Summary
Norovirus är en viktig orsak till gastroenterit ännu molekylära tekniker för deras karakterisering fortfarande är relativt nytt. Här rapporterar vi två olika omvänd genetik metoder för effektiv återvinning av mus norovirus (MNV), den enda medlemmen av detta släkte som kan förökas i cellkultur.
Abstract
Mänskliga norovirus är ansvariga för de flesta fall av mänsklig gastroenterit (GE) över hela världen och är återkommande problem i miljöer där närstående person till person kontakt inte kan undvikas 1, 2. Under de senaste åren en ökning av incidensen av utbrott på sjukhus har rapporterats orsaka betydande störningar i sin operativa kapacitet samt stora ekonomiska förluster. Identifiering av nya antivirala strategier har varit begränsad på grund av oförmågan hos humana norovirus att fullborda en produktiv infektion i cellkultur 3. Den senaste isoleringen av en mus norovirus (MNV), nära besläktat med humaninsulin norovirus 4, men som kan förökas i celler 5 har öppnat nya vägar för utredning av dessa patogener 6, 7.
MNV replikering resulterar i syntes av nya positiv bemärkelse genomiska och subgenomiska RNA-molekyler, motsvarar den senare för att den sista third av det virala genomet (fig 1). MNV innehåller fyra olika öppna läsramar (ORF), varav ORF1 upptar det mesta av genomet och kodar sju icke-strukturella proteiner (NS1-7) som frigörs från ett polyprotein föregångare. ORF2 och ORF3 är inneslutna i den subgenoma RNA-regionen och kodar för kapsidproteinerna (VP1 och VP2, respektive) (Figur 1). Nyligen har vi identifierat att ytterligare ORF4 överlappande ORF2 men i en annan läsram är funktionell och kodar för ett mitokondriellt lokaliserat virulensfaktor (VF1) 8.
Replikation för positiv sens-RNA-virus, däribland norovirus, äger rum i cytoplasman vilket resulterar i syntes av nya icke-kåpförsedda RNA-genom. För att främja viral översättning, virus utnyttjar olika strategier för att rekrytera det cellulära maskineri proteinsyntes 9-11. Intressant nog är norovirus översättning drivs av den multifunktionella virala protein-primern Vpgkovalent bunden till 5 'änden av båda genomiska och subgenomiska RNA 12-14. Denna sofistikerade mekanism översättning är sannolikt en viktig faktor i den begränsade effektiviteten i viral återhämtning genom konventionella omvänd genetik metoder.
Här rapporterar vi två olika strategier som bygger på produktion av murina norovirus-1 (benämnd MNV härmed) transkript maximerat till 5 'änden. En av de metoder involverar både in vitro syntes och utjämningen av viralt RNA, medan den andra metoden innebär transkription av MNV cDNA i celler som uttrycker T7 RNA-polymeras. Tillgängligheten av dessa omvänd genetik system för studium av MNV och en liten djurmodell har tillhandahållit en oöverträffad möjlighet att dissekera roll virala sekvenser i replikation och patogenes 15-17.
Protocol
1. RNA Transkription och Tak för återvinning av infektiös MNV
Detta protokoll är utformad för att möjliggöra effektiv indrivning av smittsamma MNV från cDNA via in vitro transkription och dess efterföljande in vitro tak (avsnitt 1,1). De resulterande begränsade transkriptioner transfekteras sedan in i celler att återhämta smittsamt MNV (avsnitt 1.2 och 1.3). Denna metod ger den känsligaste metoden för utvinning av MNV med typiska avkastning på över 10 5 infektiösa enheter per 35 mm (i diameter) skål med celler för MNV. Protokollet specificeras nedan:
1,1 Syntes av smittsamma capped MNV Avskrifter:
- Digerera plasmiden innehållande vildtyp MNV cDNA (pT7: MNV 3'Rz) med Nhel för att erhålla linjär DNA-Nhel inser en unikt restriktionsställe efter 3'-änden polyA-svansen av MNV genomet (fig 2).. Lineariserade plasmider renas typisktmed att använda kiseldioxidkolonner (t.ex. GFX PCR DNA Gel Band Rening Kit från GE Healthcare) och elueras i H 2 O.
- In vitro transkribera den linjäriserade vektorn med användning av T7 RNA-polymeras såsom beskrivits tidigare 17. Många kommersiella kit tillgängliga för detta ändamål och ger en reproducerbar metod för stora mängder av RNA-syntes, såsom MEGAScript (Life Technologies) och Ribomax (Promega). Transkriptionsreaktioner typiskt DNAs digererades före ytterligare analys, men i många fall detta är inte nödvändigt eftersom reningar litium-klorid, såsom beskrivs nedan inte fälls DNA effektivt.
- Analysera en liten alikvot av RNA-transkription reaktionen, typiskt 0,5 | il eller mindre, genom agarosgelelektrofores för att garantera transkriptionsreaktionen har fungerat effektivt och RNA är full längd. Medan många användare kanske vill köra denaturering geler för att korrekt storlek på RNA, använder vi normalt inte denaturerande agarosgel Electrophoresis som en snabb metod för att analysera RNA integritet. Den MNV genomet som produceras från den infektiösa cDNA-klonen pT7: MNV 3'Rz löper vid ca 3 Kbp relativt en dsDNA stege på en icke-denaturerande agaros-gel (Figur 3).
- Hänsyn till att andra metoder finns tillgängliga som ett alternativ för att erhålla en snabb analys av RNA-integritet såsom med användning av en Agilent bioanalyser (figur 3).
- Observera att dålig gel upplösning kan uppstå om för mycket RNA laddas. Noga med att se till att agarosgel framställs med användning av RNas-fritt reagens för att undvika RNA nedbrytning under elektrofores som kan påverka bandet upplösning. Upphettning RNA till 65 ° C följt av kylning på is kan också hjälpa till i vissa fall.
- Rena RNA-prov för att avlägsna de ej inkorporerade nukleotider. Många metoder finns tillgängliga för detta, däribland silikabaserade kolumn tillvägagångssätt men i detta protokoll har vi normalt använder litium klorid som ett kostnadseffektivt alternativ. Fördetta ändamål, tillsätt H2O till att nå en slutlig volym av 100 | il och tillsätt sedan 40 pl av Litiumklorid utfällning lösning (7,5 M LiCl, 50 mM EDTA, pH 8,0, Ambion) och lagra provet vid -20 ° C i minst 30 min.
- Pelleten av RNA genom centrifugering vid 12.000 X g vid 4 ° C under 15 minuter.
- Avlägsna supernatanten noga med att inte störa genomskinliga RNA-pelleten och tvätta den i 150 pl 70% etanol. Centrifugera röret vid 12.000 X g vid 4 ° C under 15 minuter.
- Ta bort etanol och luft-torka RNA, undviker pelleten helt torka ut eftersom detta kommer att göra resuspension svårt.
- Sedan återsuspendera MNV utskrifter i 50-100 pl RNA lagringslösning (Ambion). Försiktighet bör vidtas för att säkerställa att alla RNA har lösts ordentligt. Om de RNA vara svårt att lösa upp fullständigt, upphettning av provet till 60 ° C kan hjälpa till att återsuspendera det. Eventuellt olösligt material bör sedan avlägsnas by centrifugering före RNA kvantifiering. De renade transkript oskyddad och kräver en efterföljande in vitro tak steg för att vara smittsam (ScriptCap m7G Utjämningssats System, Epicentre Biotechnologies).
- Kvantifiera RNA genom spektrofotometri. Beroende på art och omfattning transkriptionsreaktionen typiska ger allt från 50 till 150 pg RNA per 100 ^ transkriptionsreaktionen. Integriteten av RNA bör analyseras innan det täckande reaktionen genom att köra ut ur 100-300 ng av provet i en 1% agarosgel (Figur 3).
- För att förbättra effektiviteten av RNA tak, värme från 60 till 70 ng MNV RNA-transkript vid 65 ° C i 10 minuter och sedan placera röret omedelbart på is. Detta steg kan minska eventuell hämmande effekt av RNA struktur på tak. Pulsa röret i en kyld mikrofug för att samla små droppar som bildas under upphettningssteget.
- Förbered en tak reaktionsblandningen som föreslagits av tillverkaren (ScriptCap m7GTak System, Epicentre Biotechnologies). Kortfattat, tillsätt 60-70 pg av MNV RNA till en slutlig reaktionsvolym av 100 | il. Capping reaktionsblandningen kan innehålla 10 | il av 10 x capping-buffert (500 mM Tris-HCl pH 8,0, 60 mM KCl, 12,5 mM MgCl2), 10 pl av 10 mM GTP, 0,5 pl av 20 mM S-adenosylmetionin, 2,5 pl av Scriptguard (100 enheter), och 4 | il av Scriptcap enzym (40 enheter).
- Under reaktionen konfigurerat hålla RNA-transkript på is för att undvika nedbrytning. Blanda väl reaktionsblandningen och därefter inkubera den vid 37 ° C under 1 timme. Notera reaktionen storlek kan skalas beroende på hur mycket av det utjämnade krävs utskrift.
- Rena RNA med LiCl utfällning som förklarats ovan (se punkt 1.1.6). Upplösa pelleten i 50-100 | il av RNA lagringslösning (Ambion) och kvantifiera mängden av RNA. Typiskt RNA-prover därefter normaliseras till 1 pg / pl. Återigen, kontrollera alla RNA har lösts ordentligt. Om det inte har blivit korrekt löst, värme than provet till 60 ° C för att medge dess upplösning. Ta bort genom centrifugering något olösligt material före RNA kvantifiering.
- Kontrollera integriteten av RNA igen innan du fortsätter med transfektion steget. För detta ändamål drivs en mängd av 100-300 ng av provet i en 1% agarosgel (figur 3).
1,2 Återvinning genom Neon-medierad transfektion av RNA till Raw264.7 celler:
För återbetalning av MNV smittsamma virioner i en tolerant cellinje är det möjligt att elektroporera det utjämnade MNV avskriften i Raw264.7 celler med användning Neon transfektion system (Invitrogen). Raw264.7 är celler som är mottagliga för infektion MNV, stödja flera rundor av virusreplikation och efterföljande återinfektion. Som ett resultat kommer typiska utbyten närma än 10 5 infektiösa enheter per ml vid 24 timmar efter transfektion, men topp vid> 10 7 infektiösa enheter efter 48 timmar.
- En dag innan transfection, frö Raw264.7 celler vid en uppskattad 50% konfluens. Typiskt två T75-kolvar i celler erfordras för 3 transfektioner.
- Dagen för transfektion, skrapa cellmonoskikten i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) innehållande 10% fetalt kalvserum (FCS), säkerställer man genererar en enda cellsuspension genom upprepad pipettering.
- Bestämma koncentrationen av viabla celler i en hemocytometer med användning av trypanblått-uteslutning att märka icke-viabla celler.
- Pelletera cellerna vid 1200 x g under 5 min och återsuspendera dem i DMEM innehållande 10% FCS vid en slutlig koncentration av 8 x 10 6 celler per ml.
- Precis före transfektion, alikvot 1 ml celler per transfektion och pelleten dem vid 1200 X g under 2 minuter. Avlägsna mediet och tvätta cellerna i 500 pl PBS (utan Mg 2 + / Ca2 +). Centrifugera ner cellerna igen vid 1200 X g under 2 minuter. Notera att det är lämpligt att hålla celler i DMEM så länge som möjligtsåsom lagring i PBS under långa tidsperioder kan äventyra cellviabilitet och transfektion hastighet.
- Avlägsna PBS från rören och tillsätt 130 | il av återsuspension lösning (neon transfektionssystem kit, Invitrogen) till en slutlig koncentration av 6 x 10 7-celler per ml. Försiktighet bör vidtas för att resuspendera cellerna undvika bildandet av bubblor som kommer att leda till gnistbildning under transfektion och kompromisser cellöverlevnad.
- Tillsätt den lämpliga mängden av det utjämnade MNV transkript till cellerna (fig. 2), är i allmänhet 1,3 pg av det utjämnade RNA tillsattes till 130 pl av återsuspenderade celler och blandades försiktigt. Därefter, samla 100 | il av blandningen i 100 | il neon transfektion spets. Särskild försiktighet bör vidtas för att säkerställa att inga bubblor bildas i elektroporering kyvetten (Neon transfektionssystem kit 100 pl spetsen), eftersom detta kommer att leda till att experimentet.
- Elektroporera cellerna med en enda puls vid 1.700 V för 25 msek, enSuring frånvaron av gnistor under pulserande som indikerar förekomsten av bubblor i provet. I det fall gnistbildning skulle uppstå, kasta provet och upprepa transfektion. Frigöra cellerna i ett Eppendorf-rör innehållande 1 ml av antibiotikumet fri DMEM innehållande 10% FCS. Notera varje spets kan återanvändas upp till tre gånger med samma RNA-prov om ett större antal transfekterade celler erfordras.
- Därefter distribuera cellerna från röret in oberoende brunnar innehållande en lämplig mängd av förvärmd antibiotikum fri DMEM innehållande 10% FCS. Som en allmän vägledning, 150 pl av cellsuspensionen som alstras under steg 1.2.8 är tillräckliga för en enda brunn av en 24-skål platta innehållande 0,5 ml förvärmd DMEM, medan 300 ^ il är lämpliga för en brunn i en 12-skål platta innehållande 1 ml förvärmd DMEM.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 10% CO2 under 24 till 72 timmar. Sedan släpper infektiösa virioner från celler av en (eller flera)frysa och cykler tina och bestämma virus titer i provet genom att använda antingen plack analys eller TCID50. Observera att lysaten bör klargöras genom centrifugering i 1-2 minuter på högsta hastighet eller deras filtrering genom ett 0,22 m porfilter före titreringen. Vanligtvis når MNV titrar på cirka 1 x 10 6 TCID50/ml vid 24 timmar efter transfektion och upp till 1 x 10 9 vid 72 timmar efter transfektion.
- Närvaron och stabilitet av mutationer som införts i pT7: MNV 3'Rz bestäms typiskt genom sekvensering av de återbildade virusen efter 2 till 5 ytterligare passager i Raw264.7 celler.
1,3 Recovery genom lipofektion i BHK-21 celler:
En mer direkt och ofta mer kostnadseffektiv metod för utvinning av smittsamma MNV från utjämnade transkript är via lipofektion (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Med tanke på att Raw264.7 celler är svåra att transfektera med lipid strategier vi normalt använder sig av OTHER lätt att transfektera cellinjer såsom BHK-21, som är en immortaliserad linje härledd från babyhamster njurfibroblaster. Som standard förhållningssätt i vårt laboratorium använder vi BSR-T7 celler, ett derivat av BHK-21-cellinje, som samtidigt dessa celler är lätta att transfektera och stödja MNV replikering, de saknar en lämplig receptor för att tillåta flera omgångar för återinfektion . Som ett resultat är virusutbyte genereras från detta system en indikation på en enda cykel av virusreplikation. Detta tillvägagångssätt är särskilt användbar när man undersöker effekten av mutationen på virusutvinning eftersom det tillåter flera transfektioner kan utföras vid väsentligt minskade kostnader jämfört med Neon-medierad transfektion och dessutom inte kräver specialutrustning. Det är värt att notera att andra lättillgängliga cellinjer, såsom humana embryonala njur 293T celler också stödja en effektiv återvinning av MNV dock transfektion villkor bör först optimeras för att säkerställa en effektiv RNA leverans.
- Trypsinise ett monoskikt av BHK-21-celler (eller BSR-T7-celler), frö 7,5 x 10 5-celler i en 35 mm diameter skål i antibiotikafritt tillväxtmedier och inkubera cellerna vid 37 ° C med 10% CO2 över natten. Dubbla mängden av celler i varje platta om transfektionerna planeras för samma dag som ympning, och tillåta cellerna att vidhäfta till plattan under 2-3 timmar vid 37 ° C med 10% CO2. Notera att andra celler som är lämpliga för detta tillvägagångssätt innefattar humana 293T-celler, humana hepatocellulära karcinomceller Huh7-celler och afrikansk grön apa Cos7-celler.
- Ta bort materialet från cellerna och ersätta med 3 ml färskt medium utan antibiotika för att säkerställa maximal effektivitet i transfektion.
- Framställ en blandning av 1-2 pg av det utjämnade MNV transkriptet i 100 | il Opti-MEM (Invitrogen) och blanda det med 4 pl av Lipofectamine 2000 tidigare blandade i 100 | il Opti-MEM. Blanda provet noggrant genom pipettering upp och ner 15 gånger. Lämnablandningen vid rumstemperatur under 20 minuter.
- Lägg till transfektions komplex som innehåller begränsade MNV transkript i ett droppvis sätt till cellmonoskiktet och försiktigt skaka plattan i vinkelräta riktningar.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C och 10% CO2 under 24 till 72 timmar. Efteråt släpper smittsamma virioner från celler genom frysning och upptining och bestämma virustiter med plackanalys eller TCID50. Typiska utbyten på cirka 1 x 10 6 TCID50/ml uppnås.
2. Direkt Återvinning av infektiös MNV från cDNA i celler som uttrycker T7 RNA-polymeras
Detta protokoll är utformad så att återvinningen av MNV i celler genom transkription av en smittsam plasmid hysande hela genomiska cDNA-sekvensen med en T7-polymeras som uttrycks i cellerna. Olika cellinjer kan användas för att återvinna smittsamt MNV med denna metod, även om vi normalt får de högsta avkastningen med BHK-21 och BSR-T7 ceLLS 15. Vi använder oftast BSR-T7 celler eftersom de växer snabbare än föräldrarnas BHK klonen linje. Cellerna infekteras med hönspox (FPV) som kodar för T7 RNA-polymeras (FPV-T7) 18 som fungerar som ett hjälparvirus för att driva uttryck av de virala RNA och efterföljande återvinning av infektiöst virus (Figur 4). Även BSR-T7-celler konstitutivt uttrycker T7 RNA-polymeras, detta uttryck inte är tillräcklig för att rädda infektiös MNV efter transfektion av pT7: MNV 3'Rz i frånvaro av hjälparvirus FPV-T7. Medan typiska utbyten från detta system är åtminstone 10-faldigt lägre än de som beskrivits ovan, gör detta tillvägagångssätt tillhandahåller en snabb metod för screening av mutanter för att tillåta identifiering av försvagande mutationer. Normalt denna metod används först för att bedöma lönsamheten för en cDNA konstruktion. Om en konstruktion antingen misslyckas med att producera smittsamt virus eller verkar för att ge virus på lägre nivåer än för den vilda typen infektiös klon, då RNA-baserade approach som beskrivs ovan genomförs.
- Trypsinise ett monoskikt av BHK-21-celler (eller BSR-T7-celler) och frö 7,5 x 10 5-celler i en 35 mm skål i antibiotiska fria tillväxtmedier och inkubera cellerna vid 37 ° C och 10% CO2 över natten. Lägg dubbla mängden av celler i varje platta om transfektionerna planeras för samma dag som sådd och låta cellerna att fästa till plattan under 2-3 timmar vid 37 ° C och 10% CO 2.
- Avlägsna cellodlingsmedia och tillsätt 700 | il av FPV-T7 i varje brunn (figur 4). En mångfald av infektion (MOI) av ~ 0,5 PFU per cell, baseras på titreringar på primära kycklingembryofibroblaster, används i allmänhet. Det är emellertid värt att notera att nya beredningar av hjälpar-virus odlades i primära fibroblaster funktionellt titreras för att bestämma den dos som krävs för effektiv virusutvinning. Protokoll för förökning och titrering av FPV-T7 har tidigare beskrivits 18.
- Icubate vid 37 ° C och 10% CO2 under 1 timme för att tillåta FPV-T7 för att infektera cellerna. Därefter tillsattes 2 ml av antibiotikumet fri DMEM innehållande 10% FCS och inkuberas cellerna under en ytterligare timme vid 37 ° C och 10% CO2 för att möjliggöra T7 RNA-polymeras uttryck.
- Att fortsätta med transfektion av den infektiösa plasmiden, först ta bort mediet från de infekterade cellerna, tvätta med 2 ml medium (10% FCS i antibiotikum DMEM), och slutligen omfatta cellmonoskiktet med 3 ml media. Antibiotika bör inte tillsättas till mediet, eftersom de kan störa effektiviteten av Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
- Framställ en blandning av 1 pg av vildtyp MNV cDNA infektiös plasmiden (t.ex. pT7: MNV 3'Rz) i 100 | il Opti-MEM (Invitrogen) och blanda det med 4 pl av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som tidigare blandats med 100 pl av Opti-MEM (Invitrogen). Blanda reaktionen grundligt genom att pipettera upp och ned 15 gånger och hålla blandningen i rumstemperatur Tempeperatur under 20 minuter.
- Den resulterande transfektion mix bör sedan droppvis till cellmonoskiktet och plattan ska försiktigt skakas i vinkelräta riktningar.
- Inkubera FPV-T7 infekterade, MNV plasmiden-transfekterade celler vid 37 ° C och 10% CO2 under 24 till 72 timmar. Celler transfekterade med smittsamt plasmid pT7: MNV 3'Rz göra normalt titrar från 1 x 4 till 5 oktober x 10 4 TCID50/ml.
3. Representativa resultat
Båda omvänd genetik metoderna är mycket effektiva för återvinning av smittsamt MNV i cellkultur som visas i figur 5. Infektiös MNV med titrar över 10 5 TCID50/ml återvinns vid 24 timmar efter transfektion av det utjämnade MNV RNA till Raw264.7 celler. Likaså transfektion av smittsamma plasmid pT7: MNV 3'Rz i BSR-T7 celler infekterade tidigare med helper FPV uttrycker T7 (FPV-T7) ledde till virala titrar i stort sett överträffatDing 10 4 TCID50/ml (Figur 5). Dessa virala titrar som erhölls med syntetiska RNA-och DNA-molekyler är liknande de som erhölls i transfektioner involverar naturliga Vpg-länkade RNA isolerat från infektiösa virioner i samma celler (figur 5). Resultaten understryker den höga effektiviteten i omvänd genetik strategier som beskrivs här för att återvinna genetiskt definieras MNV varianter i cellkultur.
Figur 1. Illustration av MNV genomet och plasmid för återvinning av infektiöst virus. A, Schematisk representation av MNV genomorganisation. Varje protein-kodande regionen visas som en enda vita rutan. ORF1 har översatts till 7 olika icke-strukturella proteiner (NS1 / 2 till du ns7) som frigörs från föregångaren polyprotein efter själv proteolytisk bearbetning. ORF 2 kodar det huvudsakliga kapsidproteinet VP1 kodar ORF 3 den mindre locketsid protein VP2, och ORF4 överlappar ORF2 kodande region kodar virulensfaktorn VF1. Genomiska och subgenomiska RNA innehålla en polyA-svans vid sin 3'-ändarna av variabel längd. B, Plasmid innehåller MNV cDNA används i våra omvända genetiska metoder (pT7: MNV 3'Rz). MNV cDNA fuseras till en polyA-svans på 26 rester i sin 3 'ände. Den MNV cDNA-sekvens belägen omedelbart nedströms om en stympad T7-promotor-sekvensen, för att tillåta T7-drivna transkriptionen och uppströms om ett unikt Nhel-ställe och en DNA-sekvens som kodar för en själv-spjälkning ribozym efter den. Dessa sekvenser är avgörande för att säkerställa RNA transkriptionsterminerings direkt efter genomiska polyA svansen närvarande vid 3-änden.
Figur 2. Översikt av protokollet för återvinning av smittsamma MNV från RNA transkriberas och utjämnade in vitro Plasmiden pT7. MNV 3'Rz linjäriseras omedelbart nedströmsav MNV genomiska sekvensen med användning av Nhe I-restriktionsenzym (steg 1). Efter DNA-rening, MNV RNA-transkript som alstras in vitro genom användning av T7 RNA-polymeras (steg 2). Transkriptionsprodukter drivs vanligen med en synbar mobilitet av 2,5-3Kb på en icke-denaturerande 1% agarosgel (steg 3, figur 3). Mall-DNA elimineras med hjälp av en kommersiell RNAs-fritt DNAs. RNA renas sedan från fria nukleotider genom LiCl utfällning (steg 4). Den renade RNA-produkt kan därefter in vitro tillslöts efter tidigare upphettats vid 65 ° C att veckla sekundära RNA-strukturer (steg 5-6). Efter rening genom LiCl utfällning, är RNA transfekteras in i antingen Raw264.7 celler (neon transfektionssystem, Invitrogen) eller BSR-T7-celler (Lipofectamine 2000, Invitrogen) (steg 7-8). Väl inne i cellen, kommer capped RNA-transkript att översättas till virala proteiner som skulle katalysera virala transkript replikation i nya MNV RNA-molekylerinnehållande en lämplig Vpg molekyl vid sin 5'-ände. Successiva cykler av replikation åtföljt av viral översättning skulle generera ett stort antal virala genom som skall inkapslade för att generera infektiösa virioner. För att underlätta virusfrisättning från celler, är en eller flera cykler av frysning och tining utförs (steg 9). Virala avkastningen kan sedan bestämmas genom TCID50 eller plack förfaranden analys.
Figur 3. Analys av MNV RNA-transkript integritet längs protokollet. A, integritet MNV RNA syntetiseras in vitro. Plasmiden pT7: MNV 3'Rz är det första lineariseras med hjälp Nhel restriktionsenzym. Efter DNA-rening, MNV RNA-transkript som alstras in vitro genom användning av T7 RNA-polymeras (spår 2). RNA är därefter rening ED från fria nukleotider genom LiCl utfällning (spår 3). Transkriptionsprodukter körs på en icke-denaturerande 1% agarosgel i parallell med 1-kb DNA-stege (New England Biolabs, spår 1). Relativ mobilitet av virala transkript under icke-denaturerande betingelser liknar en dsDNA-produkten av 2,5-3 kb. B, integritet MNV RNA-transkript efter begränsning. MNV transkript renade tidigare av LiCl utfällning (spår 2) utsätts för enzymatisk capping (spår 3) och rening genom LiCl utfällning (spår 4). C, Analys i en Agilent RNA 6000 Nano chip MNV transkript (andra raden) och begränsade MNV utskrifter (tredje bana) som tidigare har fällts i LiCl. En ssRNA stege körs parallellt.
= "Pdflinebreak"> 
Figur 4. Översikt av protokollet för återvinning av smittsamma MNV från cDNA. Initialt är BSR-T7 (eller BHK) celler infekterade med ett rekombinant hönspoxvirus (FPV) som uttrycker bakteriofag T7 RNA-polymeras (FPV-T7) (steg 1). De infekterade cellerna inkuberas under 2 timmar innan ytterligare behandling för att tillåta uttrycket av FPV-proteiner som innefattar det rekombinanta T7 RNA-polymeras (steg 2). Efteråt pT7: är MNV 3'Rz transfekteras in i cellerna genom användning av Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (steg 3). Väl inne i cellen, pT7: MNV 3'Rz känns igen av T7 RNA-polymeras som syntetiserar MNV RNA-transkript (steg 4). Närvaro av en själv-spjälkande δ-ribozym-sekvens vid 3'-änden av genomet garanterar transkriptet 3 'terminus ligger strax efter polyA-svansen (steg 5). Vissa virala transkript intracellulärt täckta av en FPV tak enzym (steg 6). De resulterande MNV begränsade avskrifter kommer att översättas för att generera MNV proteiner som skulle katalyserar MNV Avskrifter replikering. Nysyntetiserade MNV RNA-molekyler som innehåller en lämplig Vpg molekyl vid deras 5 '-änden skulle genomgå successiva cykler av replikation tillsammans med virala översättning vilket slutligen kan resultera i generering av infektiöst inkapslade virus. För att underlätta virusfrisättning från celler, är en eller flera cykler av frysning och tining utförs (steg 7). Virala avkastningen kan sedan bestämmas genom TCID50 eller plack förfaranden analys.
Figur 5. Representativa resultat av virustitrar som erhölls från olika omvänd genetik närmar beskrivs i texten. Grå staplar representerar de virustitrar som erhölls vid 24 timmar efter neon-Transfektion av 2 x 10 6 Raw264.7 celler, eller genom lipo-transfektion av 2 x 10 6 BSR-T7-celler med in vitro-transkriberade och utjämnade MNV RNA. Vita staplar representerar virustiter erhålles typiskt efter lipofektion av pT7: MNV 3'Rz (MNV cDNA) in i 2 x 10 6 BSR-T7-celler som tidigare infekterats under 2 timmar med hönskoppsvirus uttrycker rekombinant T7-polymeras (FPV-T7). Som en positiv kontroll för transfektion in i Raw och BSR-T7cells använder vi typiskt 2 | ig av RNA extraherat från celler infekterade med MNV som innehåller höga halter av Vpg-länkad MNV RNA. Negativa kontroller har genomförts med antingen MNV RNA eller pT7: MNV 3'Rz kodar en ramskiftsmutation (F / S) som upphäver replikation, vilket resulterar i ingen detekterbar virus (data visas ej).
Discussion
Här har vi illustrerat två olika omvända genetiska metoder som tillåter återvinning av smittsamma MNV i cellkultur. Båda tillvägagångssätten effektivt förbikoppla det absoluta kravet på kovalent bindning av Vpg till 5 'änden av det virala RNA-genomet genom generering av kapslade MNV transkript som sedan känns igen av det cellulära ribosomer. In vitro-transkription följt av enzymatiskt capping är mer effektivt i återvinning av smittsamma MNV än transkription av smittsamma plasmider i celler som uttrycker T7 RNA-polymeras, där utskrifter kan tillslutas med FPV capping enzymer. Virustitrar återvunna med dessa omvänd genetik system är liknande den som uppnås genom transfektion av virala Vpg-länkade RNA renad från infekterade cellkulturer 17 (figur 5). Transfektion av kapslade MNV RNA till tillåtande Raw264.7 celler gör ett virus titer endast 1-log lägre än försök med transfection av total RNA från infekterade celler som innehåller virus Vpg-linked-RNA (Figur 5). Detta faktum uppmuntrar ytterligare undersökningar för att bestämma huruvida tillsatsen av en VPG molekyl till 5 'änden av transkript som genereras av dessa system kan resultera i ökade virusutbyten som kan avslöja funktionella aspekter underliggande MNV infektivitet i celler som är associerade till Vpg. Ändå ser vi detta omvända genetik system som en mycket effektiv en jämförbar med andra RNA-virus omvänd genetik som för närvarande används som in vitro transkriberade RNA tillåter återvinning av titrar bara 10-100 lägre än i verkliga infektioner med virioner 19, 20.
Överlag är de nuvarande metoderna utgör ett betydande steg framåt när det gäller norovirus molekylärbiologi och ger oss verktyg att undersöka funktionella roller proteiner och bevarade RNA motiv i norovirus genom. Dessa metoder har redan kombinerat med cktuellt musmodell tillgängliga och har visat att MNV utvinnas från infektiös cDNA kan orsaka livshotande infektion av> 80% STAT1-/ - möss på mindre än 10 dagarna 4, 21. Utnyttjar detta system har vi utvanns viabla murina norovirus mutanter av den kapsidprotein och ett polypyrimidine tarmkanalen involverad i bindningen av olika värdfaktorer (PTB och PCBP) som uppvisar ett något försvagade fenotyper in vivo 21, 22. Dessutom har vi nyligen visat att virus som saknar förmågan att uttrycka VF1 proteinet från ORF4 effektivt replikera i cellkultur men återigen har minskat virulens hos möss med avseende på WT MNV 8. Dessa studier uppmuntra oss att utforma försvagade versioner av humant norovirus som bygger på MNV studier som kunde undersökas som potentiella vaccinkandidater.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning har finansierats av ett Wellcome Trust Senior Fellowship tilldelades Ian Goodfellow, och en Marie Curie Intra European Fellowship (FP7 European Research Council) tilldelas Armando Arias. Vi vill tacka Io Hong Cheong, Dr Rebecca Robey och Dr Mike Skinner för att ge oss tillstånd att använda sin Agilent bioanalyser och hjälpa med rinnande RNA prover.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lithium chloride precipitation solution | Ambion | AM9480 | |
| RNA storage solution | Ambion | AM7000 | |
| ScriptCap m7G Capping System | Epicentre Biotechnologies | SCCE0610 | |
| Neon transfection system | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985070 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| Agilent RNA 600 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).
- Lopman, B. A. Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003. Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).
- Duizer, E. Laboratory efforts to cultivate noroviruses. J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).
- Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus. Science. 299, 1575-1575 (2003).
- Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
- Bok, K. Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome. Virology. 380, 328-337 (2008).
- Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection. Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).
- McFadden, N. Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4. PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).
- Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs. J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).
- Shuman, S., Hurwitz, J. Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).
- Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme. 44, 292-309 (1990).
- Chaudhry, Y. Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components. J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4. E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).
- Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation. J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).
- Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).
- Ward, V. K. Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).
- Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).
- Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus. PLoS One. 5, e10735 (2010).
- Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).
- Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo. J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).
- Bailey, D. Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence. J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).
