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Neuroscience

Microdialisi di etanolo durante la determinazione operante auto-amministrazione ed etanolo etanolo mediante gascromatografia

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

Un metodo per determinare l'andamento nel tempo della concentrazione di etanolo nel cervello di ratti durante etanolo operante autosomministrazione viene descritto. Gascromatografia con rivelazione a ionizzazione di fiamma viene utilizzato per quantificare etanolo nei campioni di dialisato, perché ha la sensibilità richiesta per i piccoli volumi generati.

Abstract

Operante auto-somministrazione metodi sono comunemente usati per studiare gli effetti comportamentali e farmacologici di molti farmaci di abuso, tra cui l'etanolo. Tuttavia, l'etanolo è in genere auto-somministrato per via orale, piuttosto che per via endovenosa come molte altre sostanze d'abuso. La farmacocinetica dei farmaci somministrati per via orale sono più complesse di farmaci somministrati per via endovenosa. Poiché la comprensione del rapporto tra gli effetti farmacologici e comportamentali di etanolo richiede la conoscenza dell'andamento nel tempo di etanolo raggiunge il cervello durante e dopo bere, usiamo microdialisi in vivo e gascromatografia con rivelatore a ionizzazione di fiamma per monitorare cerebrali concentrazioni di etanolo dialisato nel tempo.

Combinati microdialisi-comportamentali esperimenti comportano l'uso di tecniche diverse. In questo articolo, chirurgia stereotassica, formazione comportamentale e microdialisi, che può essere adattato per testare una moltitudine di auto-somministrazione e neupetrolchimico ipotesi centrato, sono inclusi solo per illustrare il loro rapporto con le successive fasi di raccolta dei campioni e analisi di etanolo dialisato. Dializzato concentrazione di etanolo analisi tramite gascromatografia con rivelazione a ionizzazione di fiamma, che è specifico per studi etanolo, è descritto in dettaglio. I dati prodotti da questi metodi di rivelare il disegno di etanolo che raggiunge il cervello durante la procedura di auto-amministrazione, e se abbinato con l'analisi neurochimica dei campioni dialisato stessi, permette di trarre conclusioni circa gli effetti farmacologici e comportamentali di etanolo.

Protocol

1. Chirurgia stereotassica

  1. Tutte le procedure seguite la guida NIH per la cura ed uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso.
  2. Utilizzando un apparecchio stereotassico, ben gestito a lungo Evans, ratti anestetizzati con isoflurano, sono impiantati con una cannula da 21 gauge (per un successivo inserimento microdilaysis sonda) (Materie plastiche Uno, Roanoke, VA), al di sopra della regione del cervello di interesse, e un cordoncino bullone è costruito nella fase testa (utilizzato per sostenere apparecchiature microdialisi).
  3. Monitorare attentamente ratti durante e dopo l'intervento chirurgico. Assicurarsi che tutti gli animali ricevono almeno una settimana di post-chirurgica cura e di recupero e sono in buona salute prima di iniziare le procedure seguenti. Un video JoVE del metodo chirurgico stereotassico è disponibile. 1

2. Formazione operante

  1. Dopo una settimana di post-chirurgica di recupero, gli animali sono addestrati a leva stampa per saccarosio solutio 10%n in una camera di Med Associates operante (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) dotato di un lickometer, leva a scomparsa, ed il tubo sipper (come descritto in precedenza in Howard et al., 2009). 2 Software da MedAssociates viene utilizzato per progettare tutti programmi operante (MedAssociates, Inc., Vermont, Stati Uniti d'America).
  2. Una volta addestrati a rispondere per il saccarosio, iniziano i ratti in un programma di allenamento adeguato, durante il quale l'etanolo sta gradualmente aggiunto nella soluzione più bevute più.
  3. Ad esempio, il nostro laboratorio si avvale attualmente di 8 giorni programma di allenamento in cui è sbiadito etanolo nella soluzione si conclude con un etanolo 10% / 10% di soluzione di saccarosio potabile. Gli animali di controllo ricevono solo il 10% di saccarosio o di nessuna soluzione bere. Il tipo specifico di programma operante da utilizzare può variare ampiamente, ma le procedure generali descritte di seguito per il campionamento microdialisi può ancora essere effettuata. 3

3. Pre-microdialisi Procedura: Tethering

La notte prima della seconda seduta di allenamento precedente (nel nostro esempio questa è la sessione di allenamento 7 °), gli animali sono abituati a legare la molla, che si attacca al perno cavezza dalla loro fase testa. La molla si attacca alla girevole microdialisi e contro braccio di leva di bilanciamento, che è sospeso vicino alla gabbia con uno stand anello e morsetti in modo che l'animale possa muoversi liberamente all'interno della sua gabbia. Animali Tethered passare la notte nella stanza operante, nella loro gabbia casa con cibo ad libitum e acqua, per abituarli al tethering set-up.
  • Il giorno seguente, il ratto completa il suo programma operante con la cavezza in atto, per abituare l'animale al sentimento del legare durante l'esecuzione dei suoi compiti comportamentali. Montare l'apparecchio tethering alla parete della camera operante vicino alla parte superiore per consentire la sospensione del laccio e girevole sopra il centro del tetto della camera di operante. Tutto questo è posto all'interno della camera fonoassorbenti. After la sessione, riportare il topo alla sua gabbia di casa nella sala operante in attesa di inserimento sonda microdiaysis.
  • 4. Pre-microdialisi Procedura: La sonda microdialisi è inserito il giorno prima dell'esperimento microdialisi, dopo il ratto ha completato la formazione comportamentale per il giorno

    1. Il giorno prima dell'esperimento microdialisi, dopo il ratto ha completato una sessione operante mentre tethered, anestetizzare il ratto con isoflurano e togliere l'otturatore dalla cannula guida. Lentamente (oltre ~ 5 min) inserire una sonda microdialisi, perfusi con liquido cerebrospinale artificiale (ACSF), attraverso la cannula guida cranica nella regione del cervello di interesse. Usiamo laboratorio costruite le sonde e le procedure di microdialisi modellati Doyon et al., 2003 e Pettit e Giustizia, 1991. 3, 4
    2. Utilizzare l'apparato tethering precedentemente discusso di sospendere l'ingresso e linee di uscita della sonda sopra dell'animale.
    3. Ruotare il pveste portata fino a 0,2 microlitri / min. Ancora una volta, il ratto trascorre la notte nella stanza operante.

    5. Procedure di microdialisi: Raccolta di campioni durante l'auto-somministrazione sessione con fasi appetitive e consumatorio separati

    1. Almeno 2 ore prima che l'esperimento inizia, alzare la sonda alla sua portata di esercizio. Si può usare o 1,0 o 2,0 microlitri / min a seconda della regione del cervello. Verificare che la portata sonda è coerente, e almeno il 90% della quantità regolata di flusso utilizzando una siringa Hamilton da misurare volume nel tempo.
    2. Campioni di dialisi (5 o 7 min) sono presi, prima, durante e dopo la sessione operante. L'intervallo di campionamento dipende dalla regione del cervello, neurotrasmettitore analizzato, dializzato concentrazione dell'analita e sensibilità dell'apparecchio chimica analitica da utilizzare per l'analisi. Le fasi comportamentali sono i seguenti:
      1. Baseline: All'inizio della sperimentazione,raccogliere campioni di dialisi in gabbia dell'animale domestico (4 campioni).
      2. Trasferimento: Dopo la raccolta di campioni di gabbia a casa di base, trasferire il topo alla camera operante. Trasferimento del ratto tethered richiede estrema attenzione per assicurarsi che il fluido linea microdialisi di trasferimento non intricata, e che il topo rimane calmo. Subito dopo il trasferimento, attivare il programma operante come si passa dalla linea di base / trasferimento del campione al campione di attesa prima.
      3. Attendere: continuare a raccogliere campioni come il topo attende la leva per estendere nella camera (campioni 3-4 a seconda della regione del cervello).
      4. Drink: Dopo la leva viene presentato e premuto, un flacone di soluzione potabile (10% etanolo sucrose/10% o 10% di saccarosio) è reso disponibile per il ratto per circa 20 minuti (campioni 3-4).
      5. Post-drink: Dopo il periodo di bevanda, si ritrae bottiglia, ma il ratto i restin la camera operante per circa 20 minuti (campioni 3-4).

    6. Procedure di microdialisi: Preparazione del campione per l'analisi microdialisi etanolo

    1. Due campioni prima animali auto-somministrare la soluzione di etanolo, e tutti i campioni dopo, vengono valutati per la concentrazione di etanolo. Pipettare un 1 o 2 aliquota microlitri dal campione di interesse in una fiala di vetro 2 ml. Poi chiude la fiala con un setto a tenuta d'aria (9 mm Rosso Poly Vite, PTFE / Sil Setti, Agilent Technologies). Il volume della aliquota analisi etanolo (1 o 2 microlitri) dipende dal volume totale del campione, e il volume di campione necessaria per eventuali ulteriori analisi.
    2. Se i campioni saranno utilizzati per una successiva analisi neurochimica, conservare il campione in modo appropriato dopo aver pipettato l'aliquota per la quantificazione etanolo.
    3. Ad esempio, il nostro laboratorio analizza i campioni per la dopamina. A tale scopo, posizionare i campioni in ghiaccio secco durante l'esperimentoe quindi, conservare i campioni a -80 ° C dopo l'esperimento. Usiamo aliquote di 2 microlitri per l'analisi di un campione di etanolo 5 min raccolti utilizzando una portata di 2,0 microlitri / min per sonde situate nel nucleo accumbens. Questo permette almeno 7 microlitri rimanente per successiva analisi della dopamina mediante cromatografia liquida ad alta prestazione con rivelazione elettrochimica.
    4. Per i campioni prelevati dalla corteccia prefrontale, che ha molto basse concentrazioni di dopamina extracellulare, usiamo una aliquota 1 ml per analisi etanolo preso da un 7-min campione utilizzando un flusso di 1,0 microlitri / min.

    7. Post-microdialisi procedure

    1. Dopo la conclusione dell'esperimento microdialisi, anestetizzare il ratto e rimuovere la sonda. Sostituire l'otturatore se l'animale non è immediatamente sottoposti ad eutanasia. Raccogliere il cervello entro tre giorni dell'esperimento. Altrimenti, visualizzazione del tratto sonda può non essere possibile.
    2. Il cervello deve essere rimosso iconformità con i protocolli n animali approvati in uso. Usiamo sodio pentobarbital (150 mg / kg, ip) sovradosaggio, seguita da perfusione cardiaca con soluzione salina e poi formalina in soluzione salina. Immergere in un cervello in formalina salina soluzione per almeno 12 ore prima del taglio.
    3. Coronalmente sezione del cervello in 100 fette micron. Colorare fette con violetto cresolo, ed esaminare per il posizionamento della sonda corretta. 5, 6

    8. Analisi di campioni per la concentrazione di etanolo

    1. I campioni raccolti e standard esterni (0,3125-20 etanolo mM) sono gestiti dal nostro gascromatografo con sistema di rilevazione a ionizzazione di fiamma. Questo sistema è composto da un Varian CP 3800 gascromatografo con rivelatore a ionizzazione di fiamma, un (Varian) Bruker 8400 headspace autocampionatore riscaldata a 50 ° C, e una colonna HP INNOWax capillare (30 mx 0,53 millimetri x 1,0 pellicola micron di spessore), con elio come fase mobile.
    2. Cromatogrammi sono registrati e analizzati con Chromatogrsoftware aphy come la workstation Varian Stella software cromatografia che verranno specificamente discusso qui.
    3. Per preparare il sistema per l'analisi etanolo, riscaldare la piastra autocampionatore con un bagno di acqua di ricircolo, e aprire i due serbatoi supplementari (aria e idrogeno, l'elio è sempre lasciato in esecuzione per mantenere la colonna cera).
    4. Registrare le pressioni del gas del serbatoio, così come il numero di campioni che si intende eseguire in modo da poter tenere il conto del numero di volte che la fibra e setto sono stati utilizzati in modo che possano essere modificati, se del caso (fibre-500 iniezioni setto; forature -100).
    5. Avviare lo start-up metodo, che prepara il sistema per eseguire i campioni (i parametri del programma di cui alla tabella 2). Attendere che il sistema di segnalare che si tratta di "Pronto".
    6. Avviare un 20-minuti "bruciare", che prepara la fibra per l'analisi del campione sottoponendolo a una temperatura elevata per desorbire qualsiasi contamina ha assorbito a riposo.
    7. Gli standard sono fatti dadiluendo 238 ml di etanolo al 95% con acqua ad un volume finale di 100 mL utilizzando un pallone volumetrico in una cappa. Questo crea una soluzione di etanolo al 40 mM. Usiamo una diluizione 1:1 di serie per creare 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0,3125 mm Standard. Per ogni concentrazione dello standard, utilizzare le stesse aliquote volume che verranno prese dai campioni dialisi. Pipettare l'aliquota in un flacone di vetro da 2 ml, e quindi sigillare il flaconcino con un setto a tenuta d'aria.
    8. Tutti i campioni di etanolo vengono riscaldati nel campionatore automatico fino a quando il liquido aliquota intera è stato vaporizzato. Abbiamo riscaldare i nostri campioni per circa 30 min.
    9. Questa sezione descrive il software Workstation stella che usiamo con il nostro gascromatografo. Altro software può essere utilizzato, ma la descrizione sottostante non può essere applicabile.
    10. Per eseguire i campioni, creare una lista di esempio notando che campione è in quale slot autocampionatore, e quante volte il campione deve essere forato. Assicurarsi che il percorso dei file di dati al vostro volte selezionatoer. Quindi, selezionare il metodo di scelta per i campioni, e iniziare la corsa. Usiamo i parametri di funzionamento indicato in tabella 2.
    11. Nostro programma etanolo dializzato assorbe il campione per 3 min e desorbe nel flusso di elio, che alimenta la colonna cera, per 1 min. Tuttavia, i programmi possono essere scritti per soddisfare le vostre esigenze specifiche.
    12. I componenti del campione distinti nella colonna di cera, e poi passare attraverso il rivelatore a ionizzazione di fiamma dove il carbonio contenenti composti, come gli ioni etanolo, combust e rilascio. Ciò si traduce in un aumento del flusso di elettroni da anodo del rivelatore al catodo creando una corrente, che viene convertita in tensione e registrata conseguente cromatogrammi come quella mostrata di seguito (Figura 1). La variazione di tensione è proporzionale alla quantità di carbonio che passa attraverso il rivelatore attraverso time.7
    13. Dopo che il sistema è terminata l'esecuzione degli esempi è necessario verificare l'integrazione di ogni picco. Per il software Workstation Star,fare clic sull'icona di picco blu nella barra degli strumenti. Fare clic sul colore di ogni picco e trascinare le frecce per regolare la linea di base. Reintegrare ogni picco prima di spostarsi al prossimo gruppo di cime. Il software di analisi di picco può essere qualsiasi software cromatografia generale.
    14. Per il software Workstation Star, fare clic sull'icona del lotto relazione nella barra degli strumenti. Trascinare ogni campione dalla cartella specificata al report in batch per stampare i report di esempio. Software di reporting possono essere personalizzati con sistemi di cromatografia più diffusi software.
    15. I report possono essere programmati per mostrare le informazioni di vostra scelta. Al momento stiamo utilizzando altezza del picco, ma i rapporti possono anche essere programmati per utilizzare l'area di picco.
    16. Per spegnere il sistema, avviare il shut-down metodo (parametri indicato in tabella 2), spegnere il bagno d'acqua, e chiudere i serbatoi di idrogeno e aria quando la temperatura del forno a colonna raggiunge i 30 ° C.

    9. Etanolo dati

    1. Tracciare l'altezza del piccouna funzione di ogni concentrazione nota esterno etanolo standard (Figura 2A). Utilizzare la funzione lineare dato da questi punti per calcolare la concentrazione di etanolo dalla altezza del picco in ciascun campione dializzato.
    2. Riportando la concentrazione di etanolo nel dializzato nel tempo, si può vedere lo schema di livelli di etanolo nella regione del cervello di interesse durante la seduta comportamentale. Dati di esempio, mostrato sotto (Figura 2B), sono rappresentati come la concentrazione di etanolo nel dializzato nel tempo durante la sessione di autosomministrazione.

    10. Manutenzione generale: La fibra deve essere cambiato ogni 500 punture, e il setto ogni 100 forature

    Per cambiare la fibra

    1. Nel menu gascromatografo tastiera numerica premere, selezionare 8400, premere Invio, selezionare siringa cambiamento, premere invio. Il campionatore automatico si posizionerà per consentire la fibra (Assemblea Fibra SPME, 75 micron Carboxen-PDMS, Supelco analitica, Bellefonte, PA) da rimuovere.
    2. Aprire lo sportello che copre la fibra. Svitare il dado di bloccaggio e spostare il fermo per permettere il montaggio delle fibre da rimuovere. Prendete il gruppo fibra fuori. Svitare il dado che tiene la fibra in assemblea, e poi svitare la fibra.
    3. Sostituire la fibra vecchio con uno nuovo, e rimontare il gruppo di fibre. Sostituire il gruppo nel campionatore automatico, ri-aggancio e avvitare il gruppo in posizione. Al termine, premere il tasto "cambia fatto" sulla tastiera, e il campionatore automatico sarà pronto per l'uso stesso.

    Per cambiare il setto

    1. In primo luogo, svitare il tappo che copre il setto (Hi-Temp 0,450 Dia. Generico condizionata Septa, Varian) e quindi rimuovere il setto vecchio. Sede del setto nuovo giù nel raccordo. Riavvitare il tappo e serrare con la chiave. Quindi, utilizzare un ago di iniezione per forare il setto in modo che la fibra non rompere la prima volta viene perforato il setto.
    2. 11. Risultati rappresentativi

      La figura 1 mostra cromatogrammi di esempio per tre concentrazioni di etanolo e standard per un campione dializzato ratto raccolta alla fine della sessione di etanolo autosomministrazione. Picchi etanolo dovrebbe essere relativamente simmetriche, hanno tempi di ritenzione costanti, e un rapporto segnale-rumore> 10. Il mancato rispetto di questi criteri significa che il sistema necessita di manutenzione. Cromatografia standard di qualità e correttamente preparate produrre una curva standard lineare (R2 ≥ 0,99; Figura 2A) che viene utilizzato per calcolare la concentrazione di etanolo dialisato campioni raccolti da auto-somministrazione di etanolo gli animali nel corso della loro auto-somministrazione di sessione (Figura 2B) .

      Figura 1
      Figura 1. Cromatogrammi di esempio. Un microlitro di standard di etanolo o campione dializzato è stato caricato in un gas chromatograph flaconcino e analizzati come descritto nel testo. A) Sovrapposizione dei picchi generati da 2.5, 5.0 e 10 Norme di etanolo mM. B) di picco generato da un campione dializzato da un ratto che ha auto-somministrato etanolo.

      Figura 2
      Figura 2. Risultati grafici di esperimento di esempio illustrato nella Figura 1. A) Etanolo curva standard. B) Naturalmente il tempo di concentrazione di etanolo dialisato attraverso una sessione di auto-somministrazione di etanolo.

      <tr>
      Hardware Parametro Start-up di impostazione Esecuzione di impostazione Impostazione di riposo
      8400 Bruker (Varian) Autocampionatore
      Modalità di iniezione SPME SPME n / a
      Profondità di penetrazione del solvente 0% 20% n / a
      Esempio di penetrazione in profondità 20% 20% n / a
      Assorbimento tempo 0,01 min 3 min n / a
      Desorbimento tempo 19 min 1 min n / a
      Pulire fonte solvente modalità Io Io n / a
      Clean modalità di adsorbimento e desorbimento tempo 0,01 min 0,01 min n / a
      Bagnomaria (riscalda autocampionatore) * 50 ° C 50 ° C Spento
      CP-3800 Varian gascromatografo
      Iniettore Forno Potenza forno Su Su Su
      Temperatura del forno 250 ° C 220 ° C 30 ° C
      Colonna Forno Tempo di stabilizzazione 0,10 min 0,10 min 0.10min
      Temperatura 65 ° C 65 ° C 30 ° C
      Colonna Fase mobile portata 8,5 ml / min 8,5 ml / min n / a
      Colonna di pressione ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi
      Rivelatore FID Potenza forno Su Su Su
      Temperatura 220 ° C 220 ° C 120 ° C Elettronica Su Su Spento
      Costante di tempo Veloce Veloce Veloce
      Gamma 11 11 11
      Autozero

      Tabella 2. Gascromatografo con parametri di rilevazione di fiamma a ionizzazione di sistema. Questa tabella mostra i parametri per i tre programmi utilizzati per la preparazione (start-up delle impostazioni), di esecuzione (esecuzione impostazioni) e la manutenzione del sistema, mentre non è in uso (le impostazioni di riposo).

    Discussion

    Applicazioni e limitazioni

    Droga auto-amministrazione è utilizzato in roditori a dipendenza del modello di droga. Molti farmaci di abuso che sono modellate in questo modo può essere somministrato per via endovenosa, in cui il farmaco viene consegnato direttamente al vano centrale. Questo consente un attento monitoraggio della dose per un auto-amministrazione sessione. Dal momento che l'etanolo è di solito auto-somministrato per via orale, è molto più difficile di monitorare i livelli di farmaco a causa di differenze individuali di assorbimento e il metabolismo. Utilizzando microdialisi a campione dalla regione del cervello di interesse, non sono in grado di controllare il modello di etanolo raggiungere la regione, ma siamo anche in grado di monitorare simultaneamente i cambiamenti dei neurotrasmettitori nella stessa regione nel corso del tempo durante ogni fase di auto-somministrazione.

    Alterazioni neurochimiche indotte da farmaci e le risposte del cervello sono associati con abuso e di dipendenza, quindi, la possibilità di concomitanza MEAneurochimico che concentrazioni del farmaco nel corso di specifiche fasi di auto-amministrazione fornisce uno strumento molto potente e unico. Una questione da tenere a mente per correlare le concentrazioni di analiti con dialisato comportamento è le caratteristiche fisiche del l'impianto idraulico microdialisi. Specificamente, il tempo necessario per il fluido da trasferire dal lume della sonda microdialisi al tubo di raccolta è critica, e riducendo i tempi sono migliori. Nel nostro laboratorio, costruiamo le sonde in modo che il tempo è di circa 90 secondi. Utilizzando queste condizioni, abbiamo scoperto che vi è un aumento della dopamina accumbal all'inizio del consumo di etanolo, che diminuisce nel corso dei periodi bevande e post-bevanda al crescere dialisato concentrazione di etanolo. 2,3,8,9 Questi esperimenti , in combinazione con i dati provenienti da studi farmacologici, ci hanno permesso di analizzare gli effetti strettamente farmacologici di etanolo e di auto-somministrazione associati stimoli ambientali sul canaleanges delle concentrazioni di neurotrasmettitori.

    Va notato che questa particolare applicazione del combinato comportamentale-microdialisi tecniche è adatto agli attuali interessi di ricerca del nostro laboratorio. È stato progettato per valutare il pattern temporale di etanolo che raggiunge il cervello in confronto al modello di cambiamenti dei neurotrasmettitori nella stessa regione, in modo da poter collegare queste misure sincroni auto-amministrazione comportamenti. I derivati ​​concentrazioni di etanolo dialisato non sono corretti per il recupero della sonda in vivo, e sono solo una frazione della concentrazione di etanolo tessuto cerebrale. Se microdialisi quantitativa di etanolo è richiesto, la frazione di estrazione di etanolo che diffonde dallo spazio extracellulare nella sonda deve essere determinato sperimentalmente. Vedere pubblicazioni precedenti del nostro laboratorio per i metodi e le ulteriori discussioni. 10,11,12

    Sebbene questo protocollo illustra l'uso di gas chromatography con microestrazione in fase solida di etanolo dallo spazio di testa dei campioni di microdialisi, altri metodi per l'analisi del contenuto di etanolo nel campione microdialisi potrebbe essere utilizzato. Tuttavia, metodi alternativi possono soffrire di alcuni svantaggi. Ad esempio, i metodi di analisi meno sensibili possono richiedere un volume di campione più ampio che necessita di tempi di campionamento superiore al 5-7 minuti qui illustrato. Il tipo di sistema discusso qui usa un microestrazione in fase solida che concentra l'etanolo nella fase vapore nella fiala campione sigillato, consentendo l'assorbimento alla fibra collocato nello spazio di testa flaconcino. Questo migliora il limite di rilevazione rispetto campionamento headspace diretta che consente tipicamente 50-100 microlitri del vapore da iniettare. Un altro grande vantaggio del metodo è che spazio di testa del campione iniettato per analisi è estremamente pulita e priva di sali. Iniezione diretta del campione microdialisi liquido può essere utilizzato anche con maggiore SENsitivity, ma ciò richiederà più tempo strumento verso il basso a causa di manutenzione ordinaria necessaria per pulire i sali iniettati.

    Risoluzione dei problemi e altre note

    1. Prima che l'esperimento ha inizio, concedetevi un po 'di tempo per verificare che i microdialisi set-up corretto funzionamento e per problemi sparare eventuali problemi. Si consiglia di avere un extra set-up, perfusi con ACSF, pronti a passare con un malfunzionamento set-up per risparmiare tempo, in quanto la maggior parte delle sessioni operante tendono a manifestarsi in un momento specifico ogni giorno.
    2. Assicurarsi che le sonde da microdialisi sono inseriti in un periodo di circa 5 min per minimizzare il danno ai tessuti prodotti da taglio del tessuto, come la sonda penetra il cervello.
    3. Durante il trasferimento del ratto nella camera operante è utile avere una seconda persona assistere in modo che la linea di trasferimento (parte della microdialisi set-up) non diventa aggrovigliato, e in modo che il programma può essere operante initIATED in tempo.
    4. Assicurarsi che vi darà l'abbondanza di acqua campionatore bagno di tempo per raggiungere la temperatura adeguata. Il nostro sistema richiede in genere due ore per raggiungere i 50 ° C. Inoltre, assicurarsi che i campioni siano completamente vaporizzato prima di analizzare i campioni. Noi di solito visivamente confermare che questo si è verificato prima di iniziare l'analisi dei campioni.
    5. Standard di buone pratiche di chimica analitica devono essere seguite. Questi includono, ma non sono limitati a, convalida di individui, attrezzature e procedure. In breve, si impiegano le seguenti linee guida: i singoli utenti devono dimostrare la capacità di generare riproducibili i valori di altezza di picco per le concentrazioni di standard e lineari curve standard (R2 ≥ 0,99) nell'arco di più giorni. Per verificare la GC-FID sistema funziona correttamente, le norme devono essere sempre essere analizzati prima di qualsiasi campione dializzato vengono iniettati. La curva standard generata deve avere un R2 ≥ 0,99.
    6. La maggior parte delle apparecchiature che utilizzanoè stato acquistato attraverso Varian, Inc., che è stata acquisita da Agilent Technologies nel 2010. In questo momento, Bruker Strumenti scientifici ottenuti Varian laboratorio di gascromatografia affari strumenti. Per gli acquisti futuri, consultare entrambe le società.
    7. Il protocollo attuale mostra un comportamento operante con i ratti, ma lo spettatore deve essere consapevole che più interruzioni di comportamento è probabile che si verificano con il modello più piccolo topo. Un altro aspetto da considerare è che l'inserimento di una sonda da microdialisi in altre regioni del cervello che la corteccia prefrontale mediale e nucleo accumbens può interrompere un comportamento operante in misura maggiore rispetto a quanto mostrato qui. E 'importante esaminare attentamente numerosi parametri comportamentali per determinare se il danno causato dal posizionamento della sonda produce gravi alterazioni nel comportamento.

    Disclosures

    Questo articolo è stato finanziato dal Med Associates, Inc.

    Acknowledgments

    Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH / NIAAA (AA11852 e AA007471).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    Microdialisi di etanolo durante la determinazione operante auto-amministrazione ed etanolo etanolo mediante gascromatografia
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    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

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