Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Microdialyse d'éthanol au cours de l'éthanol détermination opérant auto-administration et d'éthanol par chromatographie en phase gazeuse

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

Une méthode pour déterminer l'évolution temporelle de la concentration d'éthanol dans le cerveau des rats au cours de l'éthanol opérant auto-administration est décrite. Chromatographie en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme est utilisée pour quantifier l'éthanol dans les échantillons de dialysat, parce qu'il a la sensibilité requise pour les petits volumes qui sont générés.

Abstract

Opérant auto-administration méthodes sont couramment utilisées pour étudier les effets comportementaux et pharmacologiques de nombreux médicaments d'abus, y compris l'éthanol. Cependant, l'éthanol est généralement auto-administré par voie orale plutôt que par voie intraveineuse comme beaucoup d'autres drogues. La pharmacocinétique des médicaments administrés par voie orale sont plus complexes que les médicaments administrés par voie intraveineuse. Parce que la compréhension de la relation entre les effets pharmacologiques et comportementaux de l'éthanol nécessite la connaissance de l'évolution dans le temps de l'éthanol atteint le cerveau pendant et après avoir bu, nous utilisons la microdialyse in vivo et chromatographie en phase gazeuse avec détection par ionisation de flamme pour surveiller les concentrations cérébrales de dialysat éthanol au fil du temps.

Combinés microdialyse-comportementales expériences impliquent l'utilisation de plusieurs techniques. Dans cet article, la chirurgie stéréotaxique, la formation comportementale et microdialyse, qui peut être adapté pour tester une multitude d'auto-administration et neupétrochimique hypothèses centrée, sont inclus uniquement pour illustrer la façon dont ils se rapportent à des phases ultérieures de prélèvement et d'analyse d'éthanol dialysat. Dialysat analyse de la concentration d'éthanol par chromatographie en phase gazeuse avec détection à ionisation de flamme, qui est spécifique aux études d'éthanol, est décrit en détail. Les données produites par ces méthodes révèlent le motif d'éthanol atteint le cerveau au cours de la procédure d'auto-administration, et quand il est associé avec l'analyse neurochimique des échantillons de dialysat mêmes, permet de tirer des conclusions concernant les effets pharmacologiques et comportementaux de l'éthanol.

Protocol

1. Chirurgie stéréotaxique

  1. Toutes les procédures de suivre le Guide du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le soin des animaux et du Comité institutionnel utilisation.
  2. L'utilisation d'un appareil stéréotaxique, bien géré rats Long-Evans, anesthésiés avec de l'isoflurane, sont implantés avec une canule de calibre 21 (pour plus tard microdilaysis sonde d'insertion) (Plastics One, Roanoke, Virginie) au-dessus de la région du cerveau d'intérêt, et une attache boulon est intégré dans l'étape de tête (utilisé pour soutenir l'équipement de microdialyse).
  3. Surveiller attentivement les rats pendant et après la chirurgie. Assurez-vous que tous les animaux reçoivent au moins une semaine de soins post-chirurgicaux et de récupération et sont en bonne santé avant de commencer les procédures suivantes. Une vidéo JoVE de la méthode de chirurgie stéréotaxique est disponible 1.

2. Formation opérant

  1. Après une semaine de récupération post-chirurgicale, les animaux sont formés pour presse à levier pour le saccharose 10% solution dans une chambre Med Associates, opérant (MedAssociates, Inc, le Vermont USA) équipé d'un lickometer, levier escamotable, système d'aspiration et le tube (comme décrit précédemment dans Howard et al., 2009). 2 Logiciel de MedAssociates est utilisé pour concevoir les programmes opérant (MedAssociates, Inc, Vermont, Etats-Unis).
  2. Une fois formés pour répondre au saccharose, commencez rats sur un programme de formation approprié au cours de laquelle l'éthanol est ajouté progressivement à la solution plus beuveries multiples.
  3. Par exemple, notre laboratoire utilise actuellement un programme de formation de 8 jours où l'éthanol est disparu dans la solution aboutissant à un éthanol à 10% / 10% solution buvable saccharose. Les animaux témoins ne reçoivent que 10% de saccharose ou pas de solution buvable. Le type spécifique de calendrier opérant à utiliser peut varier considérablement mais les procédures générales décrites ci-dessous pour l'échantillonnage de microdialyse peut encore être effectuée 3.

3. Pré-microdialyse Procédures: Tethering

La nuit avant la deuxième session de la dernière formation (dans notre exemple, il s'agit de la séance d'entraînement 7 e), les animaux sont habitués à la source d'attache, qui se fixe sur le boulon d'ancrage de leur stade de tête. Le ressort se fixe à la tête d'injection et de microdialyse contre le bras de levier équilibre, qui est suspendu à côté de la cage d'un support annulaire et pinces de telle sorte que l'animal peut se déplacer librement à l'intérieur de sa cage. Animaux captifs passent la nuit dans la salle opérante, dans leur cage avec de la nourriture ad libitum et de l'eau, de les habituer à l'attache set-up.
  • Le lendemain, le rat a terminé son programme opérant avec l'attache en place, pour habituer l'animal à la sensation de l'attache dans l'exercice de ses tâches comportementales. Monter le dispositif d'attache à la paroi de la chambre opérant dans la partie supérieure pour permettre à la suspension de l'attache et pivotant au-dessus du centre de la voûte de la chambre opérant. Tout cela est placé à l'intérieur de la chambre d'insonorisation. After la session, retournez chez le rat dans sa cage à la maison dans la salle opérant dans l'attente insertion de la sonde microdiaysis.
  • 4. Pré-microdialyse Procédures: La sonde de microdialyse est insérée la veille de l'expérience de microdialyse, après le rat a complété une formation comportementale pour la journée

    1. La veille de l'expérience de microdialyse, après le rat a terminé une session opérant tout captif, le rat anesthésié à l'isoflurane et retirez l'obturateur de la canule guide. Lentement (pendant ~ 5 min) insérer une sonde de microdialyse, perfusé avec liquide céphalorachidien artificiel (ACSF), à travers la canule de guidage crânienne dans la région du cerveau d'intérêt. Nous utilisons en laboratoire construits sondes de microdialyse et procédures s'inspirent de Doyon et al., 2003 et Pettit et de la Justice, 1991. 3, 4
    2. Utiliser le dispositif d'attache pour suspendre précédemment l'entrée et de sortie de la sonde au-dessus de l'animal.
    3. Tournez la pagedébit robe jusqu'à 0,2 l / min. Encore une fois, le rat passe la nuit dans la salle opérante.

    5. Procédures de microdialyse: Collection des échantillons au cours de la session d'auto-administration avec des phases de l'appétit et consommatoire séparés

    1. Au moins 2 heures avant l'expérience commence, montez la sonde à son débit de travail. Nous utilisons soit 1,0 ou 2,0 l / min en fonction de la région du cerveau. Vérifiez que le débit de la sonde est cohérente, et au moins 90% du débit réglé à l'aide d'une seringue Hamilton pour mesurer le volume au fil du temps.
    2. Échantillons de dialyse (5 ou 7 min) sont prises avant, pendant et après la session opérant. L'intervalle d'échantillonnage dépend de la région du cerveau, les neurotransmetteurs en cours d'analyse, le dialysat concentration de l'analyte, et la sensibilité du matériel de chimie analytique utilisée pour l'analyse. Les phases de comportement sont les suivants:
      1. Niveau de référence: Au début de l'expérience,prélever des échantillons de dialyse dans la cage de l'animal à la maison (4 échantillons).
      2. Transfert: Après la collecte d'échantillons à domicile cage de base, de transférer le rat à la chambre opérant. Transfert du rat captif nécessite un soin extrême afin de s'assurer que la ligne de transfert de microdialyse fluide ne devient pas emmêlés et que le rat reste calme. Immédiatement après le transfert, activer le programme que vous changez opérant à partir de l'échantillon de référence / transfert à l'échantillon d'attente premier.
      3. Attendre: Continuer de recueillir des échantillons comme le rat attend le levier d'étendre dans la chambre (échantillons 3-4 en fonction de la région du cerveau).
      4. Boire: Après le levier est présentée et défendue, un flacon de solution potable (10% d'éthanol sucrose/10% ou de 10% de saccharose) est mis à la disposition du rat pendant environ 20 minutes (échantillons 3-4).
      5. Post-boisson: Après une période de boisson, les bouteilles se rétracte, mais le rat reste in la chambre opérant pendant environ 20 minutes (échantillons 3-4).

    6. Procédures de microdialyse: Préparation de l'échantillon pour l'analyse de microdialyse éthanol

    1. Deux échantillons avant animaux s'auto-administrer la solution d'éthanol, et tous les échantillons après, sont évaluées pour la concentration en éthanol. Pipeter une aliquote soit 1 ou 2 ul de l'échantillon d'intérêt dans un flacon en verre de 2 ml. Scellez ensuite le flacon avec un septum étanche à l'air (9 mm Rouge Poly Vis d'assemblage, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Le volume de l'aliquote d'analyse éthanol (1 ou 2 pi) dépend du volume total de l'échantillon, et le volume d'échantillon requis pour toutes les analyses complémentaires.
    2. Si les échantillons seront utilisés pour une analyse ultérieure neurochimique, conserver l'échantillon de manière appropriée suivant l'ajout de l'aliquote pour la quantification d'éthanol.
    3. Par exemple, notre laboratoire analyse les échantillons pour la dopamine. Pour ce faire, placer les échantillons sur la glace sèche pendant l'expériencepuis, stocker les échantillons à -80 ° C après l'expérience. Nous utilisons 2 aliquotes pour l'analyse d'un échantillon d'éthanol 5 min recueillies à l'aide d'un débit de 2,0 l / min pour les sondes placées dans le noyau accumbens. Cela permet au moins 7 pl restant pour une analyse ultérieure de la dopamine par chromatographie en phase liquide à haute performance avec détection électrochimique.
    4. Pour les échantillons prélevés dans le cortex préfrontal, qui a beaucoup plus faibles concentrations de dopamine extracellulaire, nous utilisons une aliquote de 1 ul d'éthanol pour l'analyse proviennent d'un échantillon de 7 min en utilisant un débit de 1,0 l / min.

    7. Post-microdialyse procédures

    1. Après la conclusion de l'expérience de microdialyse, anesthésier le rat et retirer la sonde. Remplacez l'obturateur si l'animal n'est pas immédiatement euthanasié. Recueillir le cerveau dans les trois jours de l'expérience. Dans le cas contraire, la visualisation des voies sonde peut ne pas être possible.
    2. Le cerveau doit être retiré iconformément aux protocoles approuvés n utilisation des animaux. Nous utilisons du pentobarbital de sodium (150 mg / kg, ip) surdose, suivie de la perfusion cardiaque avec une solution saline, puis dans une solution saline de formol. Cerveau immerger dans une solution de formol salin pendant au moins 12 heures avant la coupe.
    3. Coronaire section du cerveau en 100 tranches um. Stain tranches au crésyl violet, et d'examiner le placement correcte de la sonde. 5, 6

    8. L'analyse des échantillons de concentration en éthanol

    1. Les échantillons prélevés ainsi que des normes externes (de 0,3125 à 20 mM d'éthanol) sont exécutés sur notre chromatographe en phase gazeuse avec détection à ionisation de flamme. Ce système est constitué d'un chromatographe en phase gazeuse Varian CP 3800 avec un détecteur à ionisation de flamme, un spectromètre Bruker (Varian) 8400 autosampler espace de tête chauffé à 50 ° C, et une colonne capillaire HP Innowax (30 mx 0,53 mm x 1,0 um d'épaisseur de film), avec l'hélium en tant que phase mobile.
    2. Les chromatogrammes sont enregistrés et analysés avec Chromatography logiciel tel que le logiciel Varian Star Workstation chromatographie qui sera spécifiquement abordée ici.
    3. Pour préparer le système pour l'analyse de l'éthanol, faire chauffer la plaque échantillonneur automatique en utilisant un bain de recirculation d'eau, et ouvrez les deux réservoirs de gaz supplémentaires (de l'air et de l'hydrogène; hélium est toujours laissé en marche pour préserver la colonne de cire).
    4. Noter les pressions de réservoir de gaz, ainsi que le nombre d'échantillons que vous comptez exécuter afin que vous puissiez tenir le compte du nombre de fois où la fibre et de la cloison ont été utilisés afin qu'ils puissent être modifiés si nécessaire (fibre-500 injections; septum crevaisons -100).
    5. Initier la méthode de démarrage, qui prépare le système pour exécuter échantillons (paramètres du programme dans le Tableau 2). Attendez que le système de signaler qu'il est "Prêt".
    6. Initier un 20-min "brûler", qui prépare la fibre pour l'analyse d'échantillons en le soumettant à une température élevée pour désorber tout contaminant qu'il a absorbé au repos.
    7. Les normes sont faites pardilution de 238 ul d'éthanol à 95% avec de l'eau jusqu'à un volume final de 100 ml en utilisant une fiole jaugée dans une hotte. Cela crée une solution d'éthanol à 40 mM. Nous utilisons une dilution 1:1 de série pour créer 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 normes mM. Pour chaque concentration de l'étalon, utiliser le même volume aliquote qui seront prises à partir des échantillons de dialyse. Pipeter l'aliquote dans un flacon en verre de 2 ml, puis sceller le flacon avec un septum étanche à l'air.
    8. Tous les échantillons d'éthanol sont chauffés dans le passeur d'échantillons jusqu'à ce que l'aliquote de liquide entière a été vaporisé. Nous chauffons nos échantillons pendant environ 30 min.
    9. Cette section décrit le logiciel Workstation étoiles que nous utilisons avec notre chromatographe en phase gazeuse. D'autres logiciels peuvent être utilisés mais la description ci-dessous peuvent ne pas être applicables.
    10. Pour exécuter échantillons, de créer une liste d'exemples de noter que l'échantillon est l'emplacement dans lequel passeur d'échantillons, et combien de fois l'échantillon doit être ponctionnée. Assurez-vous de passer les fichiers de données à votre pli sélectionnéer. Ensuite, sélectionnez la méthode de choix pour vos échantillons, et de commencer la course. Nous utilisons les paramètres de fonctionnement indiquées dans le tableau 2.
    11. Notre programme d'éthanol absorbe l'échantillon de dialysat pendant 3 min et désorbe dans le flux d'hélium, qui se jette dans la colonne de cire, pendant 1 min. Toutefois, les programmes peuvent être écrits pour répondre à vos besoins spécifiques.
    12. Les composants de l'échantillon séparés dans la colonne de cire, puis passer par le détecteur à ionisation de flamme où les composés contenant du carbone, tels que les ions d'éthanol, la combustion et la libération. Il en résulte un flux d'électrons à partir de l'augmentation du détecteur anode à la cathode de créer un courant, qui est converti en tension et enregistrées, conduisant à l'une des chromatogrammes comme indiqué ci-dessous (figure 1). La variation de tension est proportionnelle à la quantité de carbone qui passe à travers le détecteur à travers temps7
    13. Après que le système a terminé de s'exécuter les échantillons que vous aurez besoin de vérifier l'intégration de chaque pic. Pour le logiciel Workstation Star,cliquez sur l'icône pic bleu dans la barre d'outils. Cliquez sur la couleur de chaque pic et faites glisser les flèches pour régler le niveau de référence. Réinsérer chaque pic avant de passer au prochain groupe de crêtes. Le logiciel d'analyse de pointe peut être n'importe quel logiciel de chromatographie général.
    14. Pour le logiciel Workstation Star, cliquez sur l'icône de rapport de lot dans votre barre d'outils. Faites glisser chaque échantillon à partir de votre dossier spécifié pour le journal des lots pour imprimer les exemples de rapports. Logiciel de reporting peuvent être personnalisées avec la plupart des systèmes de logiciel de chromatographie.
    15. Les rapports peuvent être programmés pour afficher les informations de votre choix. Nous utilisons actuellement la hauteur du pic, mais les rapports peuvent également être programmé pour utiliser la surface du pic.
    16. Pour arrêter le système, déclenche la méthode d'arrêt (paramètres indiqués dans le tableau 2), éteignez le bain d'eau, et de fermer les réservoirs d'hydrogène et d'air lorsque la température du four colonne atteint 30 ° C.

    9. Les données d'éthanol

    1. Tracer la hauteur du pic commeen fonction de chaque concentration connue éthanol standard externe (figure 2A). Utiliser la fonction linéaire proposée par ces points à calculer la concentration d'éthanol à partir de la hauteur de pic proposée par chaque échantillon de dialysat.
    2. En traçant la concentration d'éthanol dans le dialysat au fil du temps, nous pouvons voir le schéma des niveaux d'éthanol dans la région du cerveau d'intérêt lors de notre session de comportement. Exemple de données, indiquées ci-dessous (figure 2B), sont représentés par la concentration d'éthanol dans le dialysat à travers le temps au cours de la session d'auto-administration.

    10. Entretien général: La fibre doit être changé toutes les 500 ponctions, et le septum sur 100 ponctions

    Pour changer la fibre

    1. Sur le chromatographe en phase gazeuse touche Menu pad appuyez sur, sélectionnez 8400, appuyez sur Entrée, sélectionnez seringue changement, appuyez sur Entrée. Le passeur se positionnera à permettre à la fibre (fibre SPME Assemblée, 75 um Carboxen-PDMS, Supelco analytique, BellefoNTE, PA) à enlever.
    2. Ouvrez la porte recouvrant la fibre. Dévisser l'écrou de blocage, et déplacer le verrou pour permettre à l'ensemble de fibres à éliminer. Prenez l'assemblage de fibres sur. Dévissez l'écrou qui maintient la fibre dans l'assemblée, puis dévisser la fibre.
    3. Remplacer la fibre usée par une nouvelle, et remonter l'ensemble de fibres. Remplacer l'ensemble de l'échantillonneur automatique, re-verrouillage et visser l'assemblage en place. Lorsque vous avez terminé, appuyez sur "changer faite" sur le clavier, et le passeur d'échantillons sera lui-même prêt à l'emploi.

    Pour changer le septum

    1. Tout d'abord, dévisser le capuchon recouvrant la cloison (Salut-Temp 0,450 Diam. Générique conditionné Septa, Varian) puis retirez la cloison ancienne. Le siège du septum nouveau vers le bas dans le raccord. Revisser le bouchon et le serrer avec la clé. Ensuite, utiliser une aiguille d'injection pour percer le septum de sorte que la fibre se rompt pas la première fois que le septum est percé.
    2. 11. Les résultats représentatifs

      La figure 1 montre les chromatogrammes exemple pour trois concentrations d'éthanol et normes pour un échantillon de dialysat rat recueillies à la fin de l'auto-administration d'éthanol session. Des pics d'éthanol doit être relativement symétrique, ont des temps de rétention constants, et un signal de> 10 bruit. Le non-respect de ces critères signifie que votre système nécessite un entretien. Chromatographie normes de qualité et correctement préparés produire une courbe standard linéaire (R2 ≥ 0,99; figure 2A) qui est utilisée pour calculer la concentration en éthanol d'échantillons de dialysat recueilli à partir d'éthanol auto-administrer des animaux au cours de leur session de l'auto-administration (figure 2B) .

      Figure 1
      Figure chromatogrammes Exemple 1.. Un microlitre de la norme d'éthanol ou de l'échantillon de dialysat a été chargé dans un c gazhromatograph flacon et analysés comme décrit dans le texte. A) Superposition des pics générés à partir de 2,5, 5,0 et 10 mM d'éthanol normes. B) de pointe généré à partir d'un échantillon de dialysat à partir d'un rat qui a auto-administré éthanol.

      Figure 2
      Figure 2. Résultats graphiques de l'expérience exemple de la figure 1. A) courbe standard éthanol. Évolution dans le temps B) de la concentration d'éthanol dialysat à travers une auto-administration d'éthanol session.

      <tr>
      Matériel Paramètre Start-up de réglage Exécution de réglage Mise au repos
      8400 Bruker (Varian) Autosampler
      Mode d'injection SPME SPME n / a
      Profondeur de pénétration de solvant 0% 20% n / a
      Profondeur de pénétration échantillon 20% 20% n / a
      Temps d'absorption 0,01 min 3 min n / a
      Temps de désorption 19 min 1 min n / a
      Nettoyez la source du mode solvant Je Je n / a
      Propre mode d'adsorption et de désorption du temps 0,01 min 0,01 min n / a
      Bain d'eau (chauffe échantillonneur automatique) * 50 ° C 50 ° C De
      Varian CP-3800 chromatographe en phase gazeuse
      Four injecteur Puissance du four Sur Sur Sur
      La température du four 250 ° C 220 ° C 30 ° C
      Four colonne Temps de stabilisation 0,10 min 0,10 min 0.10min
      Température 65 ° C 65 ° C 30 ° C
      Colonne Débit de la phase mobile 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a
      Pression de la colonne ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi
      Détecteur FID Puissance du four Sur Sur Sur
      Température 220 ° C 220 ° C 120 ° C Électronique Sur Sur De
      Constante de temps Rapide Rapide Rapide
      Gamme 11 11 11
      Autozéro Oui Oui Oui

      Tableau 2. Chromatographe en phase gazeuse avec des paramètres d'ionisation de flamme du système de détection. Ce tableau indique les paramètres pour les trois programmes utilisés pour préparer les start-up (réglages), course (course paramètres) et maintenir le système lorsqu'il n'est pas utilisé (les réglages de repos).

    Discussion

    Applications et les limites

    L'auto-administration de médicaments est utilisé chez les rongeurs à la toxicomanie modèle. Beaucoup de médicaments d'abus qui sont modélisés dans ce mode peut être administré par voie intraveineuse, dans laquelle le médicament est administré directement dans le compartiment central. Cela permet une surveillance étroite de la dose au cours d'une session d'auto-administration. L'éthanol est généralement auto-administré par voie orale, il est beaucoup plus difficile de surveiller les concentrations de médicaments dues aux différences individuelles dans l'absorption et le métabolisme. En utilisant la microdialyse pour l'échantillon de la région du cerveau d'intérêt, nous sommes non seulement en mesure de suivre le modèle de l'éthanol pour atteindre la région, mais nous sommes également en mesure de surveiller simultanément les modifications des neurotransmetteurs dans la même région au fil du temps au cours de chaque phase d'auto-administration.

    Modifications neurochimiques induites par les médicaments et les réactions dans le cerveau sont associés à la toxicomanie et de la dépendance: ainsi, en même temps que la capacité de meaneurochimique et que les concentrations de médicament pendant certaines phases d'auto-administration fournit un outil très puissant et unique. Une question à garder à l'esprit pour corréler les concentrations d'analytes dialysat ayant des comportements sont les caractéristiques physiques de la plomberie microdialyse. Plus précisément, le temps qu'il faut pour que le fluide soit transféré à partir de la lumière de la sonde de microdialyse pour le tube collecteur est critique, et des temps plus courts sont meilleurs. Dans notre laboratoire, nous construisons les sondes de sorte que le temps est d'environ 90 secondes. En utilisant ces conditions, nous avons constaté qu'il ya une augmentation de la dopamine accumbal au début de la consommation d'éthanol, ce qui diminue au cours des périodes de boissons et de post-boisson avec l'augmentation de la concentration d'éthanol de dialysat. 2,3,8,9 Ces expériences , lorsqu'il est combiné avec des données provenant d'études pharmacologiques, nous ont permis d'analyser les effets pharmacologiques strictement d'éthanol et de l'auto-administration des signaux environnementaux associés à changes des concentrations de neurotransmetteurs.

    Il convient de noter que cette application particulière de combinés comportementale microdialyse techniques est adapté aux intérêts de recherche actuels de notre laboratoire. Il est conçu pour évaluer la structure temporelle de l'éthanol atteint le cerveau par rapport à la tendance de l'évolution des neurotransmetteurs dans la même région, de sorte que nous pouvons relier ces mesures synchrones auto-administration comportements. Les concentrations d'éthanol provenant de dialysat ne sont pas corrigés pour la récupération in vivo sonde, et ne représentent qu'une fraction de la concentration du tissu cérébral éthanol. Si microdialyse quantitative de l'éthanol est requis, la fraction d'extraction de l'éthanol qui diffuse à partir de l'espace extracellulaire dans la sonde doit être déterminée expérimentalement. Voir les publications antérieures de notre laboratoire pour les méthodes et la discussion plus loin. 10,11,12

    Bien que ce protocole illustre l'utilisation du gaz chromatography avec microextraction en phase solide de l'éthanol à partir de l'espace de tête d'échantillons de microdialyse, d'autres méthodes pour l'analyse de la teneur en éthanol de l'échantillon de micro-dialyse peut être utilisé. Toutefois, d'autres méthodes peuvent souffrir de quelques inconvénients. Par exemple, moins sensibles méthodes analytiques peuvent exiger un plus grand volume d'échantillon qui nécessite des temps d'échantillonnage supérieure à la 5-7 min illustré ici. Le type de système discuté ici utilise une micro-extraction en phase solide qui concentre l'éthanol dans la phase vapeur dans la cuvette pour échantillon scellé en permettant l'absorption de la fibre placée dans l'espace de tête du flacon. Ce qui améliore la limite de détection par rapport à l'espace de tête de prélèvement direct qui permet typiquement 50-100 microlitres de la vapeur à injecter. Un autre avantage majeur de la méthode de l'espace de tête est que l'échantillon injecté pour l'analyse est extrêmement propre et exempte de sels. L'injection directe de l'échantillon microdialyse liquide peut également être utilisé avec une plus grande SENSITivité, mais cela nécessitera plus de temps d'arrêt instrument pour cause de maintenance régulière requise pour nettoyer les sels injectés.

    Dépannage et autres notes

    1. Avant que votre expérience commence, vous donner beaucoup de temps pour vérifier que vos microdialyse set-ups fonctionnent correctement et pour dépanner les problèmes éventuels. Nous suggérons que vous avez un supplément de set-up, perfusés avec ACSF, prêt à basculer avec un dysfonctionnement set-up pour gagner du temps, comme la plupart des séances opérant tendance à se produire à une heure précise chaque jour.
    2. S'assurer que les sondes de microdialyse sont insérés sur une période d'environ 5 minutes à minimiser les dommages aux tissus produite par cisaillement du tissu que la sonde pénètre dans le cerveau.
    3. Lors du transfert du rat dans la chambre opérante, il est utile d'avoir une deuxième personne assister afin que la ligne de transfert (partie de la microdialyse set-up) ne devient embrouillée, et afin que le programme peut être opérant à initiated à temps.
    4. Assurez-vous que vous donnez le bain d'eau beaucoup passeur de temps pour atteindre la température appropriée. Notre système nécessite généralement deux heures pour atteindre 50 ° C. En outre, veiller à ce que vos échantillons sont entièrement vaporisé avant d'analyser les échantillons. En général, nous confirmer visuellement que cela s'est produit avant d'entreprendre l'analyse des échantillons.
    5. Standard des bonnes pratiques de chimie analytique doivent être suivies. Ceux-ci incluent, mais ne sont pas limités à, la validation des individus, des équipements et des procédures. En bref, nous employons les lignes directrices suivantes: Les utilisateurs individuels doivent démontrer leur capacité à générer des valeurs reproductibles hauteur de pic des concentrations standard et linéaires courbes standard (R2 ≥ 0,99) sur plusieurs jours. Pour vérifier le système GC-FID fonctionne correctement, les normes doivent être toujours être analysés avant tout prélèvement d'échantillons de dialysat sont injectés. La courbe standard générée doit avoir un R2 ≥ 0,99.
    6. La plupart des équipements que nous utilisonsa été acheté par Varian, Inc, qui a été acquise par Agilent Technologies en 2010. A cette époque, Bruker Instruments scientifiques obtenus Varian laboratoire chromatographie en phase gazeuse instruments affaires. Pour les achats futurs, consultez quelconque de ces sociétés.
    7. Le présent protocole indique comportement opérant sur des rats, mais le spectateur doit être conscient que plus la perturbation du comportement est susceptible de se produire avec le modèle plus petit de la souris. Une autre question à prendre en compte est que le placement d'une sonde de microdialyse dans d'autres régions cérébrales que le cortex médial préfrontal ou noyau accumbens peut perturber le comportement opérant à un degré plus élevé que montré ici. Il est important d'examiner attentivement de nombreux paramètres comportementaux pour déterminer si les dommages causés par placement de la sonde produit des changements dans le comportement graves.

    Disclosures

    Cet article a été financée par les Associés Med, Inc

    Acknowledgments

    Cette recherche a été financée par des subventions du NIH / NIAAA (AA11852 et AA007471).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
    2. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).
    3. Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).
    4. Pettit, H. O., Justice, J. B. Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens. Brain Res. 539, 94-102 (1991).
    5. Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. Academic Press Inc. (1998).
    6. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press Inc. (1986).
    7. Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis. 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).
    8. Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens. J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).
    9. Carrillo, J., Gonzales, R. A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling. Alcohol. 45, 559-5566 (2011).
    10. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration. Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).
    11. Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain. J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).
    12. Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum. Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).
    Microdialyse d&#39;éthanol au cours de l&#39;éthanol détermination opérant auto-administration et d&#39;éthanol par chromatographie en phase gazeuse
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter