Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Mikrodialys av etanol under operant etanol självadministrering och etanol bestämning med gaskromatografi

doi: 10.3791/4142 Published: September 5, 2012

Summary

En metod för att bestämma tidsförloppet för etanol koncentration i hjärnan hos råttor under operant etanol självadministrering beskrivs. Gaskromatografi med flamjonisering detektering används för att kvantifiera etanol i dialysatet proverna, eftersom det har den känslighet som krävs för de små volymer som genereras.

Abstract

Operant självadministrering metoder används ofta för att studera beteendemässiga och farmakologiska effekter av många droger, inklusive etanol. Emellertid är etanol typiskt själv administreras oralt, i stället för intravenöst liksom många andra droger. Farmakokinetiken av oralt administrerade läkemedel är mer komplexa än intravenöst administrerade läkemedel. Eftersom förstå sambandet mellan de farmakologiska och beteendemässiga effekter av etanol kräver kunskap om tidsförloppet av etanol når hjärnan under och efter att ha druckit, använder vi in ​​vivo mikrodialys och gaskromatografi med flamjonisering upptäckt att övervaka hjärnans halter dialysat etanol över tiden.

Kombinerade mikrodialys-experiment beteende innebär användning av flera tekniker. I den här artikeln, stereotaktisk kirurgi, beteendemässiga utbildning och mikrodialys, som kan anpassas för att testa en mängd egen administration och neurochemical centrerad hypoteser, ingår endast för att illustrera hur de förhåller sig till de efterföljande faserna av provtagning och dialysat etanol analys. Dialysat analys etanolkoncentration genom gaskromatografi med flam-jonisering detektering, vilket är specifikt för etanol studier beskrivs i detalj. Data som produceras med dessa metoder visar mönstret av etanol når hjärnan under den egna administrationen förfarande, och när det paras ihop med neurokemiska analyser av samma dialysat prover, innebär att slutsatser kan göras om de farmakologiska och beteendemässiga effekter av etanol.

Protocol

1. Stereotaktisk kirurgi

  1. Alla förfaranden följer NIH Guide för vård och användning av försöksdjur och godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén.
  2. Med hjälp av en stereotaktisk apparat, väl hanterade Long-Evans råttor sövda med isofluran, implanteras med en 21-gauge kanyl (för senare microdilaysis sond insättning) (Plast One, Roanoke, VA) över hjärnan regionen av intresse och ett tjuder bult är inbyggd i huvudet stadiet (används för att stödja mikrodialys utrustning).
  3. Övervaka råttor omsorgsfullt under och efter operationen. Se till att alla djur får minst en vecka av post-kirurgisk vård och återhämtning och är friska innan följande procedurer. En JUPITER video av stereotaktisk kirurgi metoden är tillgänglig. 1

2. Operant träning

  1. Efter en vecka av postoperativ återhämtning djuren tränas att bända press för 10% sackaros solutioN i en Med Associates operant kammare (MedAssociates, Inc., Vermont, USA) utrustad med en lickometer, infällbar arm, och sipper rör (som tidigare beskrivits i Howard et al., 2009). har 2 Programvara från MedAssociates används för att utforma alla operanta program (MedAssociates, Inc., Vermont, USA).
  2. När utbildade att svara för sackaros, börja råttor på ett lämpligt träningsschema under vilken etanol gradvis till lösningen över flera dricka sessioner.
  3. Till exempel använder vårt laboratorium för närvarande en 8-dagars träning schema där etanol bleknat i lösningen kulminerar i en 10% etanol / 10% sackaros dricka lösning. Kontrolldjur erhåller endast 10% sackaros eller ingen dricka lösning. Den specifika typ av operant schema som skall användas kan variera inom vida gränser, men de allmänna förfaranden som beskrivs nedan för mikrodialys provtagning kan fortfarande utföras. 3

3. Pre-mikrodialys Förfarande: tethering

Natten före den näst sista träningspass (i vårt exempel är den 7: e träningspasset), djuren vana vid tjuder våren, som fästes på tjuder bulten på huvudet scenen. Fjädern fäster på mikrodialys svivel och motvikt hävarm, som är upphängd bredvid buren med en ring stativ och klämmor så att djuret kan röra sig fritt inom sin bur. Bundna djur tillbringar natten i operant rummet, i sitt hem bur med ad libitum mat och vatten, att vänja dem till uppbindning set-up.
  • Följande dag, avslutar råttan sitt operant program med tjudret på plats, för att vänja djuret till känslan av förankringstrossen när de utför sina beteendemässiga uppgifter. Montera tjudra anordningen till väggen hos operanta kammaren nära toppen för att tillåta suspensionen av förankringstrossen och svivel ovanför centrum av taket på operant kammaren. Allt detta är placerad inuti den ljuddämpande kammaren. After sessionen tillbaka råttan till sitt hem bur i operant rummet för att invänta microdiaysis sond insättning.
  • 4. Pre-mikrodialys förfaranden: mikrodialyssond sätts in dagen före mikrodialys försöket, efter råttan har avslutat beteendemässiga utbildning för dagen

    1. Dagen före mikrodialys försöket har efter råttan slutfört en operant session medan bunden, söva råttan med isofluran och ta obturatorn från guiden kanylen. Långsamt (under ~ 5 minuter) infoga en mikrodialyssond, perfunderades med artificiell cerebrospinalvätska (ACSF), genom den kraniala guiden kanylen in i hjärnan regionen av intresse. Vi använder laboratorie-konstruerade prober och förfaranden mikrodialys modellerade efter Doyon et al., 2003, och Pettit och rättvisa, 1991. 3, 4
    2. Använd den tidigare diskuterade anordningen tjudra att avbryta inlopps-och utloppsledningar för sonden ovanför djuret.
    3. Vrid probe flödeshastighet ner till 0,2 pl / min. Återigen tillbringar råttan natten i operant rummet.

    5. Mikrodialys Förfarande: insamling av prover vid självadministrering session med appetitive och consummatory separerade faser

    1. Minst 2 timmar innan experimentet påbörjas, skruva upp sonden till sitt arbetsläge flödeshastigheten. Vi använder antingen 1,0 eller 2,0 pl / min beroende på hjärnan regionen. Kontrollera att sonden flödeshastigheten är konsekvent, och minst 90% av det inställda flödet genom att använda en Hamilton-spruta för att mäta volym över tid.
    2. Dialys prover (5 eller 7 min) tas före, under och efter operant sessionen. Samplingsintervallet beror på hjärnan regionen, varvid signalsubstansen analyseras, dialysat koncentrationen av analyten, och känsligheten för den analytiska kemin utrustning som skall användas för analysen. De beteendemässiga faserna är följande:
      1. Baseline: I början av experiment,samla dialys prover i djurets hembur (4 prover).
      2. Överföring: Efter uppsamling av baslinjen hembur prover, överföra råttan till operant kammaren. Överföring av bundna råttan kräver extrem försiktighet för att se till att mikrodialys vätskeöverföring linje inte fastna, och att råttan är lugn. Omedelbart efter överföringen, aktivera operant programmet när du ändrar från baslinjen / överföring prov till den första vänta provet.
      3. Vänta: Fortsätt att samla in prover som råttan väntar på spaken för att sträcka sig in i kammaren (3-4 prover beroende på hjärnan regionen).
      4. Dricker: Efter spaken presenteras och trycker på en flaska dricksvatten lösning (10% sucrose/10% etanol eller 10% sackaros) tillgängliga för råttan i ca 20 minuter (3-4 prover).
      5. Post-dryck: Efter dryck period förblir flaskan dras, men råtta in operant kammare i ca 20 minuter (3-4 prover).

    6. Mikrodialys Förfarande: Beredning av mikrodialys prov för etanol analys

    1. Två prover före djur själv administrera etanollösningen, och alla prover efter, utvärderas för etanolkoncentration. Pipett antingen 1 eller 2 ul alikvot från provet av intresse i en 2 ml glasflaska. Sedan försegla flaskan med en lufttät skiljevägg (9 mm Röd Poly skruvlock, PTFE / Sil Septa, Agilent Technologies). Volymen av etanol analysen alikvot (1 eller 2 | il) beror på den totala provvolymen, och provets volym som erfordras för ytterligare analyser.
    2. Om proven ska användas för senare neurokemisk analys, lagra provet lämpligt efter pipettering portionen för etanol kvantifiering.
    3. Till exempel, analyserar vårt laboratorium proverna för dopamin. För att åstadkomma detta, placeras proverna på torris under experimentetoch sedan, lagra proverna vid -80 ° C efter experimentet. Vi använder 2 il alikvoter för etanol analys av en 5 min prov samlas med användning av en flödeshastighet av 2,0 pl / min för prober placerats i nucleus accumbens. Detta möjliggör åtminstone 7 il kvar för senare analys av dopamin genom högupplösande vätskekromatografi med elektrokemisk detektion.
    4. För prover från prefrontala cortex, som har mycket lägre extracellulära dopaminkoncentrationer använder vi en 1 pl alikvot för etanol analys tas från en 7-min prov med en flödeshastighet på 1,0 pl / min.

    7. Post-mikrodialys förfaranden

    1. Efter ingående av mikrodialys experiment söva råttan och ta bort sonden. Byt obturatorn om djuret inte omedelbart avlivas. Samla hjärnan inom tre dagar efter experimentet. Annars kan visualisering av sonden tarmkanalen inte vara möjligt.
    2. Hjärnan bör tas bort iN enlighet med godkända protokoll djur. Vi använder natriumpentobarbital (150 mg / kg, ip) överdos, följt av hjärt perfusion med saltlösning och därefter formalin i koksaltlösning. Sänk hjärna i en formalin-saltlösning under minst 12 timmar före snittning.
    3. Koronalt avsnitt hjärnan i 100 nm skivor. Stain skivor med kresylviolett och granska för korrekt sond placering. 5, 6

    8. Analys av prover för etanol koncentration

    1. De insamlade proverna samt externa standarder (0,3125 till 20 mM etanol) körs på vår gaskromatograf med flamjonisering detektionssystem. Detta system består av en Varian CP 3800 gaskromatograf med en flamjonisationsdetektor, en Bruker (Varian) 8400 gasutrymme autosampler värmdes till 50 ° C, och en HP Innowax kapillärkolonn (30 mx 0,53 mm x 1,0 ^ m film tjock), med helium som mobil fas.
    2. Kromatogram registreras och analyseras med Chromatography program såsom Varian Star Kromatografi Workstation programvara som specifikt diskuteras här.
    3. För att förbereda systemet för etanol analys, värma den automatiska provtagningsanordningen plattan med hjälp av en recirkulerande vattenbad, och öppna de två ytterligare gastankarna (luft och väte, helium alltid lämnas igång för att bevara vaxet kolumnen).
    4. Spela trycket gastank samt antalet prover du tänker köra så att du kan hålla räkningen på hur många gånger fiber och septum har använts så att de kan ändras när lämpliga (fiber-500 injektioner, septum -100 punkteringar).
    5. Initiera starten metod, som förbereder systemet att köra prover (program parametrar i tabell 2). Vänta tills systemet att rapportera att det är "Klar".
    6. Initiera en 20-min "bränna", som förbereder fibern för provanalys genom att underkasta den en hög temperatur för att desorbera eventuella föroreningar har absorberat i vila.
    7. Standarder framställs genomspädning 238 pl 95% etanol med vatten till en slutlig volym av 100 ml med användning av en volumetrisk kolv i en kemisk draghuv. Detta skapar en 40 mM etanol-lösning. Vi använder en 1:1 serieutspädning att skapa 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,3125 mM standarder. För varje koncentration av standard använder samma volym alikvot som tas från dialys prover. Pipettera portionen i en 2 ml glasflaska, och sedan försegla flaskan med en lufttät septum.
    8. Samtliga etanol prover upphettas i autosamplern tills hela vätskan alikvoten har förångats. Vi värmer våra prover för cirka 30 minuter.
    9. Det här avsnittet beskriver programvaran Star Workstation som vi använder med vår gaskromatograf. Annan programvara kan användas, men beskrivningen nedan kan inte tillämpas.
    10. Om du vill köra prover, skapa en lista med exempel notera vilka prov är där autosampler kortplats och hur många gånger provet ska punkteras. Var noga med att dirigera datafiler till din valda vikningER. Välj sedan metoden för dina prover, och börja springa. Vi använder de löpande parametrar anges i tabell 2.
    11. Vår dialysat etanol programmet absorberar provet i 3 minuter och desorberar in helium strömmen, som matar in vaxet kolumnen under 1 minut. Dock kan program skrivas för att tillgodose dina specifika behov.
    12. Provkomponenterna separata i vaxet kolumnen, och sedan gå igenom flamjoniseringsdetektorn där kolinnehållande föreningar, såsom etanol, och förbränna frisättning joner. Detta resulterar i ökat elektronflöde från detektorns anoden till katoden skapar en ström, som omvandlas till spänning och resulterade i att kromatogram som det som visas nedan (figur 1). Förändringen i spänning är proportionell mot mängden kol som passerar genom detektorn över taget.7
    13. När systemet har körts de prover måste du kontrollera integrationen av varje topp. För Star Workstation,klicka på den blå toppen ikonen i verktygsfältet. Klicka på varje topp färg och dra pilarna för att justera baslinjen. Återintegrera varje topp innan du flyttar till nästa grupp av toppar. Toppen analysprogram kan vara någon allmän kromatografi programvara.
    14. För Star Workstation, klicka på satspost ikonen i verktygsfältet. Dra varje prov från angiven mapp till det parti rapporten att skriva ut provet rapporter. Rapportering programvara kan anpassas med de vanligaste systemen kromatografi programvara.
    15. Rapporterna kan programmeras för att visa information som du väljer. Vi använder för närvarande topphöjd, men rapporterna kan också programmeras för att använda topparea.
    16. Att stänga av systemet, initiera avstängning metod (parametrar anges i tabell 2), stäng av vattenbadet och stäng väte och luft tankar när kolonnugn temperaturen når 30 ° C.

    9. Etanol Data

    1. Plotta topphöjden somen funktion av varje känd yttre standard etanolkoncentration (figur 2A). Använd den linjära funktionen som ges av dessa punkter för att beräkna etanolkoncentrationen från topphöjden som varje dialysat prov.
    2. Genom att plotta koncentrationen av etanol i dialysatet över tid kan vi se mönstret av etanol nivåer i hjärnan regionen av intresse under våra beteende session. Exempel data visas nedan (Figur 2B), representeras som den koncentration av etanol i dialysatet över tiden under självadministrering sessionen.

    10. Allmänt underhåll: Fibern ska bytas var 500 punkteringar, och membranet var 100 punkteringar

    För att ändra fiber

    1. På gaskromatograf knappsatsen trycker du på Meny, väljer 8400, trycka på enter, välj ändra spruta, tryck retur. Den autosampler kommer att positionera sig för att tillåta fibern (SPME Fiber församling, 75 um Carboxen-PDMS, Supelco Analytisk, BellefoNTE, PA) som skall avlägsnas.
    2. Öppna luckan som täcker fibern. Skruva loss låsmuttern, och flytta spärren för att tillåta fiberenheten tas bort. Ta fiberenheten ut. Skruva av muttern som håller fibern i församlingen, och sedan skruva fibern.
    3. Byt ut det gamla fibern med ett nytt, och återmontera fiberenheten. Ersätt aggregatet i autosampler, åter låsande och skruva aggregatet på plats. När du är klar, tryck på "ändra klar" på knappsatsen och autosampler kommer färdig själv för användning.

    För att ändra septum

    1. Först skruva av locket som täcker membranet (Hi-Temp 0,450 Dia. Generisk Konditionerad Septa, Varian) och sedan ta bort den gamla septum. Seat den nya septum ner i kopplingen. Re-skruva locket och dra åt den med nyckel. Använd sedan en injektionsnål att punktera membranet, så att fibern inte kommer att bryta den första gången skiljeväggen punkteras.
    2. 11. Representativa resultat

      Figur 1 visar exempel på kromatogram för tre koncentrationer av etanol standarder och för en råtta dialysat uppsamlat i slutet av etanol egenadministration sessionen. Etanol toppar bör vara relativt symmetrisk, har konsekventa retentionstider, och en signal till brusförhållande> 10. Underlåtenhet att uppfylla dessa kriterier innebär att ditt system kräver underhåll. Kvalitet kromatografi och korrekt beredda standarder ger en linjär standardkurva (R2 ≥ 0,99, figur 2A) som används för att beräkna etanol koncentrationen av dialysat prover som tagits från etanol själv administrera djur under loppet av sin egen administration session (Figur 2B) .

      Figur 1
      Figur 1. Exempel kromatogram. En mikroliter av etanol standard eller dialysat provet laddades i en gas chromatograph flaskan och analyserades såsom beskrivs i texten. A) Överlagring av toppar genererade från 2,5, 5,0 och 10 mM etanol standarder. B) Peak genereras från ett dialysat prov från en råtta som har själv administrerat etanol.

      Figur 2
      Figur 2. Grafiska resultat från exempel experiment som visas i figur 1. A) Etanol standardkurva. B) Tid under dialysat etanol koncentration över en etanol självstyre session.

      <tr>
      Hårdvara Parameter Start-up inställning Köra inställning Vilande inställning
      8400 Bruker (Varian) Autosampler
      Injektion läge SPME SPME N / A
      Lösningsmedel penetrationsdjup 0% 20% N / A
      Prov penetrationsdjup 20% 20% N / A
      Absorptionstid 0,01 min 3 min N / A
      Desorption tid 19 minuter 1 minut N / A
      Rengör läge lösningsmedel källa Jag Jag N / A
      Clean-läge adsorption och desorption tid 0,01 min 0,01 min N / A
      Vattenbad (värmer autosampler) * 50 ° C 50 ° C Av
      CP-3800 Varian gaskromatograf
      Injektor Ugn Ugn makt
      Ugnstemperatur 250 ° C 220 ° C 30 ° C
      Kolonnugn Stabilisering tid 0,10 min 0,10 min 0.10min
      Temperatur 65 ° C 65 ° C 30 ° C
      Kolumn Mobil fas flödeshastighet 8,5 ml / min 8,5 ml / min N / A
      Kolonntryck ~ 6 psi ~ 6 psi ≥ 0,1 psi
      FID-detektor Ugn makt
      Temperatur 220 ° C 220 ° C 120 ° C Elektronik Av
      Tidskonstant Snabb Snabb Snabb
      Räckvidd 11 11 11
      Autozero Ja Ja Ja

      Tabell 2. Gaskromatograf med detektions flamjonisering systemparametrar. Denna tabell visar parametrarna för de tre programmen som används för att förbereda (Startinställningar), köra (kör inställningar) och underhålla systemet när den inte används (vilande inställningar).

    Discussion

    Ansökan och begränsningar

    Drug självadministrering används i gnagare till modell narkotikamissbruk. Många droger som modelleras på detta sätt kan administreras intravenöst, i vilken läkemedlet avges direkt till den centrala avdelningen. Detta möjliggör noggrann övervakning av dosen under en egen förvaltning session. Eftersom etanol är vanligtvis oralt själv administrerad, är det mycket svårare att övervaka läkemedelsnivåer beroende på individuella skillnader i absorption och metabolism. Genom att använda mikrodialys för prov från hjärnan regionen av intresse, är vi inte bara kan övervaka mönstret av etanol når regionen, men vi har även möjlighet att samtidigt övervaka neurotransmittorer förändringar i samma region över tiden under varje självstyre fas.

    Neurokemiska förändringar och narkotikainducerade svar i hjärnan är förknippade med drogmissbruk och beroende, vilket innebär möjlighet att samtidigt åtgäratt neurokemiska och koncentrationer läkemedel under vissa självadministrering faser ger ett mycket kraftfullt och unikt verktyg. En fråga att tänka på för att korrelera dialysat koncentrationer av analyter med beteende är de fysiska egenskaperna hos mikrodialys VVS. Specifikt, är den tid det tar för vätska att överföras från lumen av mikrodialyssond till uppsamlingsröret kritiska, och kortare tider är bättre. I vårt labb, konstruerar vi sonderna så att tiden är ca 90 sekunder. Med hjälp av dessa villkor, har vi funnit att det finns en accumbal dopamin ökar vid initiering av etanol förbrukningen, vilket minskar under loppet av drycken och efter dryck perioder som dialysatet ökar etanolhalt. 2,3,8,9 Dessa experiment i kombination med data från farmakologiska studier har gett oss möjlighet att tolka de strikt farmakologiska effekter av etanol och självförvaltning tillhörande miljö-signaler på CHAnges i signalsubstans koncentrationer.

    Det bör noteras att denna speciella tillämpning av kombinerade beteende-mikrodialys teknik passar dagens forskning intressen vårt laboratorium. Den är utformad för att utvärdera den tidsmässiga mönstret av etanol når hjärnan i jämförelse med mönstret neurotransmittor förändringar i samma region, så att vi kan relatera dessa åtgärder till synkrona egenadministrering beteenden. De härledda dialysat etanolkoncentrationer inte korrigerat för in vivo-prob återhämtning, och är bara en bråkdel av hjärnan etanol vävnadskoncentration. Om kvantitativ mikrodialys av etanol erfordras, bör extraktionen fraktionen av etanol som diffunderar från det extracellulära utrymmet in i sonden bestämmas experimentellt. Se tidigare publikationer från vårt laboratorium för metoder och ytterligare diskussion. 10,11,12

    Även om detta protokoll visar användningen av gas chromatography tillsammans med fast fas microextraction av etanol från huvudutrymmet av mikrodialys prover, kan andra metoder för analys av etanolhalt av mikrodialys prov användas. Emellertid kan alternativa metoder lider av vissa nackdelar. Exempelvis kan mindre känsliga analytiska metoder kräver en större provvolym som kräver provtagning gånger större än den 5-7 min illustreras här. Den typ av system som diskuteras här använder en fast fas microextraction som koncentrerar etanolen i ångfas i den förseglade provampullen genom att absorptionen till fibern placeras i flaskan gasutrymme. Detta förbättrar detektionsgränsen jämfört med direkt huvudutrymmet provtagning som typiskt medger 50-100 mikroliter av ångan som skall injiceras. En annan stor fördel med huvudutrymmet metoden är att provet injiceras för analys är extremt ren och fri från salter. Direkt injektion av det flytande provet mikrodialys kan också användas med högre sensitivity, men detta kommer att kräva mer instrument ner tid på grund av regelbundet underhåll som krävs för att rensa de injicerade salter.

    Felsökning och andra anteckningar

    1. Innan experimentet börjar ge dig själv gott om tid att kontrollera att dina mikrodialys uppställningar fungerar korrekt och att felsöka eventuella problem. Vi föreslår att du har en extra set-up, perfunderades med ACSF, redo att byta ut med en felaktig installation för att spara tid, eftersom de flesta operanta sessioner tenderar att inträffa vid en viss tid varje dag.
    2. Vara säker på att mikrodialys sonderna införes under en period av ca 5 minuter för att minimera vävnadsskada produceras genom skjuvning av vävnaden som sonden penetrerar hjärnan.
    3. Vid överföring råttan i operant kammare är det bra att ha en andra person hjälpa så att överföringsledningen (del av mikrodialys installation) inte blir trassligt, och så att operant programmet kan initiated i tid.
    4. Se till att du ger autosampler mycket vattenbadet om tid för att nå en lämplig temperatur. Vårt system kräver vanligtvis två timmar att nå 50 ° C. Också se till att dina prover helt förångas innan analysera proverna. Vi vanligtvis visuellt bekräfta att detta har inträffat innan behandling provanalysen.
    5. Standard god analytisk kemi praxis bör följas. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till, validering av individer, utrustning och förfaranden. I korthet, använder vi följande riktlinjer: Enskilda användare bör visa förmåga att generera reproducerbara topphöjden värden för standardkoncentrationer och linjära standardkurvor (R2 ≥ 0,99) över flera dagar. För att verifiera GC-FID-systemet fungerar är att standarderna är alltid analyseras innan dialysatet prover injiceras. Standardkurvan genereras bör ha en R2 ≥ 0,99.
    6. De flesta av den utrustning vi använderköptes via Varian Inc., som förvärvades av Agilent Technologies under 2010. Vid denna tidpunkt fick Bruker Scientific Instruments Varians laboratorium gaskromatografi instrument verksamhet. För framtida inköp, kontakta antingen företaget.
    7. Det nuvarande protokollet visar operant beteende med råttor, men betraktaren bör vara medvetna om att mer störningar av beteende sannolikt kommer att ske med den mindre musmodell. En annan fråga att vara medveten om är att placeringen av en mikrodialyssond i hjärnan andra regioner än den mediala prefrontala cortex eller nucleus accumbens kan störa operant beteende i större utsträckning än vad som visas här. Det är viktigt att noggrant undersöka många beteendemässiga parametrar för att avgöra om skador som orsakats av sond placering ger allvarliga beteendeförändringar.

    Disclosures

    Denna artikel har finansierats av Med Associates, Inc.

    Acknowledgments

    Denna forskning har finansierats med bidrag från NIH / NIAAA (AA11852 och AA007471).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    95% Ethanol AAPER Alcohol and Chemical Co., Shelbyville, KY E190, 111000190
    Ultra-Pure Sucrose MP Biomedicals, LLC, Solon, OH 821721
    Ultra High Purity Helium Air Gas HE UHP300
    Air Air Gas AIZ300
    Hydrogen Air Gas AIZ300
    GC 2 ml vials Agilent Technologies #8010-0015
    GC vial caps with PTFE/silicone septa Agilent Technologies #8010-0084
    Table 1. Specific reagents

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).
    2. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).
    3. Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration. Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).
    4. Pettit, H. O., Justice, J. B. Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens. Brain Res. 539, 94-102 (1991).
    5. Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. Academic Press Inc. (1998).
    6. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Academic Press Inc. (1986).
    7. Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. Principles of Instrumental Analysis. 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).
    8. Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens. J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).
    9. Carrillo, J., Gonzales, R. A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling. Alcohol. 45, 559-5566 (2011).
    10. Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration. Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).
    11. Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain. J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).
    12. Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum. Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).
    Mikrodialys av etanol under operant etanol självadministrering och etanol bestämning med gaskromatografi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).More

    Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (67), e4142, doi:10.3791/4142 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter