Summary
Noroviruses들이 특성화를위한 위장염 아직 분자 기술의 주요 원인은 아직 비교적 새로운입니다. 여기 murine 노로 바이러스 (MNV), 세포 배양에서 증식 수있는이 속의 유일한 구성원의 효율적인 복구를위한 두 개의 역방향 유전학 방법을보고합니다.
Abstract
인간 noroviruses 인간 위장염 (GE) 전 세계의 대부분의 경우에 대한 책임이며, 가까운 사람 대 사람의 접촉이 1, 2를 피할 수없는 환경에서 반복 문제입니다. 지난 몇 년 동안 병원에서 발병의 발병률 증가는 자신의 경영 능력뿐만 아니라, 큰 경제적 손실에 상당한 혼란을 초래보고되었습니다. 새로운 항바이러스 접근 방식의 식별은 세포 배양 3에서 생산적인 감염을 완료하는 인간 noroviruses의 무능력으로 인해 제한되었습니다. 밀접하게 인간의 노로 바이러스 네하지만 어떤 관련이 murine 노로 바이러스 (MNV)의 최근의 분리는 세포 5에서 증식 수있는 이러한 병원균 6, 7의 조사를위한 새로운 길을 열었습니다.
새로운 긍정적인 감각의 게놈과 subgenomic RNA 분자의 합성에 MNV 복제 결과, 후기 지난 생에 해당바이러스 게놈의 RD (그림 1). MNV는 ORF1은 게놈의 대부분을 점유하고 polyprotein 전구체에서 발표된 일곱 비 구조 단백질 (NS1-7) 인코딩 중 네 가지 열린 독서 프레임 (ORFs)를 포함합니다. ORF2 및 ORF3는 subgenomic RNA 지역 내에 포함된 및 capsid 단백질 (각각 VP1과 VP2) (그림 1) 인코딩됩니다. 최근, 우리는 ORF2 중복되는 추가 ORF4을 확인하지만, 색다른 열람 프레임에 기능이며, mitochondrial화된 독성 계수 (VF1) 8을 위해 인코딩했습니다.
noroviruses 포함하여 긍정적인 감각 RNA 바이러스, 대한 복제는 새로운 uncapped RNA의 genomes의 합성 결과 세포질에서 이루어진다. 바이러스 번역을 촉진하기 위해 바이러스가 세포의 단백질 합성 기계 9-11을 모집 겨냥한 다양한 전략을 악용. 흥미롭게도, 노로 바이러스 번역은 다기능 바이러스성 단백질 프라이머의 VPg에 의해 주도되고covalently 게놈과 subgenomic RNAs 12-14 모두의 5 '끝에 연결되어. 번역의 이러한 복잡한 메커니즘은 기존의 역방향 유전학 방법에 의한 바이러스 복구의 제한된 효율성의 주요 요소가 될 가능성이 높습니다.
여기 murine 노로 바이러스-1 세대 (이것과 함께 MNV으로 함) 5 '끝에 공을 성적을 바탕으로 두 가지 전략을보고합니다. 두번째 접근법은 T7 RNA 중합 효소의 표현 세포의 cDNA MNV의 해독을 수반하는 반면 방법 중 하나는 체외 합성과 바이러스의 RNA의 상한을 모두 포함합니다. MNV의 연구와 작은 동물 모델에 대한 이러한 역방향 유전학 시스템의 가용성 복제 및 pathogenesis 15-17에서 바이러스 시퀀스의 역할을 해부하기 위해 전례없는 능력을 제공합니다.
Protocol
1. RNA 전사 및 감염성 MNV의 복구에 대한 상한
이 프로토콜은 시험 관내 전사 및 (섹션 1.1) 상한 체외 년 이후의를 통해 cDNA로부터 전염성 MNV의 효율적인 복구를 허용하도록 설계되었습니다. 결과로 뒤덮힌 성적은 다음 전염성 MNV합니다 (섹션 1.2와 1.3) 복구하는 세포로 transfected 있습니다. 이 접근법은 35mm 당 10 5 전염성 단위 (직경) - 요리 MNV위한 세포를 초과하는 전형적인 수율과 MNV의 회복에 가장 민감한 방법을 제공합니다. 프로토콜은 아래에 자세히 설명됩니다 :
전염성 뒤덮힌 MNV 성적 증명서 1.1 합성 :
- Nhe로 전 선형 DNA를 얻기 위해 Nhe을 나는 MNV 게놈의 3 '끝에 polyA 꼬리 (그림 2) 이후에 고유한 제한 사이트를 인식합니다. : 야생 유형이 cDNA MNV (MNV 3'Rz pT7) 포함하는 플라스미드를 소화. Linearised plasmids은 일반적으로 정화된다실리카 컬럼 (GE 헬스케어의 예 GFX PCR DNA 젤 밴드 정제 키트)를 사용하고 H 2 O에에 eluted과
- 시험 관내에 이전에 17 설명된대로 T7 RNA의 효소를 사용하여 linearised 벡터를 고쳐 쓰다. 많은 상용 키트는 이러한 목적으로 사용할 수 있으며 이러한 MEGAScript (생명 기술)와 RiboMAX (Promega)와 같은 RNA 합성 대량의 재현성 방법을 제공합니다. 전사 반응은 일반적으로 DNAse 추가로 분석하기 전에 소화되며 효율적으로 DNA를 침전하지 아래에 설명된대로 그러나 많은 경우 이것은 염화 리튬의 purifications로 필요하지 않습니다.
- RNA의 전사 반응의 작은 나누어지는 분석, 일반적으로 전사 반응을 보장하는 아가로 오스 겔 전기 영동에 의한 이하 0.5 μl하거나, 효율적으로 작동하여 RNA는 전체 길이입니다. 많은 사용자가 올바르게 크기가 RNA로 젤을 denaturing 실행하는 것이 좋습니다하는 동안, 우리는 일반적으로 아가로 오스 겔 electrophor에게 비 denaturing을 사용RNA 무결성을 분석하는 빠른 방법으로 esis. 같은 전염성 cDNA 클론 pT7에서 생산된 MNV의 게놈 : MNV 3'Rz가 아닌 denaturing 아가로 오스 겔 (그림 3)에서 dsDNA 사다리에 상대적으로 약 3 Kbp에 게재됩니다.
- 다른 방법은 같은 애질런트의 bioanalyser (그림 3)를 사용으로 RNA 무결성의 빠른 분석을 얻기 위해 대안으로 사용할 수 있는지 고려하십시오.
- 너무 많은 RNA가로드되면 그 불쌍한 겔 해상도가 발생할 수 있습니다. 아가로 오스 겔은 밴드의 해상도에 영향을 미칠 수있는 전기 영동 중에 RNA 저하를 피하기 위해 RNAse없는 시약을 사용하여 준비하기 위해 큰주의를 기울입니다. 65 RNA를 가열 ° C ~ 또 어떤 경우에 도움이 될 수 있습니다 얼음에 냉각하여 따라갔다.
- 비법인 세포핵을 제거하는 RNA 샘플을 정화. 많은 방법이 프로토콜에 우리가 일반적으로 비용 효과적인 대안으로 염화 리튬을 사용하지만이 포함한 실리카 컬럼 기반 접근 방식에 대해 사용할 수 있습니다. 용이 목적은, 100 μl의 최종 볼륨을 달성하기 위해 H 2 O를 추가하고 리튬 염화물 침전 용액 (7.5 M LiCl, 50 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0, Ambion) 40 μl를 추가하고에서를 위해 -20 ° C에서 샘플을 저장 적어도 30 분.
- 4에 12,000 X g에서 원심 분리하여 펠렛 RNA ° C ~ 15 분입니다.
- 반투명 RNA 펠렛을 방해하고 70 % 에탄올 150 μl에 씻어하지 돌보는 뜨는을 제거합니다. 15 분 동안 4 ° C에서 12,000 X g에서 튜브를 원심 분리기.
- , 에탄올과 공기 건조 RNA를 제거 완전히 이것으로 밖으로 건조 펠렛을 피하는 것은 resuspension 어렵게 만들 것입니다.
- 그런 다음 RNA 스토리지 솔루션 (Ambion)의 50-100 μl로 MNV 기록을 resuspend. 관리는 모두 RNA가 제대로 녹아있다 보장하기 위해 이동해야합니다. RNA가 완전히 용해하기 어려운 나타납니다, 60 샘플을 가열하는 것은 ° C에서 그것을 resuspend하는 데 도움이 될 수 있습니다. 모든 불용성 물질 그런 다음 B에게 삭제되어야부량을 RNA하기 전에 바깥 원심 분리. 정화 성적표는 uncapped 및 (ScriptCap의 677 상한 시스템, Epicentre의 Biotechnologies) 전염성이 될 체외 상한 단계의 후속을 요구하고 있습니다.
- 분광 광도법에 의해 RNA를 정량. 전사 반응의 성격과 규모에 따라, 전형적인 수율은 100 μl 전사 반응 당 RNA의 50-150 μg부터 다양합니다. RNA의 무결성은 1 % 아가로 오스 겔 (그림 3)에 시료의 100-300 NG를 실행하여 상한 반응하기 전에 분석해야합니다.
- 상한 RNA의 효율성을 개선하기 위해 다음 열 60-70 65 MNV RNA의 성적 μg ° 10 분을위한 C와 얼음에 즉시 튜브를 넣습니다. 이 단계는 상한의 RNA 구조의 억제 효과를 줄일 수 있습니다. 가열 단계에서 형성된 방울을 수집하기 위해 냉장 microfuge에 튜브를 펄스.
- 제조 업체 (ScriptCap 677 제안한대로 상한 반응 혼합물을 준비상한 시스템, Epicentre의 Biotechnologies). 간단히, 100 μl의 최종 반응 볼륨 MNV RNA의 60-70 μg를 추가합니다. 상한 반응 믹스 버퍼를 상한 10 × 10 μl (500 MM TrisHCl 산도 8.0, 60 MM KCl, 12.5 밀리미터 MgCl2), 10 MM GTP의 10 μl, Scriptguard 20 MM S-adenosyl 메티오닌, 2.5 μl의 0.5 μl를 포함할 수 있습니다 (100 단위) 및 Scriptcap 효소 4 μl (40 단위).
- 설정 반응 중에 저하를 피하기 위해 얼음에 대한 기록을 RNA 유지. 잘 반응 혼합물을 섞어서하고 한 H에 대해 37 ° C에서 품어. 반응의 크기가 필요 뒤덮힌 성적표의 크기에 따라 조정 될 수 있습니다.
- LiCl의 석출에 의해 RNA를 정화하는 것이 아니라 (포인트 1.1.6 참조) 위의 설명했다. RNA 스토리지 솔루션 (Ambion)의 50-100 μl에 펠릿를 해산하고 RNA의 양을 정량. 일반적으로 RNA 샘플은 이후 1 μg / μl로 정규화됩니다. 다시 말하지만, 모든 RNA가 제대로 녹아있다 확인하십시오. 그것이 제대로 해소되지 않은 경우 열을 t그는 샘플 60 ° C의 해산을 허용합니다. 원심 분리에 의해 부량을 RNA하기 전에 어떤 불용성 물질을 제거합니다.
- transfection 단계로 진행하기 전에 다시 RNA의 무결성을 확인합니다. 이러한 목표로, 1 % 아가로 오스 겔 (그림 3)에 시료의 100-300 NG의 금액을 실행합니다.
Raw264.7 세포에 RNA의 신세기-매개 transfection하여 1.2 복구 :
허용 세포주에서 MNV 전염성 virions의 복구를 위해 그것은 신세기 transfection 시스템 (Invitrogen)를 사용 Raw264.7 세포로 덮힌 MNV 성적표를 electroporate 수 있습니다. Raw264.7는 바이러스 복제 및 재 감염 이후의 여러 라운드를 지원 MNV 감염에 감염될 세포입니다. 그 결과, 일반적인 수율은 48 시간 후> 10 7 전염성 단위에서 24 시간 포스트 transfection지만 절정에 ML 당 10 5 전염성 단위 초과로 접근합니다.
- 트란 앞에 어느 날sfection, 종자 예상 50% confluency에서 Raw264.7 세포. 일반적으로 세포의 두 T75 flasks 3 transfections 필요합니다.
- transfection의 하루, 당신은 반복 pipetting하여 단일 세포 현탁액을 생성 확보 10 % 태아 송아지 혈청 (FCS)를 포함하는 Dulbecco의 수정된 독수리 중간 (DMEM)에 세포 monolayers을 다쳤어요.
- 비 실행 가능한 세포를 라벨에 trypan 파랑 제외를 사용 혈구계에서 가능한 세포의 농도를 결정합니다.
- 5 분 및 DMEM 8 X 10 6 세포 / ML의 최종 농도에서 10% FCS를 포함하는 그들을 resuspend위한 1,200 X g에서 펠렛은 세포.
- 이제 막 2 분 transfection 1,200 X g에서 펠렛들을 당 세포의 transfection, 나누어지는 한 ML 이었읍니다. 미디어를 제거하고 PBS 500 μl (MG 2 + / CA 2 +는 제외)에 세포를 씻는다. 2 분 동안 1,200 X g에서 다시 전지를 내려 봐. 그것이 가능한 한 동안 DMEM으로 세포를 유지하시는 것이 좋습니다 참고로 오랜 기간 동안 PBS에서 스토리지는 세포 생존과 transfection 속도를 손상 수 있습니다.
- 튜브에서 PBS를 제거하고 6 X 10 7 세포 / ML의 최종 농도로 resuspension 용액 130 μl (신세기 transfection 시스템 키트, Invitrogen)을 추가합니다. 케어는 transfection과 타협 세포 생존 중에 sparking 발생할 거품의 형성을 피하 세포를 resuspend로 연결됩니다.
- 세포 (그림 2)로 뒤덮힌 MNV 증명서의 해당 금액을 추가 뒤덮힌 RNA의 일반적으로 1.3 μg는 resuspended 세포와 혼합 부드럽게 130 μl에 추가됩니다. 그런 다음, 100 μl 네온 transfection 팁에 혼합물을 100 μl를 수집합니다. 특별한주의가이 실험의 실패의 원인이되므로 아무런 거품이 electroporation cuvette (신세기 transfection 시스템 키트를 100 μl 팁)에 형성되지 않도록 촬영해야합니다.
- 25 밀리초, EN을위한 1700 V에서 단일 펄스를 사용하여 세포를 Electroporate샘플에있는 거품의 존재를 나타낼됩니다 pulsing 동안 불꽃의 부재를 suring. sparking 사건이 발생한다에서 예제를 버리고 transfection를 반복합니다. 항생제 무료 DMEM 10 % FCS를 포함하는 1 ML을 포함 Eppendorf 튜브에 세포를 놓습니다. transfected 세포의 큰 숫자가 필요한 경우 각 끝에이 같은 RNA 샘플과 함께 세 번까지 재사 용할 수 있습니다.
- 이후 10 % FCS를 포함하는 prewarmed 항생제 무료 DMEM의 적절한 금액을 포함하는 독립적인 우물에 관에서 세포를 배포합니다. 300 μl는 12 접시 접시의 우물에 적합한 반면, 일반적인 지침으로서, 스텝 1.2.8 동안 생성되는 세포 현탁액의 150 μl는 prewarmed DMEM 0.5 ML을 포함 24 접시 접시의 잘 단일 대한 충분 prewarmed DMEM 1 ML을 포함.
- 37 세포를 품어 ° C와 10 % 24-72시간위한 CO 2. 그런 다음 하나 (또는 그 이상)에 의해 세포에서 전염성 virions을 풀어동결과 해동 사이클과 상패 분석이나 TCID50 중 하나를 사용하여 샘플에서 바이러스 titre을 결정합니다. lysates은 최대 속도 또는 그 전에 적정에 0.22 μm의 기공 필터를 통해 필터링하여 1~2분 동안 원심 분리에 의해 명확히해야합니다. 일반적으로 MNV는 최대 1 × 10 9-72시간 포스트 transfection 1 주위 X 10 6 24시간 포스트 transfection시 TCID50/ml 및 titres에 도달합니다.
- 존재와 pT7 도입 변이의 안정성 : MNV의 3'Rz는 일반적으로 Raw264.7 세포에서 2-5 추가 구절 후에 구출 바이러스를 순서에 의해 결정됩니다.
BHK-21 세포에 lipofection하여 1.3 복구 :
뒤덮힌 성적표에서 전염성 MNV의 회복을위한보다 직접적이고 자주보다 비용 효과적인 방법은 lipofection (Lipofectamine 2000, Invitrogen)를 통해이다. 우리가 일반적으로 oth의 활용 Raw264.7 세포 지질 기반 접근법을 사용 transfect하기 어려운 것을 감안할 때쉬운 음 등 아기 햄스터 신장 섬유아 세포에서 파생된 불후의 라인입니다 BHK-21과 같은 세포 라인을 transfect합니다. 이러한 세포 MNV 복제를 transfect 및 지원 쉽게 사그라 들자, 그들은 적절한 수용체 부족으로 저희 연구실에 표준 접근 방식으로서 우리 있도록 BSR-T7 세포, BHK-21 세포 라인의 파생을 사용 재 감염의 여러 라운드 . 결과적으로,이 시스템에서 생성된 바이러스 생산량은 바이러스 복제의 단일 사이클의 표시이다. 그것이 여러 transfections는 네온 - 중재 transfection에 있으며 전문 장비가 필요하지 않습니다에 비해 크게 감소 비용으로 수행할 수 있도록로서 바이러스 복구에 대한 돌연변이의 효과를 조사했을 때 이러한 접근 방식은 쓸모없는 것입니다. 그것은 인간의 배아 신장 293T 세포와 같은 다른 즉시 사용할 셀 라인은 또한 첫번째 효율적인 RNA 전달을 보장하기 위해 최적화되어야 MNV 그러나 transfection 조건의 효율적인 복구를 지원 협조할 것입니다.
- 트립신이세 BHK-21 세포 (또는 BSR-T7 전지), 종자 7.5 × 10 5 항생제없는 성장 미디어 35 밀리미터 직경 접시에 세포와 2 하룻밤 사이에 10 %의 CO와 37 ° C에서 세포를 품어.의 단일층 transfections는 시딩 같은 하루 계획하는 경우 각각의 접시에 세포의 양을 두 번, 그리고 세포가 10 % CO 2와 37 ° C에서 2~3시간에 대한 번호판을 준수하실 수 있습니다. 이 방법에 적합 다른 세포가 인간의 293T 세포, 인간 간세포암 Huh7 세포 및 아프리카의 녹색 원숭이 Cos7 세포를 포함합니다.
- 세포에서 미디어를 제거하고 transfection의 최대 효율을 보장하기 위해 항생제없이 신선한 매체의 3 ML로 바꿉니다.
- Opti-MEM (Invitrogen) 100 μl로 뒤덮힌 MNV 성적 1-2 μg의 혼합물을 준비하고 이전 Opti-MEM 100 μl에 섞인 Lipofectamine 2000 년 4 μl와 함께 섞는다. 15 배 아래로 그것을 pipetting과에 의해 철저하게 샘플을 섞는다. 남겨20 분 동안 상온에서 혼합.
- 세포 단일층에 드롭 현명한 방식으로 뒤덮힌 MNV 성적 증명서를 포함 transfection의 단지를 추가하고 부드럽게 수직 방향 판을 흔들어.
- 37 세포를 품어 ° C와 10 % 24-72시간위한 CO 2. 그 후, 동결에 의해 세포에서 전염성 virions을 공개하고 해동 및 상패 분석이나 TCID50하여 바이러스 titre을 결정합니다. 1 시경 X 10 6 TCID50/ml의 일반적인 수율에 도달하고 있습니다.
2. T7 RNA 중합 효소의 표현 세포의 cDNA로부터 감염성 MNV의 직접 회수
이 프로토콜은 전염성 플라스미드 은닉 세포로 표현 T7의 효소에 의해 전체 게놈 cDNA 서열의 해독에 의해 세포의 MNV의 회복을 허용하도록 설계되었습니다. 우리가 일반적으로 BHK-21와 BSR-T7 CE 가장 높은 수율을 얻을하지만, 서로 다른 세포 라인이 접근법에 의해 전염성 MNV를 복구하는 데 사용할 수 있습니다재편 15. 그들은 부모 BHK의 클론 라인보다 더 빠른 성장 때문에 우리는 일반적으로 BSR-T7 전지를 사용합니다. 세포는 바이러스 RNA와 전염성 바이러스의 후속 복구 (그림 4)의 표현을 추진하려면 헬퍼 바이러스 역할을 T7 RNA 중합 효소의 (FPV-T7) 18 fowlpox (FPV) 인코딩에 감염됩니다. 헬퍼 FPV-T7의 부재에서 MNV 3'Rz : BSR-T7은 세포 constitutively 급행 T7 RNA의 효소가 있지만이 표현은 pT7의 transfection 후 전염성 MNV를 구출하기에 충분하지 않습니다. 이 시스템의 전형적인 수율은 위에서 설명한 것보다 최소 10 배 저렴 하다니, 이러한 방식은 쇠약하게 변이의 식별을 허용하도록 심사 돌연변이 빠른 방법을 제공한다. 일반적으로이 방법은 cDNA 구조의 생존 능력을 평가하기 위해 먼저 사용됩니다. 그런 다음, 전염성 바이러스를 생산 실패하거나 야생 유형 전염성 클론의 그것보다 낮은 수준에서 바이러스를 얻을 것으로 나타날 중 RNA 기반 approa을 만들어야합니다위에서 설명한 채널이 실시됩니다.
- BHK-21 세포 (또는 BSR-T7 전지)과 종자 7.5 × 10 5 항생제 무료 성장 미디어 35 밀리미터 접시에 세포와 37에서 세포를 품어 ° C와 10 %의 CO 2 하룻밤의 단일층을 Trypsinise. transfections는 시딩 같은 하루 계획하는 경우 각각의 접시에 세포의 양을 두 배로 추가하고 세포가 37 2-3시간 위해 번호판을 준수하도록 ° C와 10 %의 CO 2.
- 세포 배양 매체를 제거하고 (그림 4) 각 잘으로 FPV-T7 700 μl를 추가합니다. 기본 닭 배아 섬유아 세포에 titrations에 기초 ~ 0.5 PFU 당 세포의 감염의 다수는 (방어) 일반적으로 사용됩니다. 그러나 그것은 기본 섬유아 세포에서 성장 헬퍼 바이러스의 새로운 준비가 기능적으로 효율적인 바이러스 복구에 필요한 복용량을 결정하는 titrated하는 협조할 것입니다. FPV-T7의 전파 및 적정위한 프로토콜은 이전 18 설명되어있다.
- 에° C와 일시간 10 % CO 2 FPV-T7가 세포를 감염시킬 수 있도록 37 cubate. 그런 다음, 항생제 무료 DMEM 10 % FCS를 포함하는 2 ML 추가 37에서 추가 시간 동안 세포를 품어 ° C와 T7 RNA 중합 효소의 표현을 허용 10 % CO 2.
- 전염성 플라스미드의 transfection을 진행하려면, 첫째 감염된 세포에서 미디어를 제거한 미디어 2 ML (항생제 무료 DMEM에서 10 % FCS)로 씻고, 마지막 미디어 3 ML과 세포 단일층을 포괄합니다. 그들이 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)의 효율성에 방해가 될 수 있기 때문에 항생제는 미디어에 추가해서는 안됩니다.
- 야생의 유형 1 μg의 혼합을 준비하는 것은 MNV는 cDNA (예 pT7 : MNV 3'Rz) 플라스미드 전염성 100 Opti-MEM (Invitrogen)의 μl와 Lipofectamine 2000 년 4 μl와 혼합 그것을의 (Invitrogen) 이전에 100 μl와 혼합 Opti-MEM (Invitrogen). 15 배 아래로 그것을 pipetting과에 의해 철저하게 반응을 섞어서 방 템피에서 믹스를 유지20 분 동안 rature.
- 결과 transfection 믹스 그때 추가되어야 세포 단일층에 드롭 현명하고 플레이트는 부드럽게 수직 방향으로 흔들리고되어야한다.
- 37 FPV-T7 감염된, MNV 플라스미드-transfected 세포를 품어 ° C와 10 % 24-72시간에 대한 CO 2. 전염성 플라스미드 pT7로 transfected 세포 : MNV 3'Rz는 일반적으로 1 X 10월 4일부터 5일까지 X 10 4 TCID50/ml에서 titres을 렌더링.
3. 대표 결과
그림 5와 같이 두 역방향 유전학 방법은 세포 배양에서 전염성 MNV의 복구를 위해 매우 효율적입니다. 10 5 TCID50/ml을 초과 titres있는 전염성 MNV는 Raw264.7 세포로 덮힌 MNV RNA의 transfection 후 24 시간에 회복됩니다. 마찬가지로, 전염성 플라스미드 pT7의 transfection : BSR-T7 전지로 MNV 3'Rz은 이전 헬퍼 FPV는 바이러스성 titres로 이끌었 T7 (FPV-T7)는 주로 excee 표현에 감염딩 10 4 TCID50/ml (그림 5). 합성 RNA와 DNA 분자로 얻은 이러한 바이러스성 titre 값은 동일한 세포 (그림 5)으로 전염성 virions 격리 천연 VPg 연결된 RNA를 포함한 transfections에서 얻어진 것과 비슷합니다. 이러한 결과는 유전자 세포 배양에 MNV 변종을 정의 복구하려면 여기를 설명한 역 유전학 접근 방식의 높은 효율성을 강조 표시합니다.
1 그림. MNV의 게놈과 전염성 바이러스의 회복을위한 플라스미드의 삽화. MNV 게놈 조직의, 도식 표현. 지역을 코딩 각 단백질은 하나의 흰색 상자로 그림한다. ORF1는 자기 proteolytic 처리 이후 전구체 polyprotein에서 출시되는 7 개의 다른 비 구조 단백질 (NS1 / 2 NS7)로 번역된다. ORF 2 주요 capsid 단백질 VP1를 인코딩, ORF 3 작은 뚜껑을 인코딩ORF2 코딩 영역과 중복되는 시드 단백질 VP2, 그리고 ORF4는 독성 계수 VF1를 인코딩합니다. 게놈과 subgenomic RNAs는 가변 길이 그들의 3 '끝에 polyA 꼬리가 포함되어 있습니다. B, 플라스미드 함유 MNV cDNA의 역방향 유전자 접근 방법 (pT7 : MNV 3'Rz)에 사용됩니다. cDNA MNV은 그 3 '최종 26 잔류물의 polyA 꼬리에 융합된다. MNV cDNA 시퀀스는 바로 하류 잘립니다 T7 프로 모터 시퀀스, T7 위주의 녹음을 허용하고, 상류 독특한 Nhe 제가 사이트와 그 후 자기 cleaving ribozyme을위한 코딩의 DNA 시퀀스에 위치해 있습니다. 이러한 시퀀스는 오른쪽 3 '끝에 게놈 polyA 꼬리 선물하면 RNA의 전사 종료를 보장을위한 수단입니다.
그림 2. 베꼈는데 및 시험 관내에 공을 RNA로부터 전염성 MNV의 회복을위한 프로토콜의 개요 플라스미드 pT7 :. MNV 3'Rz 즉시 하류 linearised합니다Nhe I 제한 효소 (1 단계)를 사용 MNV의 게놈 시퀀스. DNA를 정제 후 MNV RNA의 성적은 T7 RNA 중합 효소의 (2 단계)을 사용하여 체외에서 생성됩니다. 전사 제품은 보통의 2.5 3Kb의 명백한 이동성으로 실행되지 않은 denaturing 1% 아가로 오스 젤 (3 단계, 그림 3). 템플릿 DNA가 상업 RNAse없는 DNAse를 사용하여 제거합니다. RNA는 다음 LiCl 침전 (4 단계)에 의해 무료로 세포핵에서 정화됩니다. 정화 RNA 제품은 다음 체외에있을 수도 이전에 65 가열 후에 공을 ° C 보조 RNA 구조 (단계 5-6) 전개합니다. LiCl 침전에 의한 정화 후, RNA는 Raw264.7 세포 (신세기의 transfection 시스템, Invitrogen) 또는 BSR-T7 전지 (Lipofectamine 2000, Invitrogen) (단계 7-8) 중 하나에 transfected 있습니다. 일단 세포 안으로, 뒤덮힌 RNA의 성적 새로운 MNV RNA 분자로 바이러스성 성적 증명서 복제를 catalyze 것이 바이러스성 단백질로 번역됩니다그들의 5 '끝에 적절한 VPg 분자를 포함. 바이러스성 번역을 첨부 복제의 연속 순환은 전염성 virions을 생성하는 encapsidated됩니다 바이러스성 genomes 많은 수의를 생성합니다. 세포에서 바이러스 릴리스를 촉진하기 위해 동결과 해동 중 하나 또는 여러 개의주기가 (9 단계) 수행됩니다. 바이러스성 수율은 다음 TCID50 또는 상패 분석 절차에 따라 결정됩니다.
그림 3. 프로토콜에 따라 MNV RNA의 성적 무결성 분석. MNV RNA의, 무결성은 체외에서 합성. 플라스미드 pT7 : MNV 3'Rz은 첫째 Nhe I 제한 효소를 사용하여 linearised있다. DNA를 정제 후 MNV RNA의 성적은 T7 RNA 중합 효소의 (차선 2)를 사용하여 체외에서 생성됩니다. RNA 후 purifi입니다 LiCl 강수량 (레인 3)을 통해 무료 세포핵에서 에드. 전사 제품은 1-KB의 DNA 사다리 (뉴 잉글랜드 Biolabs, 차선 1)에 병렬로 비 denaturing 1퍼센트 아가로 오스 겔에서 실행됩니다. 비 denaturing 조건 하에서 바이러스 성적의 상대 이동성 2.5-3 KB의 dsDNA 제품과 비슷합니다. 상한 후 MNV RNA의 성적 B, 무결성. LiCl 강수량 (레인 2)에 의해 이전에 정화 MNV의 성적은 효소 상한 (레인 3) 및 LiCl 강수량 (차선 4)에 의한 정화를 받게됩니다. C, MNV 성적 증명서 (두 번째 차선) 및 이전 LiCl에 시켰던되었습니다 덮힌 MNV 성적 증명서 (3 차선)의 애질런트 RNA 6000 나노 칩에서 분석. ssRNA 사다리가 병렬로 실행됩니다.
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4 그림. cDNA의 전염성 MNV의 회복을위한 프로토콜의 개요. 처음 BSR-T7 (또는 BHK) 세포가 박테리오 파지 T7 RNA의 효소 (FPV-T7) (1 단계)를 표현하는 재조합 fowlpox 바이러스 (FPV)에 감염된다. 재조합 T7 RNA 중합 효소의 (2 단계)를 포함 FPV 단백질의 표현을 허용하도록 추가로 치료를 받기 전에 감염된 세포는 2 시간 incubated됩니다. 그 후 pT7 : MNV 3'Rz는 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (3 단계)를 사용하여 세포로 transfected 있습니다. 일단 세포, pT7 내부 : MNV 3'Rz가 MNV RNA 성적 증명서 (4 단계)를 synthesises T7 RNA 중합 효소에 의해 인정되고 있습니다. 게놈의 3'end에서 자체 cleaving δ-Ribozyme 시퀀스의 존재는 성적 증명서 3 't를 보장합니다erminus 막 polyA 꼬리 (5 단계) 이후에 위치해 있습니다. 일부 바이러스 성적표는 intracellularly FPV 상한 효소 (6 단계)에 의해 공을됩니다. 결과 MNV 뒤덮힌 성적은 성적 증명서 MNV 복제를 catalyze 것이 MNV 단백질을 생성하는 번역됩니다. 그들의 5 '끝에 적절한 VPg 분자를 포함하는 새로 합성 MNV RNA 분자는 마침내 전염병 encapsidated 바이러스의 발생을 초래할 수 바이러스성 번역과 함께 복제의 연속적인 사이클을 받아야합니다. 세포에서 바이러스 릴리스를 촉진하기 위해 동결과 해동 중 하나 또는 여러 개의주기가 (7 단계) 수행됩니다. 바이러스성 수율은 다음 TCID50 또는 상패 분석 절차에 따라 결정됩니다.
그림 5. 본문에서 설명한 다른 역방향 유전학 접근에서 얻은 바이러스 titres 대표 결과입니다. 회색 막대는 네온 후 24 시간에서 얻은 바이러스 titres을 대표2 X 10 6 Raw264.7 세포, 또는 그 이후의-transfection 체외에서 베꼈는데 및 뒤덮힌 MNV RNA 2 X 10 6 BSR-T7 전지의 사러가-transfection. 이 X 이전 재조합 T7의 효소 (FPV-T7)를 표현 fowlpox 바이러스 2 시간 동안 감염 10 6 BSR-T7 전지로 MNV 3'Rz (MNV cDNA) : 흰색 막대는 보통 pT7의 lipofection 후 얻은 바이러스 titre을 나타냅니다. 원시와 BSR-T7cells로 transfection에 대한 긍정적인 컨트롤, 우리는 일반적으로 VPg 링크된 MNV RNA의 높은 수준을 포함 MNV에 감염된 세포에서 추출한 RNA 중 2 μg을 사용합니다. 음수 컨트롤 MNV RNA 또는 pT7 중으로 실시되었습니다 MNV 3'Rz 아무 감지 바이러스 (데이터가 표시되지 않음) 그 결과 복제를 abrogates frameshift 변이 (F / S)을 인코딩.
Discussion
여기에서 우리는 세포 배양에서 전염성 MNV의 회복을 허용 서로 다른 두 역방향 유전자 접근 방법을 보여주고있다. 효과적으로 그리고 세포 변이에 의해 인정되는 뒤덮힌 MNV 성적 증명서의 생성을 통해 바이러스성 RNA를 게놈의 5 '끝에 VPg의 covalently 연동을위한 절대적인 요구를 우회 접근 둘 다. 효소 상한 다음에 시험 관내 전사에서 더 효율적이다 성적표가 FPV 상한 효소에 의해 공을 수있는 T7 RNA의 효소를 표현하는 세포에서 전염성 plasmids의 전사보다 전염성 MNV의 회복. 이러한 역방향 유전학 시스템과 복구 바이러스 titres는 감염된 세포 배양 17 (그림 5)에서 정화 바이러스성 VPg 연결된 RNA의 transfection에 의해 얻은 이들과 비슷합니다. 허용 Raw264.7 세포로 덮힌 MNV RNA의 transfection은 transfectio 관련된 실험이 겨우 1-로그 낮은 바이러스 titre를 렌더링N 바이러스성 VPg 연결된 RNA를 (그림 5)가 포함된 감염된 세포로부터 총 RNA의. 이 사실은 이러한 시스템에 의해 생성된 성적의 5 '끝에 VPg 분자의 추가가 VPg에 관련된 세포에 MNV의 감염의 기본 기능적인 측면을 나타낼 수 증가 바이러스 수율 초래할 수 있는지 여부를 확인하기 위해 추가 조사를 장려한다. 다른 RNA 바이러스에 비해 고효율 하나가 유전 시스템은 현재 체외 베꼈는데 RNA에이 virions 19, 20와 실제 감염에 비해 전용 10-100 낮은 titres의 회복을 허용하는 데 사용 반대로 그럼에도 불구하고, 우리는이 역방향 유전학 시스템을 생각한다.
전체적으로 현재의 방법론은 노로 바이러스 분자 생물학 분야에서 앞으로 중요한 단계를 구성하며, 노로 바이러스의 genomes에서 단백질과 RNA의 보존 작품의 기능적 역할을 조사하는 도구를 제공. 이러한 접근 방식은 이미 C와 결합되어이내 10 일 4, 21의 생쥐 - urrent 마우스 모델 사용 가능하고 MNV은 전염성 cDNA로부터 복구하는 것으로 나타났습니다 정보> 80% STAT1-/ 중 치명적인 감염을 일으킬 수 있습니다. 우리가 capsid 단백질 및 생체내 21, 22에서 다소 감쇠 phenotypes을 표시할 다른 호스트 요인 (PTB와 PCBP)의 바인딩에 관여 polypyrimidine 넓이의 유력한 murine 노로 바이러스의 돌연변이를 회복이 시스템의 활용. 또한, 최근에 다시 세포 배양에 복제 효율적 ORF4에서 VF1 단백질을 표현할 수있는 능력이지만 부족한 바이러스 WT MNV 8 관련하여 생쥐에 독성을 감소 것을 증명하고있다. 이러한 연구는 우리가 잠재적인 백신 후보로 조사 수 MNV 연구를 토대로 인간 noroviruses의 감쇠 버전을 설계하는 것이 좋습니다.
Disclosures
우리는 공개 할게 없다.
Acknowledgments
이 연구는 이안 Goodfellow, 그리고 아르 아리아스에게 수여 마리 퀴리 사내 유럽 원정대 (FP7 유럽 연구 협의회)에게 수여 Wellcome 트러스트 수석의 원정대에 의해 후원되었다. 우리는 우리 자신 애질런트의 bioanalyser를 사용할 수있는 권한을 갖게하고 RNA 샘플을 실행에 도움을 주셔서 이오 홍 청, 닥터 레베카 Robey 및 박사 마이크 스키너 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lithium chloride precipitation solution | Ambion | AM9480 | |
| RNA storage solution | Ambion | AM7000 | |
| ScriptCap m7G Capping System | Epicentre Biotechnologies | SCCE0610 | |
| Neon transfection system | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985070 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| Agilent RNA 600 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
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