Summary
本协议描述了一个准备一个高度同质化的亚微米大小的脂质体的挤压方法。此方法使用脂质体的制备与控制氮流量压力控制系统。脂质准备
Abstract
脂质体是人为编制的模拟平台，研究蛋白质和脂质蛋白相互作用3，监测给药4,5，和4封装膜作为细胞被广泛使用的天然和合成磷脂组成的囊泡。磷脂自然弯曲的脂质双层，本身区别于胶束。6脂质体是双层，即大（LUVs）的单层囊泡，小囊泡（越野车）单层和多室囊泡（MLV更具）的大小和数量由传统分类。特别是，编制各种大小均匀脂质体是重要的研究膜的曲率，在细胞信号传递中扮演了至关重要的作用，内和胞吐作用，膜融合，蛋白质贩运8。几组分析蛋白质如何被用来调节过程，涉及膜的曲率，从而准备脂质体直径<100 - 400纳米研究其对细胞功能的行为3。其他专注于脂质体药物包封，学习车辆进行并交付利息9药物的脂质体。可以实现药物包封在脂质体形成9报告。我们的挤压步骤应该没有影响，原因有两个封装的药物，即（1）药物包封应事先取得到了这一步，（2）脂质体应保留其天然生物物理稳定性，安全携带药物在水溶液中的核心。这些研究的目标，进一步表明需要优化的方法来设计稳定的亚微米级的脂质囊泡。
尽管如此，目前的脂质体的制备技术（10超声，冷冻和解冻10，沉淀）不容许高度的一致性和高效率10,5，这限制了生物物理曲面（即直径小于100纳米）的脂质体的制备研究1 emergi会吴膜曲率传感领域。在此，我们提出了各种生物相关的脂质体健壮的制备方法。
使用气密注射器和聚碳酸酯薄膜10,5手动挤压是一种常见的做法，但经常被观察到的异质性时，使用孔径小于100纳米，由于由于手动施加压力的变异。我们采用恒压控制挤出设备，准备合成脂质体，其直径范围在30和400 nm之间。被用来量化脂质体的大小，在我们的协议与商业聚苯乙烯（PS）作为校准标准用于珠，动态光散射（DLS）10 11，电子显微镜和纳米粒子跟踪分析（NTA）的12。一个附近的线性相关就业孔径和实验测定脂质体之间，说明我们的压力控制脂质体的制备高保真会见HOD。此外，我们已经表明，这种脂质囊泡的制备方法是普遍适用的，独立于各种脂质体的大小。最后，我们在一个时间过程的研究还表明，这些准备脂质体是稳定的，长达16小时。下面演示了一个有代表性的纳米脂质体的制备协议。
Protocol
1。脂质体的制备
- 检索与聚四氟乙烯内衬盖20 mL的玻璃小瓶。
- 清理所有与氯仿的玻璃器皿和注射器使用前，以防止污染。
- 转移100μL试剂级氯仿的玻璃小瓶，用250μL气密玻璃注射器。
- 加入30μL试剂级甲醇相同的玻璃小瓶，用100μL气密玻璃注射器。
- 准备一个2毫米7:1.5:1.5卵磷脂（POPC）：磷脂（教皇）：胆固醇脂解，转移216μL10毫克/ 10毫克/毫升教皇和20μL11毫克/毫升，42毫升POPC微升在氯仿的胆固醇解决方案，以20 mL的玻璃小瓶。
- 蒸发缓慢流动的脂质薄膜，直到被观察瓶底部氩气或氮气使用的有机溶剂。
- 在真空干燥器不封顶的玻璃小瓶放置至少30分钟，以除去残留的溶剂。
- 风帆ansfer 2缓冲液，通过0.2微米的过滤器，玻璃小瓶水合物血脂。
- 孵育的混合物在4°C过夜，并在48小时内使用。
2。仅冻结和解冻：脂质体大小为30 - 100纳米
- 冻结15秒的脂质体悬浮在液氮。
- 解冻加热块的脂质体悬浮液在42°C的温度〜3分钟。
- 重复步骤2.1和2.2共5个周期。
3。挤压
按照Avestin说明正确组装的Liposofast的LF-50挤出机，使用仪器纲要“在他们的指导书。
- 将大洞，支持屏幕支持过滤基地（圆孔），其次是循环烧结盘（无孔），一个排水盘（直径25毫米），和一个聚碳酸酯膜（直径25毫米）。
- 将黑色小膜顶部的O型圈，以确保它的支持过滤基地。
- 附加4中的4个对应的孔的螺丝拧紧顶端的过滤挤出机。
- 组装过滤器下方的大型挤出机机筒挤出机组。添加到缸筒的脂质体的解决方案。为了挤压筒的顶部放置以下内容：大型的圆形O型圈，窄帽，大型的圆形O型圈，圆帽。
- 将气体调节挤出机机筒顶部，并关闭所有阀门，以防止空气泄漏，包括泄压阀。将玻璃小瓶20毫升或50 mL锥形瓶中挤出过滤装置下。安全阀连接到稳压器，并会释放，如果压力超过600磅。打开氮气，并打开煤气阀连接到挤出机。
- 增加氮气压力为400纳米脂质体为100纳米脂质体，125磅，30纳米脂质体的400-500磅到25磅。
- 观看脂质体悬液ension弹出，而氮的容器推入。保持氮的流动，直到你不再遵守任何通过挤出过滤器的玻璃小瓶中的液体通过。
4。动态光散射（DLS）分析
- 准备50μL20μM脂质体解决方案。
- 打开电源和灯源。
- 打开DynaPro软件。
- 设置软件的MS / X算法模型检测30纳米和100纳米和MS800算法模型检测> 100纳米脂质体的脂质体。
- 连接硬件。
- 吸取14μL脂质体样品的石英比色皿，并插入到细胞支架。
- 按下启动。
- 按停止后约20 - 30收购。
- 分析直方图记录峰脂质体的平均直径。
5。纳米粒子跟踪分析（NTA）的
- 准备了500微升，0.1微米的脂质体解决方案。
- 冲洗水和乙醇的样品室。
- 与无棉绒纸巾擦干样品室。
- 打开激光电源和电脑。
- 提供300μL0.1微米脂质体解决方案的样品室。
- 打开温度控制和纳米粒子跟踪分析软件。
- 按捕捉按钮，打开激光。
- 使用水平和垂直调整动议阶段，调整显微镜的焦点。
- 设置所需的温度（20℃）和录音时间（至少30秒）。
- 按下“录制”按钮，采取多种相框指定的时间量的脂质体颗粒。分析相应的直方图，它跟踪每个粒子的运动脂质体直径大小山峰。
6。代表结果
计划概述了挤压方法是p在图1愤慨。为了获得最佳的结果，直径为30纳米脂质体的制备要求的高压〜500 psi和100纳米的直径，需要一个125磅的压力，实现了快速的过滤率。对于直径为400纳米，低了25磅压力的建议，以达到过滤速率较慢，这使得囊泡拉长，形成较大的，均匀的脂质体。我们进行了一系列实验，以确定最佳生产一致的亚微米级囊泡大小压力。我们不同的压力，以及挤压通过孔径30，100和400 nm的聚碳酸酯过滤器传递的数量，为每个所需的大小，并发现了适当的压力。为30纳米的孔隙，低于500 psi的压力将降低流速，引起伸长，从而较大的囊泡大小。一个稳定的流量为100纳米的孔隙，达到125磅。低压（25 psi）的为400纳米的毛孔，使囊泡拉长成较大的囊泡小号izes。一个缓慢下降明智的过滤流量是最佳，以创造更大的亚微米泡13。
我们完成了当值律师服务，以确定通过三个不同直径的大小，即30，100和400 nm的挤压脂质体大小。 DLS是一个既定的方法，收集散射光，以确定粒子的直径。 2毫米，通过在500 psi的聚碳酸酯30纳米膜5张通行证通过过滤孔; 100 nm的聚碳酸酯薄膜在125磅与5科及格通过过滤孔和400 nm的聚碳酸酯在25 psi的膜2我们挤压水合脂质体通过过滤器的孔隙。脂质体和用DLS测量为30，100和400 nm孔径的直径分别为66±28，138±18和360±25纳米（ 图2）。暂停50纳米聚苯乙烯珠被用来作为校准标准，在图2所示，它的直径为47±16纳米。 ％polydispersity显示，脂质体的尺寸范围内有没有重叠。这是典型的观察直径小于30纳米时，使用动态光散射分析，由于已知的偏见，该仪器对有较大的颗粒12。同时从一个检测方法收集从大，小颗粒的散射光强度，从而更难解决脂质体在暂停12。尽管这种仪器的限制，校准曲线的描述附近的线性关系。
NTA是一种新技术，测量每个粒子在液体介质中，独立粒子的折射率和密度扩散的直接观测的大小。这种高分辨率的技术可以用来补充脂质体与DLS测量。国家旅游局记录了直径为95±48和356±51纳米，两个100纳米和400纳米聚苯乙烯解决方案被用于校准。观察到的30纳米和100纳米的脂质解决方案有更多的排版耕地直径相对如图3所示，生产平均粒径为29±14 95±17和359±73纳米的DLS。国家旅游局，可能是一个更一般的表征技术来量化，因为它的灵敏度允许它来衡量50 - 1000 nm的粒子微观粒子。校准曲线显示了一个与记录国税局直径的聚碳酸酯膜孔之间的线性相关。
| 脂质体大小 | 检测阈值 | 预计最小颗粒尺寸（nm） |
| 30纳米 | 11 | 30 |
| 100纳米 | 11 | 100 |
| 400毫微米 | 21 | 400 |
表1。Nanosight参数。
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图1。挤压法，流程图描述如何的压力和氮气流量控制不同的脂质体直径的均匀性。脂质体水化后，不同尺寸的单层囊泡是通过不同的聚碳酸酯膜过滤器在不同压力下毛孔挤压。
图2。动态光散射（DLS）数据描述挤压后定量脂质体的大小。 （一）棒图显示，描述三种脂质体样品的直径。校准标准的50纳米聚苯乙烯（PS）珠被用来作为参考。脂质体的平均直径是上述每个样品的酒吧。 x轴描述的解决方案，其中挤压通过孔径。介绍用DLS记录y轴的直径。虽然30纳米和100纳米大小的记录编辑值高于其孔径较大的400纳米大小录得略低的大小，校准曲线（b）显示附近的线性关系，其中x轴表示聚碳酸酯膜孔大小，y轴的描述用DLS录得的脂质体直径。
图3纳米粒子跟踪分析（NTA）的数据描述挤压脂质体大小。 （一）条形图代表各脂质体样品的直径。 x轴描述的解决方案，其中挤压通过孔径。 y轴描述了由国家旅游局录得的直径大小。脂质体的平均直径是上述每个样品的标记。 （二）NTA校准曲线显示比之间的记录的直径与孔径的过滤膜的动态光散射校正曲线的线性相关。 x轴描述聚碳酸酯膜孔大小。 y轴的描述由国家旅游局的记录脂质体直径。
图4。负染色透射电子显微镜（TEM）图像显示每个脂质体的大小（500微米），其次受到挤压。呈负出院前碳福尔瓦网格来样染色，其中1％醋酸铀水用于染色的样品前干燥和34000×放大倍率成像。大小30，100和400 nm明显有别于对方。放大倍率为25,000×。比例尺表示0.5微米。
图5。一个时间课程实验进行了三种脂质体的尺寸。动态光散射（DLS）测量每个脂质体的解决方案后立即挤压。脂质体解决方案储存在4℃C过夜。 DLS的过夜培养后，其直径均录得。几乎没有变化，观察后16小时的潜伏期。
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Discussion
我们使用的Avestin Liposofast LF-50挤出机，并演示了如何小型，合成脂质体通过压力控制系统的准备。重要的是要注意多室囊泡自发形成脂质体水化后，这可能会导致更小的纳米粒子的生产。这些小的多室囊泡，将不可避免地流过较大的聚碳酸酯膜孔径，导致异质性的解决方案由一个大型的过滤孔的单层囊泡。因此，建议，以减少氮流量压力，当使用大孔径直径为400纳米以上所述毛孔（即25磅）为了使血脂有足够的时间来融合成较大的水疱拉长，增加同质化解决方案。对于直径小于100纳米，高压（即400-500如上所述为30和100 nm PSI）的脂质体应用于快速挤压，以增加脂质捕集效率和大小的均匀性。
一些值得注意的步骤是建议，以确保准确，重现性脂质体的准备。这是最好的准备与使用描述的方法挤出3.0毫升样本的体积最小的囊泡。血脂浓度样品2毫米以上，将需要为直径> 500磅高氮气压力小于100纳米，应进行慎重考虑，这种压力是超出了仪器的上限。通过挤出过滤器（5〜7叠）的重复通行证的建议，将改善囊泡溶液的均匀性。样品制备中使用的玻璃小瓶和注射器，将防止任何可能污染脂质体样品的聚丙烯管浸出。过滤结果脂质体，以消除任何可能的残留尘粒也很重要。
在上面描述的方法，我们采用两种方法来表征脂质体的大小，南伊利DLS和NTA。这两种技术都表现出与实际观测到的脂质体直径与孔径附近的线性相关性。尽管如此，人们应该牢记的脂质囊泡的统计学意义，但无形的异质性，使用这两种表征方法观察。总之，我们已经介绍了纳米合成脂质体的一致性和高效率的生产控制方法。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了霍华德·休斯医学研究所（HHMI）协同创新奖。林支持信令和细胞调节研究所的T32 GM008759卫生培训资助和NIH的露丝L. Kirschstein前博士后研究员（CA165349-01）。我们要感谢他们的宝贵意见教授迈克尔·斯托厄尔（铜博尔德），教授道格拉斯里斯和罗布·菲利普斯教授（加州理工学院）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 02432-25ML | 95% stabilizers |
| High Grade Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-4L | |
| Liposofast LF-50 Extruder | Avestin, Inc. | ||
| Phospholipids | Avanti Polar Lipids | ||
| Polycarbonate Pores | Avestin, Inc. | 25 mm diameter | |
| Drain discs PE | Avestin, Inc. | 230600 | 25 mm diameter |
References
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