Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Microdialysis של אתנול במהלך אתנול נחישות ממשל עצמי ואתנול אופרנטית על ידי גז כרומטוגרפיה

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

שיטה כדי לקבוע את מהלך הזמן של ריכוז אתנול במוחם של חולדות במהלך אתנול אופרנטית מנהל עצמי מתוארת. גז כרומטוגרפיה עם זיהוי יינון להבה משמשת לכימות אתנול בדגימות dialysate, כי יש לו את הרגישות הנדרשת לנפחים הקטנים שנוצרו.

Abstract

שיטות אופרנטית מנהל עצמי משמשות בדרך כלל כדי לחקור את ההשפעות ההתנהגותיות ותרופתיות של תרופות רבות של התעללות, כולל אתנול. עם זאת, אתנול הוא בדרך כלל בניהול עצמי דרך פה, ולא לוריד כמו תרופות רבות אחרות של התעללות. את הפרמקוקינטיקה של תרופות אוראליות הן יותר מורכבת מאשר תרופות הזרקה לוריד. בגלל הבנת הקשר בין ההשפעות התרופתיות והתנהגותי של אתנול דורשת ידע של קורס הזמן של אתנול להגיע למוח במהלך ולאחר השתייה, אנו משתמשים בmicrodialysis vivo וגז כרומטוגרפיה עם זיהוי יינון להבה לנטר ריכוזי אתנול dialysate מוח לאורך זמן.

ניסויים microdialysis התנהגותי משולבים כרוכים בשימוש במספר טכניקות. במאמר זה, ניתוח stereotaxic, הדרכה וmicrodialysis התנהגותי, שיכול להיות מותאם לבדיקת מספר רב של ניהול עצמי וNeuהשערות rochemical מרכז, נכללות רק כדי להמחיש כיצד הם מתייחסים לשלבים המאוחרים יותר של איסוף דגימה וניתוח אתנול dialysate. Dialysate ניתוח ריכוז אתנול באמצעות גז כרומטוגרפיה עם זיהוי להבת יינון, שהוא ספציפי למחקרי אתנול, מתואר בפירוט. נתונים היוצר על ידי שיטות אלה חושפים דפוס של אתנול להגיע למוח במהלך הליך ניהול עצמי, וכאשר יחד עם ניתוח נוירוכימי של אותן דגימות dialysate, מאפשרים מסקנות להתבצע ביחס להשפעה התרופתית והתנהגותי של אתנול.

Protocol

1. כירורגיה Stereotaxic

  1. כל הנהלים בעקבות מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הטיפול בבעלי החיים המוסדיים ועדה ושימוש.
  2. שימוש במנגנון stereotaxic, היטב טפל חולדות הארוך אוונס, מורדמות עם isoflurane, הם מושתלים עם צינורית 21-מד (להמשך החדרת חללית microdilaysis) (פלסטיקה אחת, Roanoke, VA) מעל האזור במוח של עניין, ולקשור בורג מובנה בשלב הראש (המשמש לתמיכת ציוד microdialysis).
  3. פקח על חולדות בזהירות במהלך ואחרי הניתוח. ודא שכל החיות תקבלנה לפחות שבוע אחד של טיפול שאחרי הניתוח והתאוששות ובריאות לפני שמתחיל בהליכים הבאים. וידאו יופיטר של שיטת ניתוח stereotaxic זמין. 1

2. אימון אינסטרומנטאלית

  1. אחרי שבוע של התאוששות לאחר הניתוח, הם מאומנים למנוף לעיתונות 10% סוכרוז solution בתא מד Associates אופרנטית (MedAssociates, Inc, והרמונט, ארה"ב) לבוש עם lickometer, ידית נשלפת, וצינור קשית (כפי שתואר קודם לכן בווארד et al., 2009). 2 תוכנה מMedAssociates משמשת עיצוב כל תוכניות אופרנטית (MedAssociates, Inc, ורמונט, ארה"ב).
  2. ברגע שמאומן להגיב לסוכרוז, מתחיל חולדות בתכנית אימונים מתאימה שבי אתנול יתווסף בהדרגה לפתרון על מפגשי שתייה מרובות.
  3. לדוגמה, המעבדה שלנו משתמשת כיום בתכנית אימונים של 8-יום שבו נמוג לתוך אתנול הפתרון שהגיע לשיא בפתרון שתיית סוכרוז 10% אתנול / 10%. פקד חיים מקבלים 10% סוכרוז או אין פתרון שתייה בלבד. סוג המסוים של לוח זמנים אופרנטית לשמש יכול להשתנות במידה רבה, אבל את הנהלים הכלליים המפורטים להלן לדגימת microdialysis עדיין יכולים להתבצע. 3

3. נהלים טרום microdialysis: קשירה

בלילה שלפני שני לאימון אחרון (בדוגמא שלנו זה אימון 7 ב), בעלי חיים הם מורגלים למעיין הגבול, אשר מייחס לבורג הרצועה על הבמה בראשם. האביב מצרף לסיבוב microdialysis וזרוע מנוף איזון נגדית, שהוא מושעה ליד הכלוב עם מעמד טבעת ומהדקים כדי שבעל החיים יכולים לנוע בחופשיות בתוך הכלוב שלו. חיות כבולים לבלות את הלילה בחדר אופרנטית, בכלוב ביתם עם מזון ומים כרצון, כדי להרגיל אותם לקשירת הגדרה.
  • למחרת, העכברוש משלים תכנית אופרנטית עם רצועה במקום, כדי להרגיל את בעל חיים לתחושה של הרצועה בעת ביצוע המשימות התנהגותיות שלה. הר מנגנון הקשירה לקיר של החדר אופרנטית ליד חלק העליון כדי לאפשר השעיה של הרצועה ומסתובב מעל מרכז הגג של החדר אופרנטית. כל זה ממוקם בתוך תא ניחות הצליל. After הפגישה, להחזיר את החולדה לכלוב בבית שלה בחדר אופרנטית להמתין הכנסת חללית microdiaysis.
  • 4. נהלים טרום microdialysis: חללית microdialysis מוכנסת היום לפני ניסוי microdialysis, אחרי העכברוש השלים אימון התנהגותי ליום

    1. היום לפני ניסוי microdialysis, אחרי העכברוש השלים חיבור אופרנטית תוך קשורים, להרדים את העכברוש בisoflurane ולהסיר את האטם ממדריך קנולה. לאט (מעל ~ 5 דקות) להוסיף בדיקת microdialysis, perfused בנוזל שדרת מוחות מלאכותי (ACSF), דרך צינורית מדריך הגולגולת לאזור במוח של עניין. אנו משתמשים בבדיקות מעבדה שהוקמה באופן ונהלי microdialysis מתכונת Doyon et al., 2003, ופטיט והמשפט, 1991. 3, 4
    2. השתמש במנגנון הקשירה דן בעבר להשעות את הכניסה ויציאה של קווי החללית מעל בעלי החיים.
    3. הפעל עמקצב זרימת גלימה מטה ל -0.2 μl / דקה. שוב, החולדה מבלה את הלילה בחדר אופרנטית.

    5. נהלי Microdialysis: איסוף הדגימות במהלך הפעלת ניהול עצמי בשלבי אפטטיבית וconsummatory המופרדים

    1. לפחות 2 שעות לפני שהניסוי יתחיל, מגביר את קצב הזרימה לבדיקה החוזרת שלה. אנו משתמשים או 1.0 או 2.0 μl / דקות בהתאם לאזור המוח. בדקו שקצב זרימת הבדיקה עולה בקנה אחד, ולפחות 90% מקצב הזרימה נקבע על ידי שימוש במזרק המילטון למדידת נפח לאורך זמן.
    2. דגימות דיאליזה (5 או 7 דקות) נלקחות לפני, במהלך, ולאחר הפגישה אופרנטית. מרווח הדגימה תלויה באזור במוח, מוליך העצבי שאנו מנתחים, dialysate ריכוז אנליטי, ורגישות של ציוד הכימיה אנליטית המשמשת לניתוח. השלבים התנהגותיות הם כדלקמן:
      1. בסיסי: בתחילת הניסוי,לאסוף דגימות דיאליזה בכלוב בביתו של בעל החיים (4 דגימות).
      2. העברה: לאחר איסוף דגימות בסיסיות כלוב הביתה, להעביר את העכבר לתא אופרנטית. העברה של העכברוש הקשור דורשת זהירות רבה כדי לוודא כי קו העברת נוזל microdialysis אינו הופך להיות סבוך, ושהחולדה נשארת רגועה. מייד לאחר ההעברה, להפעיל את התכנית אופרנטית כפי שתשתנה מהמדגם הבסיסי / העברה למדגם ההמתנה הראשונה.
      3. חכה: המשך לאסוף דגימות כעכברוש ממתין למנוף להאריך לתוך התא (דוגמאות 3-4 בהתאם לאזור במוח).
      4. שותה: אחרי המנוף מוצג ולחץ, בקבוק שתיית התמיסה (10% אתנול sucrose/10% או 10% סוכרוז) נעשה זמין לעכברים במשך כ 20 דקות (דוגמאות 3-4).
      5. לאחר משקה: לאחר תקופת שתייה, חזר בו הבקבוק, אבל אני נשאר העכברושn הקאמרי אופרנטית במשך כ 20 דקות (דוגמאות 3-4).

    6. נהלי Microdialysis: הכנת מדגם microdialysis לניתוח אתנול

    1. שתי דוגמאות לפני חיות עצמיות לנהל את פתרון אתנול, וכל הדגימות לאחר, נבחנים לריכוז אתנול. פיפטה או aliquot μl 1 או 2 מהמדגם של התעניינות לתוך בקבוקון 2 מיליליטר זכוכית. אז לאטום את הבקבוקון עם מחיצה הדוקה אוויר (Cap 9 מ"מ האדום פולי בורג, PTFE / סיל SEPTA, Agilent Technologies). נפח aliquot ניתוח אתנול (1 או 2 μl) תלוי בנפח הכולל מדגם, ונפח הדגימה הנדרשת לכל ניתוח נוסף.
    2. אם ייעשו שימוש בדגימות לניתוח מאוחר יותר נוירוכימי, לאחסן מדגם כראוי לאחר pipetting aliquot לכימות אתנול.
    3. לדוגמה, המעבדה שלנו מנתחת את הדוגמות לדופמין. כדי להשיג זאת, הנח את הדוגמות על קרח יבש במהלך הניסויולאחר מכן, לאחסן את הדגימות ב-80 ° C לאחר הניסוי. אנו משתמשים 2 aliquots μl לניתוח של אתנול מדגם 5 דקות נאסף באמצעות קצב זרימה של 2.0 μl / דקה לבדיקות שהונחו בגרעין הנסמך. זה מאפשר לפחות 7 μl נותר לניתוח מאוחר יותר של דופמין על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהה עם זיהוי אלקטרוכימי.
    4. לדגימות שנלקחו מקליפת מוח הקדם חזיתית, שבו יש ריכוזי הדופמין תאיים נמוכים בהרבה, אנו משתמשים aliquot 1 μl לניתוח אתנול נלקח ממדגם 7-דק באמצעות קצב זרימה של 1.0 μl / דקה.

    7. הליכים לאחר microdialysis

    1. לאחר סיום ניסוי microdialysis, להרדים את העכברוש ולהסיר את החללית. החלף את האטם אם החיה אינה מורדמת באופן מיידי. אסוף את המוח בתוך שלושה ימים של הניסוי. אחרת, להדמיה של מערכת הבדיקה לא יכולה להיות אפשרית.
    2. המוח צריך להסיר אניבהתאם n עם פרוטוקולי שימוש בבעלי חיים מאושרים. אנו משתמשים בנתרן פנטוברביטל (150 מ"ג / ק"ג, ip) ממנת יתר, ואחרי זלוף לב עם מי מלח ואז פורמלין בתמיסת מלח. מוח לשקוע בפתרון פורמלין-סליין לפחות 12 שעות לפני שחתך.
    3. Coronally סעיף המוח לפרוסות 100 מיקרומטר. כתם פרוסות עם סגול cresyl, ולבחון למיקום בדיקה נכונה. 5, 6

    8. ניתוח של דוגמאות לריכוז אתנול

    1. הדגימות שנאספו כמו גם הסטנדרטים חיצוניים (0.3125-20 אתנול מ"מ) לרוץ על גז כרומטוגרף שלנו עם מערכת זיהוי יינון להבה. מערכת זו מורכבת מכרומטוגרף ריאן CP 3800 גז עם גלאי יינון להבה, ברוקר (ריאן) 8400 אמיצים autosampler מחומם ל 50 מעלות צלזיוס, ועמודה של HP Innowax נימים (30 .53 1.0 סרט מ"מ x mx מיקרומטר עבה), עם הליום כשלב נייד.
    2. Chromatograms נרשמים ונתח עם chromatogrתוכנת aphy כגון תוכנת ריאן סטאר כרומטוגרפיה Workstation שיידון דווקא כאן.
    3. כדי להכין את המערכת לניתוח אתנול, לחמם את צלחת autosampler באמצעות אמבט מי הסירקולציה מחודשת, ולפתוח את שני מכלי גז הנוסף (אוויר ומימן; הליום תמיד ממשיך לפעול כדי לשמר את עמודת השעווה).
    4. הקלט את לחצי גז טנקים, כמו גם את מספר הדגימות שאתה מתכוון להריץ, כך שתוכל לשמור על ספירה של מספר פעמי הסיבים ומחץ היו בשימוש, כך שהם יכולים להיות שונים כאשר (סיבים-500 זריקות מתאימות; מחצו דקירות -100).
    5. ליזום שיטת סטארט אפ, המכינה את המערכת להפעלת דגימות (פרמטרי תכנית בלוח 2). חכה למערכת לדווח כי הוא "מוכן".
    6. ליזום 20-דקות "לשרוף", המכין את הסיבים לניתוח מדגם על ידי חשיפתו לטמפרטורות גבוהות לכל desorb מזהם שספג בזמן מנוחה.
    7. תקנים נעשים על ידידילול 238 μl של אתנול 95% במים לנפח סופי של 100 מ"ל באמצעות בקבוק נפחית במנדף כימי. זה יוצר פתרון אתנול 40 מ"מ. אנו משתמשים בדילול 01:01 סידורי כדי ליצור 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3125 סטנדרטי מ"מ. עבור כל ריכוז של סטנדרטי, השתמש באותה aliquot הנפח שיילקח מדגימות הדיאליזה. פיפטה aliquot לתוך בקבוקון זכוכית 2 מ"ל, ואז לאטום את הבקבוקון עם מחיצה הדוקה אוויר.
    8. כל דגימות אתנול מחוממים בautosampler עד aliquot הנוזל כולו כבר מתאדה. אנו לחמם הדגימות שלנו לכ 30 דקות.
    9. סעיף זה מתאר את תוכנת Workstation כוכב שאנו משתמשים בגז כרומטוגרף שלנו. תוכנה אחרת, ניתן להשתמש, אבל התיאור שלהלן לא יהיה ישים.
    10. כדי להפעיל דגימות, ליצור רשימת דוגמאות לציין שמדגם הוא שבחריץ autosampler, וכמה פעמים צריך להיות המדגם נקב. הקפד מסלול את קבצי נתונים לקיפול נבחראה. לאחר מכן, בחר את השיטה מועדפת על הדגימות שלך, ולהתחיל לרוץ. אנו משתמשים בפרמטרי הריצה ציינו בטבלה 2.
    11. תכנית אתנול dialysate סופגת את המדגם עבור 3 דקות וdesorbs לתוך זרם הליום, המזין את עמודת השעווה, לדקות 1. עם זאת, תוכניות יכולות להיכתב כדי להתאים לצרכימים הספציפיים שלך.
    12. רכיבי המדגם הנפרדים בעמודת השעווה, ולאחר מכן לעבור את גלאי יינון הלהבה בי פחמן המכיל תרכובות, כגון יוני אתנול, התלקחות ושחרור. התוצאה הוא זרימת אלקטרונים מוגברת מהאנודה של הגלאי לקתודת יצירה נוכחית, אשר מומרות למתח וכתוצאה מכך נרשמה chromatograms כמו זו שמוצגת להלן (איור 1). השינוי במתח הוא פרופורציונלי לכמות הפחמן עובר דרך הגלאים פני time.7
    13. לאחר שהמערכת סיימה ריצת הדגימות תצטרך לבדוק את האינטגרציה של כל שיא. לתוכנת Workstation סטאר,לחץ על סמל המצחיה הכחולה בסרגל הכלים. לחץ על הצבע של כל שיא וגרור את החצים כדי לכוון את נקודת ההתחלה. להשתלב מחדש שיא כל לפני שעבר על הקבוצה הבאה של פסגות. תוכנת ניתוח השיא יכולה להיות כל תוכנת כרומטוגרפיה כללית.
    14. לתוכנת Workstation כוכב, לחץ על סמל הדו"ח יצווה בסרגל הכלים שלך. גרור כל דגימה מהתיקייה שצוינה לדו"ח יצווה כדי להדפיס את הדוחות לדוגמה. תוכנת דיווח יכולה להיות מותאמת אישית עם מערכות תוכנת כרומטוגרפיה הנפוצות ביותר.
    15. הדוחות ניתן programed להציג את המידע על פי בחירתך. אנו משתמשים כיום גובה שיא, אך הדוחות ניתן גם להשתמש programed אזור שיא.
    16. כדי לסגור את המערכת, ליזום שיטת הכיבוי (פרמטרים שצוינו בטבלה 2), כבה את האמבטיה במים, ולסגור את מכלי מימן ואוויר כאשר טמפרטורת תנור העמודה מגיעה 30 ° C.

    9. נתוני אתנול

    1. שרטט את גובה השיא כפונקציה של כל ריכוז אתנול ידוע חיצוני סטנדרטי (איור 2 א). השתמש בפונקציה ליניארית שניתן על ידי הנקודות הללו כדי לחשב את ריכוז אתנול מגובה השיא שניתן על ידי כל דגימת dialysate.
    2. ידי התוויית הריכוז של אתנול בdialysate לאורך זמן, אנחנו יכולים לראות את הדפוס של רמות אתנול באזור המוח של ריבית במהלך מושב ההתנהגות שלנו. נתוני דוגמה, מוצגים להלן (איור 2 ב '), מוצגים כריכוז של אתנול בdialysate לאורך הזמן במהלך פגישתו מנהל עצמי.

    10. תחזוקה כללית: הסיבים צריכים להיות שונים כל 500 דקירות, ומחץ כל 100 דקירות

    כדי לשנות את הסיבים

    1. בתפריט גז כרומטוגרף מפתח כרית העיתונות, בחר 8400, קש enter; בחר מזרק שינוי, לחץ על Enter. Autosampler יהיה מצב את עוצמה כדי לאפשר לסיבים (אסיפת SPME סיבים, 75 מיקרומטר Carboxen-PDMS, Supelco אנליטי, BellefoNTE, הרשות הפלסטינית) כדי להסירו.
    2. פתח את הדלת המכסה את הסיבים. הברג החוצה את אום הנעילה, ולהזיז את התפס כדי לאפשר הרכבת הסיבים שיש להסיר. הוצא את מכלול הסיבים. הברג החוצה את הבורג שמחזיק את הסיבים בהרכבה, ולאחר מכן לפרק את הסיבים.
    3. החלף את הסיבים הישנים עם חדש, ולהרכיב מחדש את מכלול הסיבים. השב את המערך בautosampler, מחדש latching ודופק את המכלול למקומו. כשתסיימו, לחץ על "השינוי נעשה" במקלדת, ויהיה מוכן autosampler עוצמה לשימוש.

    כדי לשנות את המחיצה

    1. ראשית, לפתוח את המכסה מכסה את המחיצה (0.450 Dia Hi-Temp. גנרי SEPTA אוויר, וריאן) ולאחר מכן להסיר את המחיצה הישנה. מושב המחיצה החדשה לתוך הולם. מחדש לדפוק את הכובע והדק אותו עם מפתח הברגים. לאחר מכן, השתמש מחט זריקה לנקב המחיצה כך שהסיבים לא ישברו הפעם הראשונה מחץ הוא נקב.
    2. 11. נציג תוצאות

      האיור 1 מציג chromatograms לדוגמה עבור שלושה ריכוזים של סטנדרטי אתנול ולמדגם dialysate עכברוש שנאסף בסוף פגישת אתנול המנהל עצמי. פסגות אתנול צריכות להיות סימטריות יחסית, יש זמני שמירה עקביים, ויחס אות לרעש> 10. אי עמיד בקריטריונים אלה אומר שהמערכת שלך דורשת תחזוקה. כרומטוגרפיה איכות וסטנדרטים שהוכנו כראוי לייצר עקומת סטנדרט ליניארית (R2 ≥ 0.99; 2A איור) המשמשת לחישוב ריכוז אתנול של דגימות שנאסף מאתנול dialysate עצמי ניהול חיות במהלך פגישת המנהל העצמי שלהם (איור 2 ב ') .

      איור 1
      איור 1. Chromatograms דוגמה. microliter אחד סטנדרטי אתנול או מדגם dialysate נטען לגז גhromatograph בקבוקון ונתח כפי שמתואר בטקסט. א) כיסוי של פסגות שנוצרו מ2.5, 5.0 ו 10 מ"מ סטנדרטי אתנול. B) שיא שנוצר ממדגם dialysate מעכברוש שיש אתנול לניהול עצמי.

      איור 2
      איור 2. תוצאות גרפיות מניסוי דוגמה מוצג באיור 1. א) עקומת סטנדרט אתנול. B) כמובן זמן של ריכוז אתנול dialysate פני מושב אתנול מנהל עצמי.

      <p>
      חומרה פרמטר Start-up הגדרה הפעלת הגדרה הגדרת מנוחה
      8400 ברוקר (ריאן) autosampler
      מצב הזרקה SPME SPME n /
      עומק חדירת ממס 0% 20% n /
      עומק חדירה לדוגמה 20% 20% n /
      זמן קליט 0.01 דקות 3 דקות n /
      זמן desorption 19 דקות 1 דקות n /
      נקה מקור ממס מצב אני אני n /
      מצב נקי וספיחת desorption הזמן 0.01 דקות 0.01 דקות n /
      אמבט מים (מתחמם autosampler) * 50 מעלות צלזיוס 50 מעלות צלזיוס כבוי
      CP-3800 ריאן כרומטוגרף
      תנור Injector כוח התנור על על על
      טמפרטורת תנור 250 ° C 220 מעלות צלזיוס 30 מעלות צלזיוס
      תנור עמודה זמן התייצבות 0.10 דקות 0.10 דקות 0.10min
      טמפרטורה 65 מעלות צלזיוס 65 מעלות צלזיוס 30 מעלות צלזיוס
      טור קצב זרימת שלב נייד 8.5 מ"ל / דקה 8.5 מ"ל / דקה n /
      לחץ עמודה ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0.1 psi
      FID גלאי כוח התנור על על על
      טמפרטורה 220 מעלות צלזיוס 220 מעלות צלזיוס 120 ° C אלקטרוניקה על על כבוי
      זמן קבוע מהר מהר מהר
      רכס 11 11 11
      Autozero כן כן כן

      טבלה 2. כרומטוגרף גז עם פרמטרים של מערכת לזיהוי יינון בעירה. טבלה זו מציגה את הפרמטרים לשלוש התוכניות המשמשות להכנה (הזנק הגדרות), לרוץ (ריצת הגדרות) ולתחזק את המערכת בזמן שאינו בשימוש (הגדרות מנוחה).

    Discussion

    יישומים ומגבלות

    ניהול עצמי תרופה משמש במכרסמים להתמכרות לסמי מודל. תרופות רבות של התעללות שהם מודל בצורה זו ניתן בהזרקה לוריד, שבו התרופה ישירות לתא המרכזי. זה מאפשר מעקב צמוד של מינון מעל המושב מנהל עצמי. מאז אתנול הוא בדרך כלל דרך פה לניהול עצמי, זה הרבה יותר קשה לעקוב אחר רמות תרופה בשל הבדלים אישיים בספיגה וחילוף חומרים. באמצעות microdialysis לדגימה מהאזור במוח של עניין, אנחנו לא רק יכולים לעקוב אחר הדפוס של אתנול להגיע לאזור, אבל אנחנו גם מסוגלים בו זמנית לעקוב אחר שינויי מוליך עצבי באותו האזור לאורך זמן בכל שלב ניהול עצמי.

    שינויי neurochemical ותגובות סמים במוח קשורים לשימוש בסמים ותלות, ולכן יכולת mea מקבילנוירוכימי בטוח וריכוז תרופה בשלבים מסוימים לניהול עצמי מספקים כלי רב עצמה וייחודי. נושא אחד שכדאי לזכור לcorrelating ריכוזי dialysate של analytes עם התנהגות הוא המאפיינים הפיסיים של צנרת microdialysis. באופן ספציפי, את הזמן שנדרש כדי שהנוזל הועבר מלומן של חללית microdialysis לצינור האיסוף הוא קריטי, וזמנים קצרים יותר הם טובים יותר. במעבדה שלנו, ואנחנו בונים את הבדיקות כך שהזמן הוא כ 90 שניות. שימוש בתנאים אלה, מצאו שיש עליית דופמין accumbal בייזום של צריכת אתנול, אשר מקטינה במהלך את המשקה ולאחר משקה התקופות של עליות ריכוז אתנול dialysate. 2,3,8,9 ניסויים אלה , בשילוב עם נתונים ממחקרים פרמקולוגיים, אפשר לנו לנתח את ההשפעות בהחלט פרמקולוגיים של אתנול ומנהל עצמי רמזים סביבתיים הקשורים בפרקAnges בריכוזי שליחים עצביים.

    יש לציין כי היישום המסוים הזה של טכניקות משולבות התנהגותי-microdialysis מותאם לתחומי המחקר הנוכחיים של המעבדה שלנו. זה נועד כדי להעריך את הדפוס הזמני של אתנול להגיע למוח בהשוואה לדפוס שינויי מוליך עצבי באותו האזור, כך שאנו יכולים להתייחס לצעדים אלה התנהגויות סינכרוני מנהל עצמי. ריכוזי אתנול dialysate נגזרים לא יתוקנו להתאוששות בחללית vivo, והם רק חלק קטן מריכוז אתנול רקמת המוח. אם microdialysis כמותית של אתנול נדרש, שבריר הפקת אתנול שמפזר ממרחב החוץ התאי לתוך החללית צריך להיקבע באופן ניסיוני. ראה פרסומים קודמים מהמעבדה שלנו לשיטות ודיון נוסף. 10,11,12

    למרות שפרוטוקול זה מדגים את השימוש בגז chromatography יחד עם microextraction שלב היציב של אתנול מHeadspace של דגימות microdialysis, שיטות אחרות לניתוח של תוכן אתנול ממדגם microdialysis יכול לשמש. עם זאת, שיטות אלטרנטיביות יכולות לסבול מחסרונות מסוימים. לדוגמה, שיטות אנליטיות פחות רגישות עשויות לדרוש נפח דגימה גדולה יותר שמחייב גבוהה פי דגימה מדקות 5-7 מודגמות כאן. הסוג של מערכת הנדונה כאן משתמש microextraction שלב מוצק שמתרכז אתנול באדי השלב בבקבוקון המדגם האטום כך שהוא מאפשר ספיגה לסיבים הממוקמים באמיץ את הבקבוקון. זה משפר את גבול הגילוי לעומת דגימה אמיצה ישירה אשר בדרך כלל מאפשרת 50-100 microliters של האדים להיות מוזרקים. יתרון בולט נוסף של השיטה הוא שאמיץ המדגם המוזרק לניתוח הוא מאוד נקי וללא מלחים. הזרקה ישירה של מדגם microdialysis הנוזל עשויה לשמש גם עם sensit הגבוהלקוחים, אבל זה ידרוש יותר מכשיר לאורך זמן בשל תחזוקה שוטפת הנדרשת למנקה את המלחים המוזרק.

    פתרון בעיות, והערות אחרות

    1. לפני הניסוי שלך מתחיל, לתת לעצמך מספיק זמן כדי לבדוק שלהגדיר הקופץ microdialysis שלך מתפקד כראוי ולהטריד-לירות בכל סוגיות. אנו ממליצים לך יש תוספת הגדרה, perfused עם ACSF, מוכן לעבור עם תקלת הגדרה כדי לחסוך זמן, כמו רוב המפגשים אופרנטית נוטים להתרחש בזמן מסוים בכל יום.
    2. הקפד כי בדיקות microdialysis מוכנסות על פני תקופה של כ 5 דקות כדי למזער את הניזק לרקמות המיוצר על ידי הטיה של הרקמה כחללית חודרת למוח.
    3. בעת העברת העכבר לתוך התא אופרנטית כדאי לי אדם שני לסייע כך שהעברת הקו (חלק מהגדרת microdialysis) אינו הופך סבוך, וכך שהתכנית אופרנטית ניתן initiated בזמן.
    4. ודא שאתה נותן המון autosampler מי האמבט של זמן כדי להגיע לטמפרטורה המתאימה. המערכת שלנו בדרך כלל דורשת שעות כדי להגיע ל 50 מעלות צלזיוס כמו כן, להבטיח כי הדגימות שלך מתאדות באופן מלא לפני ניתוח הדגימות. אנחנו בדרך כלל חזותיים לאשר כי זה התרחש לפני ביצוע ניתוח מדגם.
    5. שיטות סטנדרטיות כימיה טובות אנליטיים צריכות להיות אחריו. אלה כוללים, אך לא מוגבלים, לאימות של אנשים, ציוד ונהלים. בקיצור, אנחנו מעסיקים את ההנחיות הבאות: משתמשים בודדים צריכים להפגין את היכולת ליצור ערכי גובה שיא לשעתק לריכוזים סטנדרטיים ועיקולים רגילים ליניארי (R2 ≥ 0.99) במשך מספר ימים. כדי לאמת את מערכת GC-FID פועלת כראוי, סטנדרטים צריכים להיות תמיד להיות מנותחים לפני כל דגימות dialysate מוזרקות. עקומת הסטנדרט שנוצרה צריכה R2 ≥ 0.99.
    6. רוב הציוד שאנו משתמשיםנרכש באמצעות ריאן, Inc, אשר נרכשה על ידי טכנולוגיות Agilent בשנת 2010. בשלב זה, מכשירים מדעיים Bruker הושגו העסק של ריאן מעבדת גז כרומטוגרפיה המכשירים. לרכישות עתידיות, התייעץ עם החברה אחת.
    7. הפרוטוקול הנוכחי מראה התנהגות אופרנטית עם חולדות, אבל הצופה צריך להיות מודע לכך שיותר הפרעת התנהגות היא צפויה להופיע במודל העכבר הקטן. נושא נוסף שיהיה מודע לזה שמיקום של חללית microdialysis לאזורים אחרים במוח מקליפת מוח הקדם חזיתית המדיאלי או גרעין נסמך עלולים לשבש התנהגות אופרנטית למידה רבה יותר מאשר שמוצג כאן. זה חשוב לבחון את פרמטרים התנהגותיים רבים מקרוב כדי לקבוע אם הניזק שנגרם על ידי מיקום חללי מייצר שינויים חמורים בהתנהגות.

    Disclosures

    מאמר זה מומן על ידי מד Associates, Inc

    Acknowledgments

    מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות / NIAAA (AA11852 וAA007471).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
    2. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).
    3. Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).
    4. Pettit, H. O., Justice, J. B. Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens. Brain Res. 539, 94-102 (1991).
    5. Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. Academic Press Inc. (1998).
    6. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press Inc. (1986).
    7. Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis. 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).
    8. Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens. J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).
    9. Carrillo, J., Gonzales, R. A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling. Alcohol. 45, 559-5566 (2011).
    10. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration. Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).
    11. Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain. J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).
    12. Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum. Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).
    Microdialysis של אתנול במהלך אתנול נחישות ממשל עצמי ואתנול אופרנטית על ידי גז כרומטוגרפיה
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter