Summary
Norovirussen zijn een belangrijke oorzaak van gastro-enteritis nog moleculaire technieken voor de karakterisering zijn nog relatief nieuw. Hier rapporteren wij twee verschillende reverse genetics benaderingen voor de doeltreffende inning van murine norovirus (MNV), het enige lid van dit geslacht die kunnen worden gekweekt in celcultuur.
Abstract
Menselijke norovirussen zijn verantwoordelijk voor de meeste gevallen van de menselijke gastro-enteritis (GE) de hele wereld en zijn steeds terugkerend probleem in een omgeving waar bijna van persoon tot persoon contact niet kan worden vermeden 1, 2. Gedurende de laatste jaren een toename in de incidentie van uitbraken in ziekenhuizen gemeld, waardoor hinderlijke storing in hun operationele capaciteit en de grote economische verliezen. De identificatie van nieuwe antivirale benaderingen is te wijten aan het onvermogen van de menselijke norovirussen naar een productieve infectie te voltooien in cel cultuur 3 beperkt. De recente isolatie van een murine norovirus (MNV), nauw verwant aan humane norovirus 4, maar die kunnen worden gekweekt in cellen 5 heeft nieuwe wegen voor het onderzoek van deze pathogenen 6, 7.
MNV replicatie resulteert in de synthese van nieuwe positieve zin genoom en subgenomische RNA moleculen deze overeenkomt met de laatste third van het virale genoom (figuur 1). MNV bevat vier verschillende open leesramen (ORFs), waarvan ORF1 neemt de meeste van het genoom codeert en zeven niet-structurele eiwitten (NS1-7) vrij uit een polyproteïne precursor. ORF2 en ORF3 staan in het subgenomische RNA regio coderen capside eiwitten (VP1 en VP2, respectievelijk) (figuur 1). Onlangs hebben we vastgesteld dat extra ORF4 overlappende ORF2 maar in een andere leesraam functioneel en codeert voor een mitochondriaal gelokaliseerde virulentiefactor (VF1) 8.
Replicatie van positieve RNA virussen, zoals norovirussen, vindt plaats in het cytoplasma, waardoor de synthese van nieuwe afgetopte RNA-genomen. Om virale het vertalen te bevorderen, virussen te exploiteren verschillende strategieën die gericht zijn op het werven van de cellulaire eiwitsynthese machines 9-11. Interessant is norovirus vertaling gedreven door de multifunctionele virale eiwit-primer VPGcovalent gebonden aan het 5'-uiteinde van zowel genomische en subgenomische RNA 12-14. Dit verfijnde mechanisme van de vertaling zal waarschijnlijk een belangrijke factor in de beperkte efficiëntie van virale herstel door middel van conventionele reverse genetics benaderingen zijn.
Hier rapporteren twee verschillende strategieën gebaseerd op het genereren van muizen norovirus-1 (aangeduid als MNV hierbij) transcripten beperkt tot het 5 'uiteinde. Een van de methoden betreft zowel in vitro synthese en de aftopping van de virale RNA, terwijl de tweede benadering houdt in de transcriptie van MNV cDNA in cellen die T7 RNA-polymerase. De beschikbaarheid van deze reverse genetics systeem voor de studie van MNV en een klein diermodel heeft een ongekende mogelijkheid om de rol van virale sequenties in replicatie en pathogenese 15-17 ontleden.
Protocol
1. RNA transcriptie en caps voor het herstel van Infectious MNV
Dit protocol is bedoeld om de doeltreffende inning van besmettelijke MNV van cDNA toe te staan via in vitro transcriptie en de latere in-vitro-aftopping (paragraaf 1.1). De resulterende bedekte transcripties worden vervolgens getransfecteerd in cellen aan besmettelijke MNV (punten 1.2 en 1.3) terug te krijgen. Deze benadering heeft de meest gevoelige werkwijze voor het terugwinnen van MNV typische opbrengsten van meer dan 10 5 infectieuze eenheden per 35 mm (diameter)-schaal van cellen voor MNV. Het protocol is hieronder weergegeven:
1.1 Synthese van besmettelijke capped MNV transcripties:
- Digest het plasmide met het wild type MNV cDNA (PT7: MNV 3'Rz) met Nhe I tot en met lineaire DNA te verkrijgen Nhe I erkent een unieke restrictie site na het 3 'uiteinde polyA staart van MNV genoom (figuur 2).. Gelineariseerde plasmiden worden gewoonlijk gezuiverdmet het gebruik van silica kolommen (bijv. GFX PCR DNA-Gel Band Zuivering Kit van GE Healthcare) en geëlueerd in H 2 O.
- In vitro transcriptie de gelineariseerde vector met T7 RNA-polymerase als eerder beschreven 17. Vele commerciële pakket voor dit doel een reproduceerbare wijze grote hoeveelheden RNA synthese zoals MEGAScript (Life Technologies) en RiboMAX (Promega). Transcriptie reacties worden gewoonlijk DNAse voor gedigereerd verdere analyse, maar in vele gevallen is dit niet nodig zoals lithiumchloride reinigingen zoals hieronder beschreven niet neerslaan DNA efficiënt.
- Analyseren een kleine hoeveelheid van de RNA transcriptiereactie, gewoonlijk 0,5 ul of minder met behulp van agarosegelelektroforese voor de transcriptie reactie zorgen heeft doeltreffend gewerkt en RNA volledige lengte. Hoewel veel gebruikers wilt uitvoeren denaturering gels op de juiste grootte van het RNA, Wij gebruiken meestal de niet-denaturerende agarosegel electrophorESIS een snelle werkwijze voor RNA integriteit analyseren. De MNV genoom als uit de infectieuze cDNA kloon PT7: MNV 3'Rz loopt ongeveer 3 kbp opzichte van een dsDNA trap op een niet-denaturerende agarose gel (figuur 3).
- Bedenk dat andere methoden beschikbaar zijn als alternatief voor een snelle analyse van RNA integriteit te verkrijgen zoals met een Agilent bioanalyser (figuur 3).
- Merk op dat een slechte gel besluit kan worden aangetroffen als er te veel RNA wordt geladen. Besteden veel zorg aan de agarose gel wordt bereid met behulp van RNAse-vrij reagentia aan RNA degradatie te voorkomen tijdens de elektroforese welke band besluit kan beïnvloeden. Verwarming RNA tot 65 ° C gevolgd door afkoelen op ijs kan ook helpen in sommige gevallen.
- Zuiver RNA monster tot de niet opgenomen nucleotiden te verwijderen. Veel methoden zijn beschikbaar voor deze waaronder silica kolom op basis benaderingen echter in dit protocol hebben we meestal lithium chloride te gebruiken als een kosteneffectief alternatief. VoorDaartoe toe H2O tot een eindvolume van 100 pi bereiken en voeg 40 pi van lithiumchloride neerslag oplossing (7,5 M LiCl, 50 mM EDTA, pH 8,0 Ambion) en opslaan van het monster bij -20 ° C gedurende minimaal 30 minuten.
- Pellet de RNA door centrifugeren bij 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, zorg ervoor dat u de doorschijnende RNA pellet te verstoren en te wassen in 150 ul van 70% ethanol. Centrifugeer de buis 12.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten.
- Verwijder de ethanol en drogen het RNA, het vermijden van de pellet volledig uit te drogen, omdat dit zal resuspensie moeilijk.
- Vervolgens mengen de MNV transcripties in 50-100 ul van RNA storage-oplossing (Ambion). Men dient om de RNA correct opgelost. Indien de RNA blijken moeilijk volledig oplossen, het verhitten van het monster tot 60 ° C kan helpen te mengen. Eventuele onoplosbare materiaal moet dan worden verwijderd by centrifugeren voor kwantificering RNA. Het gezuiverde transcripties zijn open liggen en vereisen een volgende in vitro aftopping stap te zijn besmettelijk (ScriptCap m7G Aftoppings System, Epicentre Biotechnologie).
- Kwantificeer het RNA door middel van spectrofotometrie. Afhankelijk van de aard en omvang van de transcriptie reactie typische opbrengsten variëren 50-150 ug RNA per 100 ul transcriptiereactie. De integriteit van RNA worden geanalyseerd voor de capping reactie van bijna 100 tot 300 ng van het monster in een 1% agarose gel (figuur 3).
- Om de doelmatigheid van RNA capping verbeteren warmte 60-70 ug RNA-transcripten MNV bij 65 ° C gedurende 10 min en dan onmiddellijk plaats de buis op ijs. Deze stap kan worden verkleind remmend effect van RNA structuur van de afdekking. Pulse de buis in een gekoelde microfuge tot druppeltjes gevormd tijdens de verhittingstrap verzamelen.
- Maak een aftopping reactiemengsel zoals voorgesteld door de fabrikant (ScriptCap m7GAftopping System, Epicentre Biotechnologie). Kort toevoegen 60-70 ug RNA MNV een laatste reactie volume van 100 ul. De capping reactiemengsel kan 10 pi 10 x Aftoppings buffer (500 mM TrisHCl pH 8,0, 60 mM KCl, 12,5 mM MgCl2), 10 pi 10 mM GTP, 0,5 ul 20 mM S-adenosylmethionine, 2,5 pi Scriptguard (100 eenheden), en 4 pi Scriptcap enzym (40 eenheden).
- Tijdens de reactie zetten, te houden RNA-transcripten op het ijs om degradatie te voorkomen. Meng het reactiemengsel en uitbroeden bij 37 ° C gedurende 1 uur. Let op de reactie van grootte kan worden geschaald op basis van de benodigde hoeveelheid toppen van transcript.
- Zuiver het RNA door LiCl neerslag zoals hierboven is uitgelegd (zie punt 1.1.6). Los de pellet in 50-100 ul van RNA-storage oplossing (Ambion) en kwantificeren van de hoeveelheid RNA. Gewoonlijk worden RNA monsters vervolgens genormaliseerd tot 1 pg / pl. Nogmaals, U alle RNA is goed opgelost. Als het niet goed is opgelost, warmte thij monster tot 60 ° C tot de ontbinding mogelijk. Verwijder door middel van centrifugeren enig onoplosbaar materiaal voorafgaand aan de kwantificering RNA.
- Controleer nogmaals de integriteit van RNA alvorens verder te gaan met de transfectie stap. Om dit doel te voeren een hoeveelheid van 100-300 ng van het monster in een 1% agarose gel (figuur 3).
1.2 Herstel van Neon-gemedieerde transfectie van RNA in Raw264.7 cellen:
Voor het herstel van de MNV besmettelijke virusdeeltjes in een tolerante cellijn is het mogelijk om electroporate de afgetopte MNV transcript in Raw264.7 cellen met behulp van Neon transfectie systeem (Invitrogen). Raw264.7 zijn cellen gevoelig zijn voor MNV infectie, het ondersteunen van meerdere rondes van het virus replicatie en latere hernieuwde infectie. Hierdoor zal typische opbrengsten benaderen dan 10 5 infectieuze eenheden per ml 24 uur na transfectie maar piek> 10 7 infectieuze eenheden na 48 uur.
- Een dag voor transfection, zaad Raw264.7 cellen op naar schatting 50% confluentie. Gewoonlijk worden twee T75 flessen van cellen voor 3 transfecties.
- De dag van transfectie schrapen de celmonolagen in Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal kalverserum (FCS), zodat u genereren een enkele celsuspensie door herhaalde pipetteren.
- Bepaal de concentratie van levensvatbare cellen in een hemocytometer met trypan blauw uitsluiting de niet-levensvatbare cellen labelen.
- Pellet de cellen bij 1200 x g gedurende 5 minuten en hersuspenderen ze in DMEM dat 10% FCS bij een uiteindelijke concentratie van 8 x 10 6 cellen / ml.
- Vlak voor transfectie, 1 ml aliquot cellen per transfectie en pellet te 1.200 x g gedurende 2 minuten. Verwijder het medium en wassen van de cellen in 500 ul PBS (zonder Mg2 + / Ca 2 +). Draai de cellen weer op 1.200 xg gedurende 2 minuten. Opmerking het wenselijk is om cellen blijven in DMEM zolang mogelijkzoals opslag in PBS gedurende langere tijd kan brengen van de cel levensvatbaarheid en transfectie snelheid.
- Verwijder PBS uit buizen en voeg 130 pi resuspensie oplossing (Neon transfectiesysteem kit, Invitrogen) tot een finale concentratie van 6 x 10 7 cellen / ml. Er moet worden genomen om de cellen zodat de vorming van bellen die vonken veroorzaakt tijdens transfectie en compromis celoverleving mengen.
- Voeg de juiste hoeveelheid bedekte MNV transcript de cellen (figuur 2) wordt in het algemeen 1,3 ug RNA capped toegevoegd aan 130 pi geresuspendeerde cellen en gemengd zachtjes. Vervolgens verzamel 100 pi van het mengsel in 100 ul Neon transfectie tip. Bijzondere aandacht dient te worden genomen om ervoor te zorgen dat er geen belletjes worden gevormd in de elektroporatie kuvet (Neon transfectie systeem kit 100 ul tip) omdat dit het falen van het experiment kan veroorzaken.
- Electroporate de cellen met behulp van een enkele puls op 1.700 V voor 25 msec, enSuring afwezigheid van vonken in pulserende die de aanwezigheid van luchtbellen in het monster aangegeven. In het geval vonken voordoet, gooi het monster en herhaal de transfectie. Laat de cellen in een eppendorfbuisje 1 ml DMEM antibiotica met 10% FCS. Let op elke tip kan worden hergebruikt tot drie keer met dezelfde RNA monster als er grotere aantallen van getransfecteerde cellen nodig zijn.
- Daarna wordt verdeeld cellen van de buis in onafhankelijke putjes met een geschikte hoeveelheid van voorverwarmde antibiotica DMEM met 10% FCS. Als algemene leidraad, 150 pi van de celsuspensie gegenereerd tijdens stap 1.2.8 voldoende voor een putje van een 24 schotel plaat met 0,5 ml DMEM voorverwarmde, terwijl 300 pi zijn geschikt voor een putje van een 12-schotel plaat 1 ml DMEM voorverwarmde.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 10% CO2 gedurende 24 tot 72 uur. Vervolgens laat infectieuze virions van cellen door een (of meer)vorst en dooi cycli en bepalen virustiter in het monster met behulp van plaque assay of TCID50. Merk op dat lysaten worden door middel van centrifugeren gedurende 1-2 minuten bij maximale snelheid of hun filtreren door een 0,22 pm porie filter voor titratie. Gewoonlijk MNV bereikt titers van ongeveer 1 x 10 6 TCID50/ml 24 uur na transfectie en tot 1 x 10 9 72 uur na transfectie.
- De aanwezigheid en de stabiliteit van mutaties geïntroduceerd in PT7: MNV 3'Rz worden meestal bepaald door de volgorde van de geredde virussen na 2 tot 5 extra passages in Raw264.7 cellen.
1.3 Herstel van lipofectie in BHK-21 cellen:
Een meer directe en vaak meer kosten effectieve methode voor het herstel van besmettelijke MNV van de toppen van transcripties is via lipofectie (Lipofectamine 2000, Invitrogen). Gezien het feit dat Raw264.7 cellen zijn moeilijk te transfecteren gebruik van lipide gebaseerde benaderingen we normaal gesproken gebruik maken van anderenre gemakkelijk cellijnen zoals BHK-21 dat een geïmmortaliseerde lijn uit babyhamster nier fibroblasten transfecteren. Standaard benadering in ons laboratorium gebruikt BSR-T7 cellen, een afgeleide van de BHK-21 cellijn, zoals terwijl deze cellen eenvoudig te transfecteren en ondersteunen MNV replicatie hebben ze geen geschikte receptor zodat meerdere rondes van herinfectie . Hierdoor het virus opbrengst gegenereerd uit dit systeem is een indicatie van een cyclus van virusreplicatie. Deze benadering is van bijzonder bij het onderzoek van het effect van mutatie virus terugwinning het kunnen meerdere transfecties worden uitgevoerd aanzienlijk lagere kosten dan Neon-gemedieerde transfectie en vereist geen speciale apparatuur. Het is vermeldenswaard dat andere gemakkelijk beschikbaar cellijnen zoals humane embryonale nier 293T-cellen ook de efficiënte herstel van de MNV echter transfectie voorwaarden te ondersteunen moet eerst worden geoptimaliseerd om een efficiënte RNA levering te garanderen.
- Trypsineise een monolaag van BHK-21 cellen (of BSR-T7-cellen), zaad 7,5 x 10 5 cellen in een 35 mm diameter schaal in antibiotica vrij groeimedium en de cellen bij 37 ° C geïncubeerd met 10% CO2 gedurende de nacht. Verdubbel de hoeveelheid cellen in elke plaat als de transfecties staan gepland voor de dezelfde dag als de zaaien, en laat cellen op de plaat gedurende 2-3 uur houden bij 37 ° C met 10% CO 2. Merk op dat andere cellen die geschikt zijn voor deze benadering menselijke 293T cellen, humane hepatocellulair carcinoom Huh7 cellen Afrikaanse groene aap COS7 cellen.
- Verwijder de media uit de cellen en te vervangen door 3 ml vers medium zonder antibiotica om de maximale efficiëntie van de transfectie te garanderen.
- Een mengsel van 1-2 pg van capped MNV transcript in 100 ul Opti-MEM (Invitrogen) en mengen met 4 pi van Lipofectamine 2000 eerder gemengd in 100 ul Opti-MEM. Meng het monster door pipetteren op en neer 15 keer. Verlatenhet mengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Voeg de transfectie complexen die toppen van MNV transcripten in een drop-wijze wijze bij tot de cel monolaag en schud de plaat in loodrechte richtingen.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C en 10% CO2 gedurende 24 tot 72 uur. Daarna laat infectieuze virions van cellen door vries ontdooien en bepalen virustiter door plaque assay of TCID50. Typische opbrengst van ongeveer 1 x 10 6 TCID50/ml bereikt.
2. Direct Herstel van infectieuze MNV van cDNA in cellen die T7 RNA-polymerase
Dit protocol is bedoeld om het herstel van MNV in cellen mogelijk door de transcriptie van een infectieus plasmide onderbrengen volledig genoom cDNA reeks door een T7 polymerase uitgedrukt in de cellen. Verschillende cellijnen kunnen worden gebruikt om infectieuze MNV herstellen deze benadering Hoewel we meestal verkregen met de hoogste opbrengst BHK-21 en BSR-T7 ceLLS 15. Wij gebruiken meestal de BSR-T7 cellen omdat ze sneller groeien dan het ouderlijke BHK kloon lijn. Cellen worden geïnfecteerd met kippenpokkenvirus (FPV) codeert voor T7 RNA-polymerase (FPV-T7) 18 die als een helpervirus rijden expressie van de virale RNA en vervolgens herstel van infectieus virus (Figuur 4). Hoewel BSR-T7 cellen constitutief express T7 RNA-polymerase deze uitdrukking is niet voldoende om infectieuze MNV redden na transfectie van PT7: MNV 3'Rz in afwezigheid van helper FPV-T7. Hoewel de typische opbrengsten van dit systeem tenminste 10-maal lager dan de hierboven beschreven Deze benadering heeft een snelle werkwijze voor het screenen mutanten tot de identificatie van verzwakkende mutaties mogelijk. Meestal wordt deze methode voor het eerst gebruikt om de levensvatbaarheid van een cDNA construct te beoordelen. Indien een constructie of niet infectieuze virus te produceren of lijken virus opleveren lager was dan die van het wild type infectieuze kloon, dan RNA gebaseerde approach hierboven beschreven wordt ondernomen.
- Trypsinise een monolaag van BHK-21 cellen (of BSR-T7 cellen) en zaad 7,5 x 10 5 cellen in een 35 mm schotel in antibiotica vrije groeimedia en de cellen bij 37 ° C incuberen en 10% CO2 gedurende de nacht. Voeg dubbele hoeveelheid cellen in elke plaat indien de transfecties zijn voorzien voor dezelfde dag als de zaaien en laat cellen van de plaat hechten gedurende 2-3 uur bij 37 ° C en 10% CO2.
- Verwijder celkweekmedia en voeg 700 ul FPV-T7 aan elk putje (figuur 4). Een veelvoud van infectie (MOI) van ~ 0,5 PFU per cel op titraties van primaire kippenembryo fibroblasten algemeen gebruikt. Het is echter op te merken dat nieuwe preparaten van helper virus gekweekt in primaire fibroblasten functioneel worden getitreerd naar de dosis die nodig is voor een efficiënte virus herstel te bepalen. Protocollen voor de vermeerdering en de titratie van FPV-T7 zijn eerder beschreven 18.
- Incubate bij 37 ° C en 10% CO2 gedurende 1 uur om FPV-T7 de cellen te infecteren. Vervolgens voegt 2 ml DMEM antibiotica met 10% FCS en de cellen een uur bij 37 ° C incuberen en 10% CO2 aan T7 RNA-polymerase expressie mogelijk.
- Om verder te gaan met de transfectie van de besmettelijke plasmide, in de eerste plaats verwijdert u het papier uit de geïnfecteerde cellen, was met 2 ml van de media (10% FCS in antibiotica vrij DMEM), en tenslotte de cel monolaag te bedekken met 3 ml van de media. Antibiotica moeten worden toegevoegd aan het medium, aangezien zij kunnen interfereren met de efficiëntie van Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
- Bereid een mengsel van 1 ug van wildtype MNV cDNA infectieuze plasmide (bijv. PT7: MNV 3'Rz) in 100 pi Opti-MEM (Invitrogen) en meng met 4 pi van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) vooraf gemengd met 100 pi opti-MEM (Invitrogen). Meng de reactie door pipetteren op en neer 15 keer en houd het mengsel bij kamertemperatuur Tempetuur gedurende 20 minuten.
- De resulterende transfectie mix moet dan worden druppelsgewijs toegevoegd aan de cel monolaag en de plaat moet voorzichtig worden geschud in loodrechte richtingen.
- Incubeer de FPV-T7 geïnfecteerde MNV plasmide-getransfecteerde cellen bij 37 ° C en 10% CO2 gedurende 24 tot 72 uur. Cellen getransfecteerd met infectieuze plasmide PT7: MNV 3'Rz normaal maken titers van 1 x 10 4 tot 5 x 10 4 TCID50/ml.
3. Representatieve resultaten
Beide reverse genetics benaderingen zijn zeer effectief voor de terugwinning van infectieuze MNV in celkweek als getoond in figuur 5. Besmettelijke MNV met titers dan 10 5 TCID50/ml teruggewonnen 24 uur na transfectie van capped MNV RNA in Raw264.7 cellen. Ook de transfectie van besmettelijke plasmide PT7: MNV 3'Rz in BSR-T7 cellen die eerder besmet zijn met helper FPV uiten T7 (FPV-T7) leidde tot virale titers grotendeels exceeDing 10 4 TCID50/ml (figuur 5). Deze virale titer waarden verkregen met synthetische RNA en DNA-moleculen zijn vergelijkbaar met die verkregen bij de transfecties met natuurlijke VPG gekoppelde RNA geïsoleerd uit infectieuze virionen in dezelfde cellen (Figuur 5). Deze resultaten wijzen op het hoge rendement van de reverse genetics benaderingen hier beschreven genetisch te herstellen gedefinieerd MNV varianten in celcultuur.
Figuur 1. Illustratie van MNV genoom en plasmide voor het herstel van besmettelijke virus. A, Schematische weergave van de MNV genoom organisatie. Elk eiwit-coderende gebied wordt afgebeeld als een witte doos. ORF1 wordt vertaald in zeven verschillende niet-structurele proteïnen (NS1 / 2 NS7) die uit precursor poly vrijgelaten zichzelf proteolytische verwerking. ORF 2 codeert voor het belangrijkste capside-eiwit VP1, ORF 3 codeert voor de kleine dopsid eiwitten VP2 en ORF4 overlapping met ORF2 coderende gebied codeert voor virulentiefactor VF1. Genomic en subgenome RNA's bevatten een polyA staart aan de uiteinden van hun 3 'van variabele lengte. B, plasmide dat MNV cDNA gebruikt in onze omgekeerde genetische methoden (PT7: MNV 3'Rz). MNV cDNA gefuseerd met een polyA staart 26 residuen zijn 3'-uiteinde. De MNV cDNA sequentie ligt onmiddellijk stroomafwaarts van een ingekorte T7 promoter sequentie aan T7 aangedreven transcriptie kunnen, en stroomopwaarts van een unieke Nhe-plaats en een DNA sequentie die codeert voor een zelf-splitsende ribozyme na. Deze sequenties zijn belangrijk ervoor RNA transcriptieterminatiesignalen direct na de genomische polyA staart aanwezig op het 3 'uiteinde.
Figuur 2. Overzicht van het protocol voor het herstel van besmettelijke MNV van RNA getranscribeerd en afgedekt in vitro Het plasmide PT7:. MNV 3'Rz wordt onmiddellijk stroomafwaarts gelineariseerdde MNV genomische sequentie met Nhe I restrictie-enzym (stap 1). Na DNA zuivering worden MNV RNA-transcripten die in vitro met T7-RNA-polymerase (stap 2). Transcriptie wordt normaliter uitgevoerd met een schijnbare mobiliteit van 2,5 3kb een niet-denaturerende 1% agarose gel (stap 3, figuur 3). De template DNA wordt geëlimineerd door een commerciële RNAse-vrij DNAse. RNA wordt vervolgens gezuiverd vrije nucleotiden van LiCl neerslag (stap 4). Het gezuiverde RNA product kan vervolgens in vitro begrensd na vooraf verwarmd op 65 ° C voortgezet RNA structuren (stappen 5-6) ontvouwen. Na zuivering door LiCl neerslag wordt getransfecteerd in een RNA Raw264.7 cellen (Neon transfectiesysteem, Invitrogen) of BSR-T7 cellen (Lipofectamine 2000, Invitrogen) (stappen 7-8). Eenmaal in de cel, zal bedekte RNA-transcripten wordt vertaald in virale eiwitten die virale replicatie transcripts als katalysator in nieuwe MNV RNA moleculenmet een goede VPG molecuul einde hun 5. Opeenvolgende cycli van replicatie vergezeld van virale vertaling zou genereren van grote aantallen virale genomen zal worden encapsideerd van infectieuze virions genereren. Om het virus te vergemakkelijken van cellen, een of meer cycli van vries dooi uitgevoerd (stap 9). Virale opbrengst kan dan worden bepaald door TCID50 of plaque assay procedures.
Figuur 3. Analyse van de MNV RNA-transcripten integriteit langs het protocol. A, Integriteit van de MNV RNA gesynthetiseerd in vitro. Het plasmide PT7: MNV 3'Rz wordt eerst gelineariseerd met Nhe I restrictie-enzym. Na DNA zuivering worden MNV RNA-transcripten die in vitro met T7-RNA-polymerase (laan 2). RNA is dan zuivering ed van de gratis nucleotiden door LiCl neerslag (laan 3). Transcriptie producten worden uitgevoerd op een niet-denaturerende 1% agarose gel parallel aan 1 kb DNA ladder (New England Biolabs, laan 1). Relatieve mobiliteit van virale transcripten onder niet-denaturerende omstandigheden is vergelijkbaar met een dsDNA product van 2,5-3 Kb. B, Integriteit van de MNV RNA-transcripten na aftopping. MNV transcripten vooraf gezuiverd door precipitatie LiCl (laan 2) worden onderworpen aan enzymatische plafond (baan 3) en zuivering door LiCl neerslag (baan 4). C,, Analyse in een Agilent RNA 6000 Nano-chip van de MNV transcripten (tweede rijstrook) en capped MNV transcripties (derde rijstrook), die eerder zijn neergeslagen in LiCl. Een ssRNA ladder wordt parallel lopen.
= "Pdflinebreak"> 
Figuur 4. Overzicht van het protocol voor het herstel van besmettelijke MNV van cDNA. In eerste instantie BSR-T7 (of BHK) cellen worden geïnfecteerd met een recombinant kippenpokkenvirus virus (FPV) de uiting van de bacteriofaag T7 RNA-polymerase (FPV-T7) (stap 1). De geïnfecteerde cellen gedurende 2 uur voor verdere behandeling van de expressie van FPV eiwitten die het recombinante T7 RNA-polymerase (stap 2) wordt toe. Daarna PT7: is MNV 3'Rz getransfecteerd in cellen met Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (stap 3). Eenmaal in de cel, PT7: MNV 3'Rz wordt herkend door T7-RNA-polymerase die MNV RNA-transcripten (stap 4) synthetiseert. De werking van een splitsende δ-ribozyme sequentie aan het 3'-uiteinde van het genoom garandeert de transcriptie 3 'terminus bevindt zich net na de polyA staart (stap 5). Sommige virale transcripten worden intracellulair afgedekt door een FPV aftopping enzym (stap 6). De resulterende MNV bedekte afschriften zullen vertaald worden naar MNV eiwitten die MNV transcripties replicatie zou katalyseren genereren. Nieuw gesynthetiseerd MNV RNA-moleculen met een goede VPG molecuul einde hun 5 'zal ondergaan opeenvolgende cycli van replicatie vergezeld virale vertaling die tenslotte kan resulteren in de productie van infectieus virus encapsideerd. Om het virus te vergemakkelijken van cellen, een of meer cycli van vries dooi uitgevoerd (stap 7). Virale opbrengst kan dan worden bepaald door TCID50 of plaque assay procedures.
Figuur 5. Representatieve resultaten virus titers verkregen uit verschillende reverse genetics benadert beschreven in de tekst. Grey balken geven de virus titers verkregen 24 uur na NeonTransfectie van 2 x 10 6 Raw264.7 cellen of na lipo-transfectie van 2 x 10 6 BSR-T7 cellen in vitro getranscribeerde RNA en afgedekt MNV. Witte balken geven de virustiter gewoonlijk verkregen na lipofectie van PT7: MNV 3'Rz (MNV cDNA) in 2 x 10 6 BSR-T7 besmette cellen gedurende 2 uur met kippenpokkenvirus virus dat recombinant T7 polymerase (FPV-T7). Als positieve controle voor de transfectie in Raw en BSR-T7cells we meestal gebruik 2 ug RNA, geëxtraheerd uit cellen geïnfecteerd met MNV die een hoog VPG gekoppelde MNV RNA. Negatieve controle werden uitgevoerd met een MNV RNA of PT7: MNV 3'Rz codeert voor een leesraamverschuiving (F / S) die replicatie heft, waardoor er geen detecteerbare virus (gegevens niet getoond).
Discussion
Hier hebben we geïllustreerd twee verschillende omgekeerde genetische benaderingen die het herstel van de besmettelijke MNV in celcultuur mogelijk te maken. Beide benaderingen effectief omzeilen absolute vereiste voor de covalente koppeling van VPG aan het 5'-uiteinde van het virale genoom RNA via de vorming van capped MNV transcripten die vervolgens worden herkend door het cellulaire ribosomen. In vitro transcriptie gevolgd door enzymatisch bovengrens is efficiënter het herstel van infectieuze MNV dan transcriptie van infectieuze plasmiden in cellen die T7 RNA-polymerase, waarbij de transcripten kan worden begrensd door het FPV aftopping enzymen. Virus titers teruggewonnen deze reverse genetics systemen zijn gelijk aan die verkregen door transfectie van virale VPG gekoppelde RNA gezuiverd uit geïnfecteerde celkweken 17 (figuur 5). De transfectie van de afgetopte MNV RNA in permissieve Raw264.7 cellen maakt een virus titer slechts 1-log lager dan experimenten met de transfection van totaal RNA van geïnfecteerde cellen die virale VPG gekoppelde RNA (figuur 5). Dit feit stimuleert verder onderzoek vast te stellen of de toevoeging van een VPG molecule aan het 5 'uiteinde van transcripten die door deze systemen kunnen resulteren in verhoogde virusopbrengst die licht functionele aspecten onderliggende MNV infectiviteit in cellen geassocieerd VPG. Echter we dit reverse genetics systeem een zeer efficiënte een vergelijkbaar met andere RNA virussen reverse genetics die momenteel gebruikt in de in vitro getranscribeerde RNA het herstel van titers maar lager dan 10 tot 100 in reële infecties met virions 19, 20 toelaat.
Over het geheel genomen de huidige methodieken vormen een belangrijke stap voorwaarts op het gebied van norovirus moleculaire biologie en geven ons de tools om de functionele rol van eiwitten en RNA geconserveerde motieven in norovirus genomen te onderzoeken. Deze benaderingen zijn reeds gecombineerd met cUIDIGE muismodel beschikbaar zijn en hebben aangetoond dat MNV hersteld van infectieuze cDNA is in staat om dodelijke infectie van> 80% STAT1-/ veroorzaken - muizen in minder dan 10 dagen 4, 21. Door gebruik van dit systeem wij hersteld levensvatbare muizen norovirus mutanten van de capside eiwitten en een polypyrimidine kanaal bij de binding van verschillende factoren gastheer (PTB en PCBP) een enigszins verzwakt fenotypen weergegeven in vivo 21, 22. Daarnaast hebben wij onlangs aangetoond dat virussen die het vermogen van de proteïne VF1 efficiënt drukken van ORF4 repliceren in celkweek maar ook zijn virulentie in muizen verminderd ten opzichte van WT MNV 8. Deze studies moedigen ons aan om verzwakte versies van humane norovirussen op basis van MNV studies die kunnen worden onderzocht als potentiële kandidaat-vaccins te ontwerpen.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door een Wellcome Trust Senior Fellowship toegekend aan Ian Goodfellow, en een Marie Curie Intra European Fellowship (KP7 European Research Council) uitgereikt aan Armando Arias. We willen graag Io Hong Cheong, dr. Rebecca Robey en Dr Mike Skinner bedanken voor het geven van ons toestemming om hun Agilent bioanalyser te gebruiken en te helpen met het runnen van RNA-monsters.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lithium chloride precipitation solution | Ambion | AM9480 | |
| RNA storage solution | Ambion | AM7000 | |
| ScriptCap m7G Capping System | Epicentre Biotechnologies | SCCE0610 | |
| Neon transfection system | Invitrogen | MPK5000 | |
| Neon transfection system kit | Invitrogen | MPK1025 | |
| Opti-MEM I | Invitrogen | 31985070 | |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
| Agilent RNA 600 Nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent 2100 bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA |
References
- Outbreaks of gastroenteritis associated with noroviruses on cruise ships--United States. MMWR Morb. Mortal. Wkly. Rep. 51, 1112-1115 (2002).
- Lopman, B. A. Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis, Avon, England, 2002-2003. Emerg. Infect. Dis. 10, 2002-2003 (2004).
- Duizer, E. Laboratory efforts to cultivate noroviruses. J. Gen. Virol. 85, 79-87 (2004).
- Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. T. STAT1-dependent innate immunity to a Norwalk-like virus. Science. 299, 1575-1575 (2003).
- Wobus, C. E. Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol. 2, e432 (2004).
- Bok, K. Inhibition of norovirus replication by morpholino oligomers targeting the 5'-end of the genome. Virology. 380, 328-337 (2008).
- Kim, Y., Thapa, M., Hua, D. H., Chang, K. O. Biodegradable nanogels for oral delivery of interferon for norovirus infection. Antiviral Res. 89, 165-173 (2011).
- McFadden, N. Norovirus Regulation of the Innate Immune Response and Apoptosis Occurs via the Product of the Alternative Open Reading Frame 4. PLoS Pathog. 7, e1002413 (2011).
- Kormelink, R., van Poelwijk, F., Peters, D., Goldbach, R. Non-viral heterogeneous sequences at the 5' ends of tomato spotted wilt virus mRNAs. J. Gen. Virol. 73, 2125-2128 (1992).
- Shuman, S., Hurwitz, J. Mechanism of mRNA capping by vaccinia virus guanylyltransferase: characterization of an enzyme--guanylate intermediate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 187-191 (1981).
- Jang, S. K., Pestova, T. V., Hellen, C. U., Witherell, G. W., Wimmer, E. Cap-independent translation of picornavirus RNAs: structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme. 44, 292-309 (1990).
- Chaudhry, Y. Caliciviruses differ in their functional requirements for eIF4F components. J. Biol. Chem. 281, 25315-25325 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4. E. EMBO Rep. 6, 968-972 (2005).
- Herbert, T. P., Brierley, I., Brown, T. D. Identification of a protein linked to the genomic and subgenomic mRNAs of feline calicivirus and its role in translation. J. Gen. Virol. 78 ( Pt5 ), 1033-1040 (1997).
- Chaudhry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. Recovery of genetically defined murine norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J. Gen. Virol. 88, 2091-20100 (2007).
- Ward, V. K. Recovery of infectious murine norovirus using pol II-driven expression of full-length cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 11050-11055 (2007).
- Yunus, M. A., Chung, L. M., Chaudhry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. Development of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J. Virol. Methods. 169, 112-118 (2010).
- Arias, A., Perales, C., Escarmis, C., Domingo, E. Deletion mutants of VPg reveal new cytopathology determinants in a picornavirus. PLoS One. 5, e10735 (2010).
- Werf, S. vander, Bradley, J., Wimmer, E., Studier, F. W., Dunn, J. J. Synthesis of infectious poliovirus RNA by purified T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 2330-2334 (1986).
- Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. A single amino acid substitution in the murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo. J. Virol. 82, 7725-7728 (2008).
- Bailey, D. Functional analysis of RNA structures present at the 3' extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract plays a role in viral virulence. J. Virol. 84, 2859-2870 (2010).
