C og en HP Innowax kapillarsøjle (30 mx 0,53 mm x 1,0 um film tyk), med helium som mobil fase.
    2. Chromatogrammer registreres og analyseres med Chromatography software som Varian stjerne Chromatography Workstation software, der vil blive specifikt behandlet her.
    3. At forberede systemet for ethanol analyse opvarme autosampleren pladen ved hjælp af et recirkulerende vandbad, og åbne de to yderligere gastanke (luft og hydrogen, helium altid venstre kører at bevare voks kolonne).
    4. Optag den gas tank pres samt antallet af prøver, du har til hensigt at køre, så du kan holde optælling af antallet af gange fiber og septum er blevet brugt, så de kan ændres, når egnede (fiber-500 injektioner, septum -100 punkteringer).
    5. Indled start-up metode, som forbereder systemet til at køre prøver (program parametre i tabel 2). Vent på, at systemet rapportere, at det er "Ready".
    6. Starte en 20-min "brænde", som forbereder fiberen til prøveanalyse ved at underkaste den en høj temperatur til at desorbere enhver forurener det har absorberet under hvile.
    7. Standarder fremstilles vedfortynding 238 pi af 95% ethanol med vand til et slutvolumen på 100 ml under anvendelse af en målekolbe i et stinkskab. Dette skaber en 40 mM ethanolopløsning. Vi anvender en 1:1 seriel fortynding for at skabe 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM standarder. For hver koncentration af standard, skal du bruge den samme mængde prøve, der vil blive taget fra dialyse prøver. Pipetteres portionen til et 2 ml hætteglas, og derefter forsegle hætteglasset med en lufttæt septum.
    8. Alle ethanol Prøverne opvarmes i autosampleren indtil hele væsken aliquot er fordampet. Vi opvarmer vores prøver i ca 30 min.
    9. Dette afsnit beskriver stjerne Workstation-softwaren, som vi bruger med vores gaskromatograf. Andre software kan bruges, men nedenstående beskrivelse ikke kan anvendes.
    10. Hvis du vil køre prøver, oprette en liste med eksempler bemærke hvilken prøve er, hvor autosampleren slot, og hvor mange gange prøven bør punkteret. Vær sikker på at route de datafiler til din valgte foldis. Vælg derefter den foretrukne metode til dine prøver, og starte kørslen. Vi bruger de løbende parametre anført i tabel 2.
    11. Vores dialysat ethanol program absorberer prøven i 3 minutter og desorberer ind i den helium strøm, som føres ind i voks kolonnen, i 1 min. Dog kan programmerne skrives til at imødekomme dine specifikke behov.
    12. Prøvekomponenterne separate i voks kolonnen, og derefter gå igennem flammeioniseringsdetektor, hvor den carbonholdige forbindelser, såsom ethanol, flammer og frigivelse ioner. Dette resulterer i øget elektronstrøm fra detektorens anoden til katoden skaber en strøm, der omdannes til spænding og registreres resulterer i kromatogrammerne som vist nedenfor (figur 1). Ændringen i spænding er proportional med den mængde kulstof, der passerer gennem detektoren tværs time.7
    13. Når systemet er kørt de prøver, du bliver nødt til at kontrollere integrationen af ​​hver top. For stjerne Workstation-softwaren,klikke på den blå top-ikonet i værktøjslinjen. Klik på hver top farve og træk pilene til at justere grundlinjen. Reintegrere hver top før du går videre til næste gruppe af toppe. Den maksimale analyse software kan være en generel kromatografi software.
    14. For stjerne Workstation-softwaren, skal du klikke på batch rapport ikonet i dit værktøj bar. Træk hver prøve fra din angivne mappe til batchen rapport til at udskrive eksempelrapporterne. Rapportering software kan tilpasses med de mest almindelige kromatografi software systemer.
    15. Rapporterne kan programed at vise oplysninger om dit valg. Vi har i øjeblikket bruger tophøjde, men rapporterne kan også programed at bruge toparealet.
    16. At lukke systemet ned, indlede nedlukning metode (parametre anført i tabel 2), skal du slukke vandbad, og luk brint og luft tanke, når kolonneovnen temperatur når 30 ° C.

    9. Ethanol data

    1. Plot tophøjden somen funktion af hver kendt ekstern standard ethanolkoncentration (figur 2A). Brug den lineære funktion givet ved disse punkter til at beregne ethanolkoncentrationen fra tophøjde givet ved hver dialysat prøve.
    2. Ved at plotte koncentrationen af ​​ethanol i dialysatet med tiden, kan vi se det mønster af ethanol i hjernen regionen af ​​interesse under vores adfærdsmæssige session. Eksempel data, der er vist nedenfor (figur 2B), er repræsenteret som den koncentration af ethanol i dialysatet over tid under selvadministration session.

    10. Almindelig rengøring: Fiberen skal skiftes hver 500 punkteringer, og septum hver 100 punkteringer

    Hvis du vil ændre fiber

    1. På gaskromatograf tastatur trykke på Menu, vælge 8400 tryk enter, vælg forandring sprøjte, trykke på enter. Autosampleren vil positionere sig selv til at tillade fiberen (SPME Fiber Assembly, 75 um Carboxen-PDMS, Supelco Analytical, BellefoNTE, PA), der skal fjernes.
    2. Åbne døren dækker fiberen. Skru låsemøtrikken og bevæge låsen for at tillade fibersamling skal fjernes. Tag fibersamling ud. Skru møtrik, der holder fiber i forsamlingen, og derefter skrue fiber.
    3. Udskift den gamle fiber med en ny, og saml fiber forsamling. Sæt samlingen i autosampler, re-låsende og skrue samlingen på plads. Når du er færdig, skal du trykke "ændre done" på tastaturet, og autosampleren vil klar sig selv til brug.

    Hvis du vil ændre septum

    1. Først skrues hætten dækker septum (Hi-Temp 0,450 Dia. Generisk Konditioneret Septa, Varian) og derefter fjerne den gamle septum. Seat den nye skillevæg ned i beslaget. Re-skrue låget og spænd det med nøglen. Derefter anvendes en injektionsnål til at punktere septum, således at fiberen ikke vil bryde den første gang skillevæggen er punkteret.
    2. 11. Repræsentative resultater

      Figur 1 viser eksempler chromatogrammerne for tre koncentrationer af ethanol standarder og for en rotte dialysat udtaget ved afslutningen af ​​ethanol self-administration session. Ethanol toppe bør være forholdsvis ensartede, har konsekvent retentionstider, og et signal-støjforhold> 10. Manglende opfyldelse af disse kriterier betyder, at dit system kræver vedligeholdelse. Kvalitet chromatografi og korrekt fremstillede standarder frembringe en lineær standardkurve (R2 ≥ 0,99 figur 2A), der bruges til at beregne ethanolkoncentration dialysatprøver indsamlet fra ethanol self-administration dyr i løbet af deres selv-administration session (figur 2B) .

      Figur 1
      Fig. 1. Eksempel kromatogrammer. En mikroliter af ethanol standard eller dialysat prøve blev fyldt i en gas chromatograph hætteglas og analyseret som beskrevet i teksten. A) Overlay af toppe genereret fra 2,5, 5,0 og 10 mM ethanol standarder. B) Peak genereret fra en dialysat prøve fra en rotte, der har selvadministreret ethanol.

      Figur 2
      Figur 2. Grafiske resultater fra eksempel eksperiment vist i figur 1.. A) Ethanol standardkurve. B) Tidsforløb af dialysat ethanolkoncentration på tværs af en ethanol self-administration session.

      <tr>
      Hardware Parameter Start-up indstilling Løb indstilling Resting indstilling
      8400 Bruker (Varian) Autosampler
      Injektionsmåden SPME SPME n / a
      Opløsningsmiddel indtrængningsdybde 0% 20% n / a
      Prøve indtrængningsdybde 20% 20% n / a
      Absorptionstid 0,01 min 3 min n / a
      Desorptions 19 min 1 min n / a
      Rens tilstand solvent kilde Jeg Jeg n / a
      Clean-indstilling adsorption og desorption tid 0,01 min 0,01 min n / a
      Vandbad (heat autosampler) * 50 ° C 50 ° C Off
      CP-3800 Varian gaskromatograf
      Indsprøjtningsdyse Oven Oven magt On On On
      Ovntemperatur 250 ° C 220 ° C 30 ° C
      Kolonneovnen Stabiliseringstid 0,10 min 0,10 min 0.10min
      Temperatur 65 ° C 65 ° C 30 ° C
      Kolonne Mobil fase strømningshastighed 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a
      Søjletryk ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi
      FID-detektor Oven magt On On On
      Temperatur 220 ° C 220 ° C 120 ° C Elektronik On On Off
      Tidskonstant Hurtigt Hurtigt Hurtigt
      Range 11 11 11
      Automatisk nulstilling Ja Ja Ja

      Tabel 2. Gaskromatograf med flammeioniseringsdetektion systemparametre. Denne tabel viser de parametre for de tre programmer, der bruges til at forberede (start-up indstillinger), køre (der kører indstillinger) og vedligeholde systemet, mens ikke er i brug (hvilende indstillinger).

    Discussion

    Applikationer og begrænsninger

    Drug selvadministration bruges i gnavere til model stofmisbrug. Mange misbrugsstoffer, der er udformet på denne måde kan administreres intravenøst, ved hvilken lægemidlet indgives direkte til det centrale rum. Dette giver mulighed for en nøje overvågning af dosis over en selvadministration session. Da ethanol er normalt oralt selvadministrerede, er det meget sværere at overvåge lægemiddelniveauer på grund af individuelle forskelle i absorption og metabolisme. Ved at bruge mikrodialyse til prøve fra hjernen område af interesse, er vi ikke kun i stand til at overvåge det mønster af ethanol nå regionen, men vi er også i stand til samtidigt at overvåge neurotransmitter ændringer i den samme region over tid under hver selvadministration fase.

    Neurokemiske ændringer og narkotikaforårsagede reaktioner i hjernen er forbundet med stofmisbrug og afhængighed, og dermed evnen til at samtidigt measikker neurokemiske og stofkoncentrationer i bestemte selvadministration faser giver en meget kraftfuld og unik værktøj. Et spørgsmål at huske på for at korrelere dialysat koncentrationer af analytter med adfærd er de fysiske egenskaber mikrodialyse VVS. Specifikt, den tid det tager for fluidet at blive overført fra lumen mikrodialysesonde til opsamlingsrøret er kritisk, og kortere tider er bedre. I vores laboratorium, konstruere vi proberne således at tiden er ca 90 sekunder. Under anvendelse af disse betingelser, har vi fundet, at der er en accumbal dopamin stigning ved indledningen af ethanol forbrug, der falder i løbet af drikken og efter drink perioder i dialysatet ethanolkoncentration stiger. 2,3,8,9 Disse eksperimenter , når de kombineres med data fra farmakologiske undersøgelser, har tilladt os at frasortere de strengt farmakologiske virkninger af ethanol og selvforvaltning, der er forbundet miljømæssige signaler på chAnges i neurotransmitter koncentrationer.

    Det bør bemærkes, at denne særlige anvendelse af kombinerede adfærds-mikrodialysen teknikker er tilpasset de aktuelle forskningsmæssige interesser i vores laboratorium. Den er designet til at vurdere det tidsmæssige mønster af ethanol til hjernen i forhold til mønsteret af neurotransmitter ændringer i samme region, så vi kan relatere disse foranstaltninger synkrone selvadministration adfærd. De afledte dialysat ethanolkoncentrationer er ikke korrigerede for in vivo probe recovery, og kun en brøkdel af hjernen ethanol vævskoncentration. Hvis kvantitativ mikrodialyse af ethanol kræves skal udvinding fraktion af ethanol, der diffunderer fra det ekstracellulære rum i proben bestemmes eksperimentelt. Se tidligere udgivelser fra vores laboratorium for metoder og yderligere diskussion. 10,11,12

    Skønt denne protokol illustrerer anvendelsen af ​​gas chromatography sammen med fastfase-mikroekstraktion af ethanol fra frirummet i mikrodialysen prøver, kan andre fremgangsmåder til analyse af ethanol indhold af mikrodialyse prøven. Dog kan alternative metoder lider af nogle ulemper. For eksempel kan mindre følsomme analytiske metoder kræver et større prøvevolumen hvilket nødvendiggør prøveudtagning gange større end 5-7 min illustreret her. Hvilket system drøftet her, bruger en fastfase-mikroekstraktion der koncentrerer ethanol i dampfasen i den forseglede hætteglas ved at tillade absorption til fiberen placeret i hætteglasset headspace. Dette forbedrer detektionsgrænsen i forhold til direkte headspace prøveudtagning, som typisk giver 50 til 100 mikroliter af dampen skal injiceres. En anden stor fordel ved headspace metode er, at prøven injiceret til analyse er meget ren og fri for salte. Direkte injektion af den flydende mikrodialyse prøven kan også anvendes med højere SENSITivity, men det vil kræve mere instrument ned tid på grund af regelmæssig vedligeholdelse er nødvendig for at rense ud de injicerede salte.

    Fejlfinding og andre noter

    1. Før dit eksperiment begynder, give dig selv masser af tid til at tjekke, at dine mikrodialysen set-ups fungerer korrekt, og at besvære-skyde eventuelle problemer. Vi foreslår, at du har en ekstra set-up, perfunderet med ACSF, klar til at skifte ud med et dårligt fungerende set-up for at spare tid, da de fleste operant sessioner tendens til at forekomme på et bestemt tidspunkt hver dag.
    2. Vær sikker på, at mikrodialysen prober indsættes over en periode på omkring 5 min for at minimere vævsskade produceret ved forskydning af vævet som proben trænger ind i hjernen.
    3. Ved overførsel rotten ind i operant kammer er det nyttigt at have en anden person hjælpe således at overføringsledningen (del af mikrodialyse set-up) ikke bliver filtret, og således at operant program kan initiated til tiden.
    4. Sørg for at du giver autosampleren vandbad masser af tid til at nå den rette temperatur. Vores system typisk kræver to timer for at nå 50 ° C. Også sikre, at dine prøver er fuldt fordampet før analysen af ​​prøverne. Vi typisk visuelt bekræfte, at dette har fundet sted inden den indleder prøveanalyse.
    5. Standard gode analytiske kemi praksis bør følges. Disse indbefatter, men er ikke begrænset til, validering af personer, udstyr og procedurer. Kort sagt, beskæftiger vi følgende retningslinjer: Individuelle brugere skal demonstrere evnen til at generere reproducerbare tophøjde for standardkedler koncentrationer og lineære standardkurver (R2 ≥ 0,99) over flere dage. Sådan kontrolleres GC-FID systemet fungerer korrekt, bør standarder altid skal analyseres, før der dialysatprøver injiceres. Standard genereret kurve bør have en R2 ≥ 0,99.
    6. Det meste af udstyret vi brugerblev købt gennem Varian, Inc., som blev overtaget af Agilent Technologies i 2010. På dette tidspunkt opnåede Bruker Scientific Instruments Varian laboratorium gaskromatografi instrumenter forretning. For fremtidige køb, rådføre sig med enten selskab.
    7. Den foreliggende protokol viser operant adfærd med rotter, men seeren skal være opmærksom på, at mere forstyrrelse af adfærd kan forventes at forekomme med den mindre musemodel. Et andet problem at være opmærksom på, er, at placeringen af ​​en mikrodialysesonde i hjerneregioner end den mediale prefrontal cortex eller nucleus accumbens kan forstyrre operant adfærd i højere grad end vist her. Det er vigtigt nøje at undersøge en lang række adfærdsmæssige parametre for at afgøre, om skader forårsaget af sonde placering giver alvorlige ændringer i adfærd.

    Disclosures

    Denne artikel blev finansieret af Med Associates, Inc.

    Acknowledgments

    Denne forskning blev støttet af tilskud fra NIH / NIAAA (AA11852 og AA007471).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
    2. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).
    3. Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).
    4. Pettit, H. O., Justice, J. B. Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens. Brain Res. 539, 94-102 (1991).
    5. Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. Academic Press Inc. (1998).
    6. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press Inc. (1986).
    7. Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis. 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).
    8. Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens. J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).
    9. Carrillo, J., Gonzales, R. A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling. Alcohol. 45, 559-5566 (2011).
    10. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration. Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).
    11. Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain. J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).
    12. Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum. Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).
    Mikrodialyse af ethanol under operant ethanol selvforvaltning og ethanol bestemmelse ved gaschromatografi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter