Summary
Noroviruses karakterizasyonu için gastroenterit henüz moleküler tekniklerin önemli bir nedeni vardır hala nispeten yeni. Burada fare norovirüs (MNV), hücre kültürü içinde yayılır edilebilir bu cinsin tek üyesi etkin kurtarma için iki farklı ters genetik yaklaşımlar rapor.
Abstract
İnsan noroviruses insan gastroenterit (GE), dünya çapında çoğu sorumludur ve yakın kişiden kişiye temas 1, 2, kaçınılması mümkün olmayan ortamlarda tekrarlayan bir sorundur. Son yıllarda hastanelerde salgınların görülme sıklığında artış operasyonel kapasitesinin yanı sıra büyük ekonomik kayıpları önemli aksamalar neden bildirilmiştir. Yeni antiviral yaklaşımların belirlenmesi hücre kültürü 3 üretken bir enfeksiyon tamamlamak için insan noroviruses yetersizlik nedeniyle sınırlı kalmıştır. Yakın insan norovirüs 4 fakat ilgili bir kemirgen norovirüs (MNV), son dönemde izolasyon hücrelerine 5 yayılır edilebilir bu patojenler 6, 7 ve soruşturma için yeni yollar açtı.
Yeni pozitif anlamda genomik ve alt genomik RNA moleküllerinin senteziyle in MNV replikasyon sonuçlar, bu sonuncusu son thi tekabülviral genomun rd (Şekil 1). MNV ORF1 genomunun en kaplar ve bir poliproteini prekürsör salınan yedi yapısal olmayan protein (NS1-7) kodlayan olan dört farklı açık okuma çerçeveleri (Orfs) içerir. ORF2 ve ORF3 alt genomik RNA bölge içinde ihtiva edilen ve kapsid proteinler (sırasıyla VP1 ve VP2), (Şekil 1) kodlayan edilir. Son zamanlarda, ORF2 örtüşen ek ORF4 belirlendi ancak farklı bir okuma çerçeve içinde fonksiyonel ve bir mitokondrial lokalize virulans faktörü (VF1) 8 kodlar var.
Noroviruses dahil olmak üzere pozitif anlamda RNA virüsleri, çoğaltma için yeni bir kapağını açıp RNA genomu ile senteziyle sonuçlanır sitoplazması içinde yer alır. Viral çeviri teşvik etmek, virüsler hücresel protein sentezi makine 9-11 işe yönelik farklı stratejiler istifade eder. İlginçtir, norovirüs çeviri çok fonksiyonlu viral protein-astar VPG tarafından tahrik edilirkovalent genomik ve alt genomik RNA'lar 12-14 hem 5 'ucuna bağlanmış. Çeviri Bu sofistike mekanizması konvansiyonel ters genetik yaklaşımlarla viral toparlanmanın sınırlı verimliliği önemli bir faktör olması muhtemeldir.
Burada mürin norovirüs-1'in kuşak (ilişikte MNV olarak anılacaktır) 5 'ucunda kapatılmış transkriptlerin göre iki değişik stratejiler rapor etmektedir. Ikinci yaklaşımın T7 RNA polimeraz ifade eden hücrelerdeki cDNA MNV transkripsiyonunu gerektirir, oysa yöntemlerden biri, in vitro ve in sentezi viral RNA'nın kapaklama hem içerir. MNV çalışma ve küçük bir hayvan modeli için bu ters genetik sistemlerin kullanılabilirliği çoğaltma ve patogenezi 15-17 viral dizilerin rolünü incelemek için eşi görülmemiş bir yetenek sağlamıştır.
Protocol
1. RNA transkripsiyonu ve Enfeksiyon MNV ve Kurtarma için Sınırı
Bu protokol, in vitro transkripsiyonu ve (bölüm 1.1) kapaklama in vitro olarak, izleyen in yoluyla cDNA'dan bulaşıcı MNV verimli bir şekilde geri kazanım izin verecek şekilde dizayn edilir. Ortaya çıkan maskeli transkript sonra bulaşıcı MNV (bölüm 1.2 ve 1.3) kurtarmak için hücrelerine transfekte edilir. Bu yaklaşım, 35 mm başına 10 5 enfeksiyöz birim (çapı)-çanak MNV için hücre aşan tipik verimleri ile MNV kurtarma için en hassas yöntemi sunar. Protokol aşağıda detaylandırılmıştır:
Bulaşıcı capped MNV transkript 1.1 Sentezi:
- NHE I doğrusal bir DNA elde etmek için NHE I MNV genomunun 3 'ucunun polyA (Şekil 2) sonra, benzersiz bir sınırlandırma bölgesi tanır.: Vahşi tip cDNA MNV (MNV 3'Rz pT7) içeren plazmid sindirmek. Linearised plazmidler tipik olarak saflaştınlırsilika sütunlar (GE Healthcare örneğin GFX PCR DNA Jel Bant izolasyon kiti) kullanarak ve H 2 O da akıtılan ile
- In vitro olarak daha önce tarif edildiği gibi 17 T7 RNA polimeraz kullanılarak linearised vektörü uyarlamak. Pek çok ticari kitler, bu amaç için kullanılabilir ve bu tür MEGAScript (Life Technologies) ve RiboMAX (Promega) gibi RNA sentezi büyük miktarda tekrarlanabilir bir yöntem sağlamaktır. Transkripsiyon reaksiyonları, tipik olarak DNAz daha analizden önce sindirilir; etkin DNA çöktürmek olmayan aşağıda tarif edildiği gibi Ancak pek çok durumda, bu lityum klorür saflandırma olarak gerekli değildir.
- RNA transkripsiyon reaksiyonu küçük bir alikotu analiz, tipik olarak transkripsiyon reaksiyonu sağlamak için agaroz jel elektroforezi ile az 0.5 ul ya da verimli bir şekilde çalışmaktadır ve RNA tam uzunlukta olup. Birçok kullanıcı doğru boyutu RNA jeller denatüre çalıştırmak isteyebilirsiniz iken, biz genellikle agaroz jel electrophor non-denatüre kullanınRNA bütünlüğü analiz etmek için hızlı bir yöntem olarak kalabilir. Gibi bulaşıcı cDNA klonu pT7 üretilen MNV genom: MNV 3'Rz olmayan bir denatüre agaroz jel (Şekil 3) bir dsDNA merdiven göre yaklaşık 3 Kbp çalışacaktır.
- Diğer yöntemler, böyle bir Agilent bioanalyser (Şekil 3) kullanılarak gibi RNA bütünlüğü hızlı bir analizi elde etmek için alternatif olarak mevcut olduğunu düşünün.
- Çok RNA yüklü ise bu yoksul jel çözünürlük karşılaştı olabilir unutmayın. Agaroz jel bandı çözünürlük etkileyebilir elektroforez sırasında RNA bozulmasını önlemek için RNAse ücretsiz reaktifler kullanılarak hazırlanmış olduğundan emin olmak için çok dikkatli olun. 65 ° C'de ısıtılarak RNA da bazı durumlarda yardımcı olabilir buzlu soğutma takip etmiştir.
- Tüzel kişiliği olmayan nükleotidleri kaldırmak için RNA örnek arındırın. Birçok yöntem bu protokol biz genellikle uygun maliyetli bir alternatif olarak lityum klorür kullanabilirsiniz, ancak bu da dahil olmak üzere silika kolon dayalı yaklaşımlar mevcuttur. IçinBu amaçla, 100 ul son hacim ulaşmak için H2O ekleme ve daha sonra lityum klorür çöktürme solüsyonu (7.5 M LiCI, 50 mM EDTA, pH 8,0, Ambion) ve 40 ul ilave ve en az -20 ° C 'de Örnek depolamak en az 30 dk.
- 4 de 12,000 x g'de santrifüj ile pelet RNA ° C'de 15 dakika süreyle.
- Saydam RNA pelet rahatsız ve% 70 etanol 150 ul onu yıkamak özen, süpernatantı. 15 dakika süre ile 4 ° C'de 12,000 x g'de santrifüje tüpü.
- , Etanol ve hava-kuru RNA çıkarın tamamen bu şekilde kurumaya pelet kaçınarak yeniden süspanse edilmesi zor hale getirir.
- Sonra, RNA depolama çözümü (Ambion), 50-100 ul içine MNV transkript tekrar süspansiyon. Bakım tüm RNA düzgün dağıldığını sağlamak için alınmalıdır. RNA tamamen çözülmesi zor görünmesinin, 60 örnek ısıtma ° C de tekrar süspansiyon yardımcı olabilir. Herhangi bir çözünmeyen malzeme daha sonra b çıkarılmalımiktar RNA önce y santrifüj. Saflaştırılmış transkriptlerin kapağını açtı ve (ScriptCap m7G Başlıklama Sistem, Epicentre Biotechnologies) virüslerin bulaşıcı olması için in vitro kapatma aşamasında, bir sonraki ihtiyaç vardır.
- Spektrofotometri ile RNA ölçmek. Transkripsiyon reaksiyonu doğasına ve ölçeğine bağlı olarak, tipik bir verim 100 ul transkripsiyon reaksiyonu başına RNA ile 50-150 ug arasında değişir. RNA bütünlüğü% 1 agaroz jel (Şekil 3) içine numune 100-300 ng tükeniyor tarafından kapatma reaksiyondan önce analiz edilmelidir.
- Kapatma RNA verimliliğini artırmak için, daha sonra ısı 60 ila 70 65 MNV RNA transkript mikrogram ° 10 dakika C ve buz üzerinde hemen tüp yerleştirin. Bu basamak üzerine kapaklama RNA yapısının bir inhibitör etkisini azaltabilir. Isıtma aşamasında oluşturulan damlacıklar toplamak için bir soğutulmuş mikrofuj içinde tüp darbe.
- Üretici (ScriptCap m7G tarafından önerilen bir kapatma reaksiyon karışımı hazırlayınKapatma Sistemi, Epicentre Biyoteknoloji). Kısaca, 100 ul'lik bir son reaksiyon hacmi MNV RNA'nın 60-70 ug ekleyebilir. Kapaklama Reaksiyon karışımı tamponu Başlıklama 10 x 10 ul (500 mM TrisHCl pH 8,0, 60 mM KCI, 12.5 mM MgCİ2), 10 mM GTP 10 ul, Scriptguard 20 mM S-adenozil metionin, 2.5 ul 0.5 ul içerebilir (100 ünite), ve Scriptcap enzim 4 ul (40 ünite).
- Kurmak reaksiyon sırasında bozulmasını önlemek için buz üzerinde transkript RNA tutun. Sıra reaksiyon karışımı karıştırmak ve daha sonra 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir bunun. Reaksiyon gerekli boyutu maskeli transkript miktarına göre ölçeklendirilebilir unutmayın.
- LiCl yağış tarafından RNA arındırmak olarak (nokta 1.1.6 bakınız) yukarıda açıklanmıştır. RNA depolama çözümü (Ambion), 50-100 ul yılında pelet eritilir ve RNA miktarını ölçmek. Tipik olarak, RNA örnekleri daha sonra 1 mcg / ml normalize edilmiştir. Yine, tüm RNA düzgün dağıldığını kontrol edin. Düzgün çözünmüş değilse, ısı tO numune 60 ° C sona ermesinde izin vermek. Santrifüj miktar RNA öncesinde herhangi bir çözünmeyen madde çıkarın.
- Transfeksiyon adıma geçmeden önce tekrar RNA bütünlüğünü denetleyin. Bu amaçla,% 1 agaroz jel (Şekil 3) içine numune 100-300 ng bir miktar çalıştırın.
Raw264.7 hücre içine RNA Neon-aracılı transfeksiyon 1.2 Kurtarma:
Bir serbest hücre hattı içinde MNV enfeksiyöz virionlar geri kazanımı için bir neon transfeksiyon sistemi (Invitrogen) ile Raw264.7 hücrelerin içine kapatılmış MNV transkript electroporate mümkündür. Raw264.7 virüs replikasyonu ve yeniden enfeksiyon izleyen birden fazla mermi destekleyen, MNV enfeksiyona duyarlı hücrelerdir. Sonuç olarak, tipik bir verim 48 saat sonra> 10 7 enfeksiyöz birim az 24 saat sonra transfeksiyon fakat üst düzeyde ml başına 10 5 enfeksiyöz birim aşan yaklaşacak.
- Tran bir gün öncesfection, tohum yaklaşık% 50 konfluense de Raw264.7 hücreleri. Tipik olarak hücrelerinin iki T75 şişeler 3 Transfeksiyonlar için gereklidir.
- Transfeksiyon gün, tekrarlanan pipetleme tek bir hücre süspansiyonu elde sağlanması,% 10 fetal sığır serumu (FCS) içeren Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamı (DMEM) içine hücre mono tabakaları sıyırmak.
- Cansız hücreleri etiketlemek için tripan mavisiyle çıkarma kullanılarak bir haemocytometer içinde yaşayabilir hücrelerin konsantrasyonunu belirlemek.
- 5 dk ve DMEM 8 x 10 6 hücre / ml 'lik nihai bir konsantrasyon az% 10 FCS içeren bunların tekrar süspansiyon için 1200 x g'de pelet hücreleri.
- Sadece 2 dakika süre ile transfeksiyonu ve 1200 x g'de pelet bunların her hücrelerinin transfeksiyonu, alikotu 1 ml öncesinde. Medyayı çıkartın ve PBS 500 ul (Mg 2 + / Ca 2 + olmadan) hücreleri yıkayın. 2 dakika boyunca 1200 x g'de tekrar hücre aşağı doğru dönmeye başlayacaktır. Bunu mümkün olduğunca uzun süre için DMEM hücrelerin saklanması önerilir Notgibi uzun süreler için PBS depolama hücre canlılığı ve transfeksiyon oranı tehlikeye atabilir.
- Tüplerinden PBS kaldırmak ve 6 x 10 7 hücre / ml 'lik nihai bir konsantrasyona yeniden süspanse çözeltinin 130 ul (neon transfeksiyon sistemi kit, Invitrogen) ilave edilir. Bakım transfeksiyon ve uzlaşma hücre sağkalım sırasında kıvılcım neden olur kabarcıklarının oluşumunu engeller hücreleri tekrar süspansiyon için önlemler alınmalıdır.
- Hücrelerinin (Şekil 2) ile kaplı MNV transkriptinin uygun miktarda ekleme, kapaklı RNA, genellikle 1.3 ug tekrar süspanse edilir ve hücreleri karışım yavaşça 130 ul kadar ilave edilir. Daha sonra, 100 ul neon transfeksiyon ucu karışımı 100 ul toplayabilir. Özel bakım Bu denemenin başarısız olmasına neden olacak gibi kabarcıklar elektroporasyon küvet (Neon transfeksiyon sistem kiti 100 ul ucu) olarak oluşmasını sağlamak için önlemler alınmalıdır.
- 25 msn, tr için 1.700 V tek bir darbe kullanarak hücrelerin ElectroporateÖrnek olarak kabarcıklarının bulunduğuna işaret edecektir hangi darbeli sırasında kıvılcım yokluğunda kaybedilen. Kıvılcım halinde gerçekleşmesi gerektiğini, örnek atmak ve transfeksiyon tekrarlayın. Antibiyotik serbest DMEM% 10 FCS ihtiva eden 1 ml içeren bir Eppendorf tüpüne hücreleri bırakın. Transfekte hücreler daha fazla sayıda gerekiyorsa her ucu aynı RNA örnek üç kereye kadar yeniden kullanılabilir unutmayın.
- Bundan sonra,% 10 FCS ihtiva eden önceden ısıtılmış antibiyotik serbest DMEM uygun bir miktarını ihtiva eden bağımsız olarak kuyulara tüpten hücreleri dağıtın. 300 ul bir 12-çanağı plakası bir kuyucuk için uygun olan, oysa genel bir kılavuz olarak, adım 1.2.8 sırasında oluşan hücre süspansiyonu 150 ul, önceden ısıtılmış ve 0.5 ml DMEM ihtiva eden bir 24-çanağı levhanın hem tek için yeterlidir önceden ısıtılmış 1 ml DMEM içeren.
- 37 hücreleri inkübe ° C ve 10% 24-72 saat boyunca CO 2. Daha sonra, bir (veya daha fazla) göre hücrelerden bulaşıcı virionlar serbestdonma ve çözülme döngüleri ve plak testi veya TCID50 kullanarak örnek virüs titre belirler. Lizatları maksimum hızda ya da titrasyon öncesinde 0.22 mikron gözenek filtresi aracılığıyla filtre edilerek 1-2 dakika santrifüj tarafından açıklığa kavuşturulması gerektiğini unutmayın. Tipik olarak, MNV kadar 1 x 10 9 ila 72 saat sonrası transfeksiyon az 1 etrafında x 10 6 24 saat sonrası transfeksiyon at TCID50/ml ve titreleri ulaşır.
- Varlığı ve pT7 tanıtılmıştır mutasyonların stabilite: MNV 3'Rz tipik Raw264.7 hücrelerinde 2-5 ilave bölümler sonra kurtarılan virüs sekans tarafından belirlenir.
BHK-21 hücre içine lipofection tarafından 1.3 Kurtarma:
Capped transkript bulaşıcı MNV geri kazanımı için daha doğrudan ve genellikle daha uygun maliyetli bir yöntem lipofection (lipofektamin 2000, Invitrogen) yoluyla olmaktadır. Biz normalde oth faydalanmak Raw264.7 hücreleri lipid temelli yaklaşımlar kullanarak transferinde zor olduğu göz önüne alınırsakolay bir er gibi bebek hamsteri böbrek fibroblastlar türetilmiş bir ölümsüzleştirdi çizgi BHK-21 gibi hücre hatları transferinde. Bu hücrelerin MNV çoğaltma transferinde ve desteklemek için kolay iken, onlar uygun bir reseptör yoksun olarak laboratuarımızda standart bir yaklaşım olarak biz izin BSR-T7 hücreleri, BHK-21 hücre hattı bir türevi kullanımı yeniden enfeksiyona birkaç tur . Sonuç olarak, bu sistem elde virüsü verim virüs kopyelemenin tek bir döngü bir göstergesidir. Birden çok transfeksiyonlar Neon-aracılı transfeksiyon ve ayrıca uzman ekipman gerektirmez karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalır ücreti yapılması sağlar gibi virüs kurtarma mutasyonun etkisi incelenirken Bu yaklaşım, özel kullanım olduğu. Böyle insan embriyonik böbrek 293T hücreleri gibi diğer hazır hücre serilerinde de ilk verimli RNA teslimini sağlamak için optimize edilmelidir MNV Ancak transfeksiyon koşullarının etkin kurtarma desteği dikkati çekiyor.
- TripsinISE BHK-21 hücreleri (veya BSR-T7 hücreleri), tohum 7.5 x 10 antibiyotik 5-free büyüme ortamı içinde 35 mm çapında çanağı içine hücreleri ve 2 gece boyunca 10% CO ile 37 ° C'de inkübe edilir hücreleri. bir tek tabakalı Transfeksiyonlar tohumlama ile aynı gün için planlanan eğer her plaka hücrelerin miktarı çift ve hücrelerin% 10 CO 2 ile 37 ° C'de 2-3 saat plaka uymak için izin verir. Bu yaklaşıma uygun olan diğer hücreleri insan 293T hücreler, insan hepatoselüler karsinom HuH7 hücreleri ve Afrika yeşil maymun Cos7 hücreleri içerir unutmayın.
- Hücrelerinden ortamı çıkarın ve transfeksiyon maksimum verimliliği sağlamak için antibiyotik olmadan taze medya 3 ml ile değiştirin.
- Opti-MEM (Invitrogen) 100 ul içine kapaklı MNV transkript 1-2 mikrogram karışımı hazırlayın ve daha önce Opti-MEM 100 ul karıştırılır lipofektamin 2000 4 ul karıştırın. 15 kez aşağı yukarı pipetleme ve iyice karıştırın örnek. Ayrılmak20 dakika için oda sıcaklığında karışıma.
- Hücre tek tabakalı bir drop-bilge moda maskeli MNV transkript içeren transfeksiyon kompleksleri ekleyin ve hafifçe dik yönde plaka sallayın.
- 37 hücreleri inkübe ° C ve 10% 24-72 saat boyunca CO 2. Daha sonra dondurma ile hücrelerden bulaşıcı virionlar bırakın ve çözülme ve plak testi veya TCID50 tarafından virüs titre belirlemek. Yaklaşık 1 x 10 6 TCID50/ml tipik verimleri ulaşılır.
2. T7 RNA polimeraz ifade eden Cells in cDNA'dan Infectious MNV doğrudan Recovery
Bu protokol, enfeksiyöz bir plazmid barındırılmasının hücrelerinde eksprese edilen bir T7 polimeraz tarafından tam genomik cDNA sekansının transkripsiyonda hücrelerinde MNV ve geri kazanım izin verecek şekilde dizayn edilir. Bu tipik olarak BHK-21 ve BSR-T7 ile ce yüksek verimler elde rağmen farklı hücre hatları, bu yaklaşım enfeksiyöz MNV kurtarmak için kullanılabilirlerLLS 15. Onlar ebeveyn BHK klon hattı daha hızlı büyüdüğü için biz genellikle BSR-T7 hücreleri kullanır. Hücreler viral RNA ve bulaşıcı virüsün sonraki iyileşme (Şekil 4) ile ifade sürmek için bir yardımcı virüs olarak işlev görür T7 RNA polimeraz (FPV-T7) 18 için tavuk çiçeği (FPV) kodlaması ile enfekte edilmiştir. Helper FPV-T7 ile yokluğunda MNV 3'Rz: BSR-T7 hücreleri Konstitütif olarak ekspres T7 RNA polimeraz olsa da, bu ifadenin pT7 sırasında transfeksiyonundan sonra enfeksiyöz MNV kurtarmak için yeterli değildir. Bu sistem, tipik verimleri yukarıda tarif edilen en az 10 kat daha düşük olduğu halde bu yaklaşım zayıflatıcı mutasyonların tanımlanabilmesi için eleme mutantlarının hızlı bir yöntem sağlamaktır yapar. Tipik olarak, bu yöntem, bir cDNA yapısından canlılığı değerlendirmek için birinci kullanılır. Bir sonra, bulaşıcı virüs üretmek için başarısız ya da vahşi tip bulaşıcı klonu ondan daha düşük seviyelerde virüsü elde etmek için görünür ya RNA bazlı approa oluşturmak olmalıdırYukarıda açıklanan ch yapılmaktadır.
- BHK-21 hücreleri (veya BSR-T7 hücreleri) ve tohum 7.5 x 10 5 antibiyotik serbest büyüme ortamı içinde 35 mm çanağı içine hücreler ve 37 ° C'de inkübe edilir hücreleri,% 10 CO 2 gece boyunca bir tek tabakalı Trypsinise. Transfeksiyonlar tohumlama ile aynı gün için planlanan eğer her plaka hücrelerin miktarını ikiye ekleyin ve hücreler 37 az 2-3 saat, plaka uymak izin ° C ve% 10 CO 2.
- Hücre kültür ortamına çıkartın ve (Şekil 4) Her bir kuyuya FPV-T7 700 ul ekleyin. Birincil tavuk embriyo fibroblast titrasyonları dayalı ~ 0.5 PFU her hücre, enfeksiyon A çokluğu (İçişleri Bakanlığı) genellikle kullanılır. Ancak birincil fibroblastlar yetiştirilen yardımcı virüsü yeni hazırlıklar işlevsel olarak etkin virüs kurtarma için gerekli dozu belirlemek için titre edilir dikkati çekiyor. FPV-T7 ile yayılımı ve titrasyonu için protokolleri, daha önce 18 tarif edilmiştir.
- Içinde° C'de ve 1 saat için 10% CO 2 FPV-T7 hücreleri enfekte izin vermek için, 37 cubate. Sonra, antibiyotik serbest DMEM% 10 FCS içeren 2 ml ekleyin ve 37, ek bir saat için hücreler ° C'de inkübe edilir ve T7 RNA polimeraz ifadesi izin vermek için% 10 CO 2.
- Bulaşıcı plazmid transfeksiyon ile devam etmek için, ilk olarak enfekte olmuş hücreler, ortam kaldırmak, ortam, 2 ml (antibiyotik serbest DMEM% 10 FCS) ile yıkama ve son olarak da ortam 3 ml ile hücre mono tabakasında kapsamaktadır. Onlar lipofektamin 2000 (Invitrogen) etkinliğini etkileyebilir yana Antibiyotikler medya ilave edilmemelidir.
- Yabani tipte 1 ug bir karışımını hazırlamak MNV cDNA (örn. pT7: MNV 3'Rz) bulaşıcı bir plazmid 100 Opti-MEM (Invitrogen) ile ul ve lipofektamin 2000 4 ul karışımı içinde (Invitrogen), daha önce 100 ul ile karıştırılır Opti-MEM (Invitrogen). 15 kez aşağı yukarı pipetleme ve iyice karıştırın ve reaksiyon oda tempe az karışımı tutmak20 dakika boyunca problemsizce.
- Ortaya çıkan karışım daha sonra transfeksiyon eklenmelidir hücre mono tabakasında üzere açılan akıllıca ve plaka yavaşça dik yönde çalkalandı edilmelidir.
- 37 FPV-T7 ile enfekte olmuş, MNV plazmid-transfekte edilmiş hücrelerin inkübe ° C ve 10% 24-72 saat boyunca CO 2. Bulaşıcı plazmid pT7 ile transfekte Hücreleri: MNV 3'Rz normalde 1 x 04-05 Ekim x 10 4 TCID50/ml gelen titreleri kılıyor.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 5 'de gösterildiği gibi her iki karşıt genetik yaklaşım, hücre kültürü içinde bulaşıcı MNV geri kazanılması için son derece etkilidir. 10 5 TCID50/ml aşan titrelere sahip Bulaşıcı MNV Raw264.7 hücrelerin içine kapatılmış MNV RNA aktarılmasının 24 saat sonra kurtarıldı. Benzer şekilde, bulaşıcı plazmid pT7 transfeksiyon: BSR-T7 hücrelerine MNV 3'Rz önceden helper FPV viral titrelere yol T7 (FPV-T7) büyük ölçüde excee ifade ile enfekteding 10 4 TCID50/ml (Şekil 5). Sentetik RNA ve DNA molekülleri ile elde edilen bu viral titresi değerleri aynı hücreleri (Şekil 5) içine bulaşıcı virionlar izole doğal VPG-bağlı RNA içeren Transfeksiyonlar elde edilenlere benzer. Bu sonuçlar genetik hücre kültüründe MNV varyantları tanımlanmıştır kurtarmak için burada açıklanan ters genetik yaklaşımların yüksek verimlilik vurgulayın.
Şekil 1.. MNV genomu ve bulaşıcı virüsün kurtarma için plazmid İllüstrasyon. MNV genom organizasyonu A, şematik. Bölge kodlama Her protein, tek bir beyaz kutu olarak gösterilir. ORF1 kendine proteolitik işlendikten sonra öncü poliprotein salınır 7 farklı yapısal olmayan protein (NS1 / 2 NS7) çevrilir. ORF 2 majör kapsid proteini VP1 kodlar, ORF 3 küçük kap kodlarORF2 kodlama bölge ile örtüşen sid protein VP2 ve ORF4 virulans faktörü VF1 kodlar. Genomik ve alt genomik RNA'lar değişken uzunlukta bunların 3 'ucunda bir polyA içerir. B, Plazmid içeren MNV cDNA bizim ters genetik yaklaşımlar (pT7: MNV 3'Rz) kullanılır. CDNA MNV da 3 'ucunda bir 26 artıkları polyA eritilerek yapıştırılır. MNV cDNA sekansı hemen aşağısında kesilmiş bir T7 promotörü dizisi, T7 tahrikli transkripsiyon izin vermek için, yukan doğru ve eşsiz bir NHE I sitesi ve daha sonra bir kendi kendine yarma ribozimi kodlayan bir DNA dizisi arasında yer alır. Bu sekanslar doğru 3 'ucunda genomik polyA Mevcut sonra RNA transkripsiyon terminasyon sağlanması için bir araç bulunmaktadır.
Şekil 2. Transkripsiyonu ve in vitro şapkalı RNA bulaşıcı MNV kurtarma için protokol Bakış plazmid pT7:. MNV 3'Rz hemen aşağısında linearised edilirNHE I kısıtlama enzimiyle (adım 1) kullanılarak MNV genomik dizisi. DNA saflaştırıldıktan sonra, MNV RNA transkriptlerin T7 RNA polimeraz (adım 2) kullanılarak in vitro olarak oluşturulur. Transkripsiyon ürünler genellikle 2.5-3KB belirgin bir hareketlilik ile çalıştırmak olmayan bir denatüre% 1 agaroz jel (adım 3, Şekil 3). Şablon DNA, ticari bir RNAse serbest DNAz kullanılarak elimine edilir. RNA sonra LiCI yağış (adım 4) serbest nükleotidleri arındırılan. Saflaştırılmış RNA ürün daha sonra, in vitro olabilir, daha önce 65 az ısıtıldıktan sonra kapatılmış ° C ikincil yapı RNA (adımları 5-6) açılmak. LiCI çökelme ile saflaştırıldıktan sonra, RNA Raw264.7 hücreleri (neon transfeksiyon sistemi, Invitrogen) ya T7 BSR-hücreleri (lipofektamin 2000, Invitrogen) (adımları 7-8) ya da transfekte edilir. Bir kez hücre içinde, maskeli RNA transkript yeni MNV RNA molekülleri viral transkript çoğaltma katalize olurdu viral protein tercüme edilecektirbunların 5 'ucuna bir şekilde VPG molekülü içeren. Viral çeviri eşlik replikasyon Ardışık döngüleri bulaşıcı virionlar oluşturmak için kapsül içine edilecektir viral genom çok sayıda üretecek. Hücrelerinden virüsü yayın kolaylaştırmak için, donma ve çözülme bir veya birkaç döngüleri (adım 9) gerçekleştirilir. Viral verimi daha sonra TCID50 veya plak test prosedürü ile tespit edilebilir.
Şekil 3. Protokol boyunca MNV RNA transkriptlerin bütünlüğü analizi. MNV RNA A, bütünlüğü in vitro olarak sentezlendi. Plazmid pT7: MNV 3'Rz öncelikle NHE I sınırlandırıcı enzim kullanılarak linearised edilir. DNA saflaştırıldıktan sonra, MNV RNA transkriptlerin T7 RNA polimeraz (şeritli 2) kullanılarak in vitro olarak oluşturulur. RNA sonra purifi olduğu LiCl yağış (yol 3) tarafından ücretsiz nükleotidlerini ed. Transkripsiyon ürünler 1-Kb DNA merdiveni (New England Biolabs, hat 1) paralel olmayan bir denatüre% 1 agaroz jel üzerinde çalışır. Non-denatürasyon koşulları altında viral transkriptlerin Nispi hareket 2,5-3 kb'lik bir dsDNA ürünü ile benzerdir. Örtümü sonra MNV RNA transkript B, Dürüstlük. LiCI çöktürme (şeritli 2) daha önceden saflaştırılmış tarafından MNV transkriptlerin enzimatik kapaklama (yol 3) ve LiCI çöktürme (hat 4) ile saflaştırma işlemlerine tabi tutulur. C, MNV transkript (ikinci şerit) ve daha önce LiCI çöken edilmiş kapaklı MNV transkript (üçüncü şerit) bir Agilent RNA 6000 Nano çip Analiz. Bir ssRNA merdiven paralel olarak çalıştırılır.
= "Pdflinebreak"> 
Şekil 4. CDNA'dan bulaşıcı MNV kurtarma için protokol özeti. Başlangıçta, BSR-T7 (veya BHK) hücreleri bakteriyofaj T7 RNA polimeraz (FPV-T7) (adım 1) ifade eden bir rekombinant tavuk çiçeği virüsü (FPV) ile enfekte olmaktadır. Rekombinant T7 RNA polimeraz (adım 2) içerir FPV proteinlerinin ifadesini sağlamak için başka tedavi öncesinde enfekte olmuş hücreler 2 saat süreyle inkübe edilir. Daha sonra, pT7: MNV 3'Rz lipofektamin 2000 (Invitrogen) (3. aşama) kullanılarak hücrelerin transfekte edilir. Bir kez hücre, pT7 içinde: MNV 3'Rz MNV RNA transkript (adım 4) sentezler T7 RNA polimeraz tarafından tanınır. Genomunun 3'end az bir öz-kesici, δ-ribozim sekansı varlığında transkript 3 't garantierminus sadece polyA (adım 5) sonra yer alır. Bazı viral transkript intraselüler bir FPV kapaklama enzim (6. adım) tarafından örtülmüştür. Çıkan MNV maskeli transkript MNV transkript çoğaltma katalize olurdu MNV proteinler üretmek için tercüme edilecektir. Bunların 5 'ucuna bir şekilde VPG molekülü içeren yeni sentezlenmiş MNV RNA moleküllerinin nihayet bulaşıcı kapsül içine virüsünün üretimi ile sonuçlanabilir viral çevirisi eşlik replikasyon arda döngüleri tabi olur. Hücrelerinden virüsü yayın kolaylaştırmak için, donma ve çözülme bir veya birkaç döngüleri (adım 7) gerçekleştirilir. Viral verimi daha sonra TCID50 veya plak test prosedürü ile tespit edilebilir.
Şekil 5. Metin içinde anlatıldığı farklı bir karşıt genetik yaklaşır elde edilen virüs titrelerini temsil eden sonuçlar. Gri çubuklar Neon 24 saat sonra elde virüs titreleri temsil2 x 10 6 Raw264.7 hücreleri, ya da sonra bir transfeksiyon in vitro transkripsiyonu ve kapaklı MNV RNA ile 2 x 10 6 BSR-T7 hücrelerinin lipo-transfeksiyon. 2 x önceden rekombinant T7 polimeraz (FPV-T7) eksprese eden tavuk çiçeği virüsü ile enfekte olmuş 2 saat süreyle 10 6 BSR-T7 hücrelerine MNV 3'Rz (MNV cDNA): Beyaz barlar arasında tipik olarak pT7 lipofection sonra elde edilen virüs titre temsil eder. Ham ve BSR-T7cells içine transfeksiyon için, bir pozitif kontrol olarak, tipik olarak VPG-linked MNV RNA yüksek seviyede içerirler MNV ile enfekte olmuş hücreler çıkarılır RNA'nın 2 ug kullanabilir. Negatif kontroller MNV RNA veya pT7 biriyle yapılmıştır: MNV 3'Rz saptanabilir virüsü (veriler gösterilmemiştir) sonuçlanan, çoğaltma lağvetti bir çerçeve kayması mutasyonu (F / S) kodlayan.
Discussion
Burada hücre kültüründe enfeksiyon MNV iyileşme sağlayan iki farklı ters genetik yaklaşımlar gösterdik. Etkili bir şekilde daha sonra hücresel ribozom tarafından tanınan kapaklı MNV transkriptlerin üretimi ile viral RNA genomu 5 'ucuna VPG arasında kovalan bağlantı için kaçınılmaz bir gerekliliktir bypass yaklaşır hem. Enzimatik kapaklama takiben in vitro transkripsiyonu sonucunda da daha etkili olduğunu transkriptlerin FPV kapaklama enzimleri ile kaplı edilebildiği T7 RNA polimeraz, Salgılayan hücrelerin enfeksiyöz plasmidlerin transkripsiyon daha bulaşıcı MNV geri kazanımı. Bu karşıt genetik sistem ile geri kazanılan virüs titreleri enfekte hücre kültürlerinde 17 (Şekil 5) ile saflaştırılmış viral VPG-bağlı RNA transfeksiyon ile elde edilen bu gibidir. Müsamahakar Raw264.7 hücrelere kapaklı MNV RNA transfeksiyonundan transfectio içeren deneyler ile kıyaslandığında sadece 1-log daha düşük bir virüs titre vermektedirn viral VPG-bağlı RNA (Şekil 5) içeren enfekte olmuş hücreler elde edilen toplam RNA. Bu gerçek, bu sistem tarafından üretilen transkriptlerin 5 'ucuna bir VPG molekülün Ayrıca VPG ilişkili hücrelerinde MNV enfektivite yatan işlevsel yönlerini ortaya çıkarabilir artış virüsü verimleri ile sonuçlanabilir olup olmadığını belirlemek için daha ileri araştırmalar teşvik eder. Diğer RNA virüsleri ile karşılaştırılabilir bir yüksek verimli bir genetik sistemleri şu anda in vitro transkripsiyon RNA virionlar 19, 20 gerçek enfeksiyonları daha sadece 10-100 düşük titreleri kurtarma olanak sağlayan kullanılan ters olarak Bununla birlikte, bu ters genetik sistem görüyoruz.
Genel olarak, mevcut metodolojiler norovirüs moleküler biyoloji alanında önemli bir adım oluşturan ve norovirüs genomlarında proteinler ve korunmuş RNA motiflerin fonksiyonel rolleri araştırmak için araçlar bize. Bu yaklaşımlar zaten c ile kombine edilmiştir10 günden daha kısa 4, 21 farelerde - urrent fare modelinde kullanılabilir ve MNV bulaşıcı cDNA'dan geri göstermiştir ki,>% 80 STAT1-/ öldürücü enfeksiyonunun yol edebilmektedir. Biz kapsid protein ve in vivo 21, 22 biraz zayıflatılmış fenotipleri gösterilecek farklı konakçı faktörleri (PTB ve PCBP) bağlayıcı karışan polypyrimidine yollarının uygulanabilir murin norovirüs mutantlar iyileşti bu sistemin kullanılması. Buna ek olarak, son zamanlarda yeniden hücre kültürü içinde etkin bir şekilde çoğaltmak ORF4 gelen VF1 proteini ifade etme yeteneğine ancak yoksun virüsler WT MNV 8 ile ilgili olarak, farelerde virülans azaltılmış olduğunu göstermiştir. Bu çalışmalar bize potansiyel aşı adayı olarak incelenebilir MNV çalışmalara dayalı insan noroviruses zayıflatılmış sürümleri tasarlamak için teşvik ediyoruz.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma Ian Goodfellow ve Armando Arias verilen Marie Curie Avrupa İçi Bursu (7.ÇP Avrupa Araştırma Konseyi) verilen bir Wellcome Trust Kıdemli Kardeşliği tarafından finanse edildi. Biz, bize onların Agilent bioanalyser kullanma izni veren ve RNA örnekleri çalışan yardım için Io Hong Cheong, Dr Rebecca Robey ve Dr Mike Skinner teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lithium chloride precipitation solution | Ambion | AM9480 | |
| RNA storage solution | Ambion | AM7000 | |
| ScriptCap m7G Capping System | Epicentre Biotechnologies | SCCE0610 | |
| Neon transfection system | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985070 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| Agilent RNA 600 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).
- Lopman, B. A. Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003. Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).
- Duizer, E. Laboratory efforts to cultivate noroviruses. J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).
- Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus. Science. 299, 1575-1575 (2003).
- Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
- Bok, K. Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome. Virology. 380, 328-337 (2008).
- Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection. Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).
- McFadden, N. Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4. PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).
- Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs. J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).
- Shuman, S., Hurwitz, J. Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).
- Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme. 44, 292-309 (1990).
- Chaudhry, Y. Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components. J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4. E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).
- Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation. J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).
- Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).
- Ward, V. K. Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).
- Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).
- Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus. PLoS One. 5, e10735 (2010).
- Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).
- Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo. J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).
- Bailey, D. Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence. J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).
