Costante pressione controllata metodo di estrusione per la preparazione del Nano di dimensioni vescicole lipidiche

Summary

Questo protocollo descrive un metodo di estrusione per la preparazione di vescicole lipidiche di sub-micron dimensioni con un alto grado di omogeneità. Questo metodo utilizza un sistema a pressione controllata con velocità controllate flusso di azoto per la preparazione di liposomi. La preparazione lipidica

Abstract

I liposomi sono vescicole preparati artificialmente costituiti da fosfolipidi naturali e sintetici che sono ampiamente utilizzati come una membrana cellulare che imita piattaforma per studiare proteina-proteina e proteina-lipide interazioni ^3, drug delivery monitoraggio ^4,5, e ⁴ incapsulamento. I fosfolipidi creano naturalmente doppi strati lipidici curvi, distinguendosi da una micella. ⁶ I liposomi sono tradizionalmente classificate per dimensione e numero di bistrati, cioè vescicole grandi unilamellari (Luvs), piccole vescicole unilamellari (SUV) e vescicole multilamellari (MLV) ^7. In particolare, la preparazione di liposomi omogenee di varie dimensioni è importante per lo studio curvatura membrana che svolge un ruolo essenziale nella segnalazione cellulare, endo-e esocitosi, fusione della membrana, e il traffico proteina ^8. Diversi gruppi analizzare come le proteine ​​vengono utilizzati per modulare i processi che coinvolgono curvatura della membrana e quindi preparare liposomi di diametro <100 - 400nm a studiare il loro comportamento su funzioni cellulari ^3. Altri si concentrano sulla liposomi-incapsulamento della droga, studiando liposomi come veicoli per trasporto e la distribuzione di un farmaco di interesse ^9. Incapsulamento farmaco può essere ottenuto come riportato durante la formazione dei liposomi ^9. Il nostro passo di estrusione non dovrebbe pregiudicare il farmaco incapsulato per due motivi, vale a dire (1) incapsulamento farmaco deve essere raggiunto prima di questo passo e (2) liposomi dovrebbero conservare la loro stabilità naturale biofisico, reggere saldamente il farmaco nel nucleo acquoso. Questi obiettivi ulteriori ricerche indicano la necessità di un metodo ottimizzato per progettare stabili sub-micron vescicole lipidiche.

Tuttavia, le attuali tecnologie preparazione liposomica sonicazione ^(10, congelamento-scongelamento ^e-10, sedimentazione) non consentono la preparazione di liposomi con superficie altamente curva (ossia diametro <100 nm) con efficienza elevata consistenza e ^10,5, che limita la biofisico studi di un emergicampo di rilevamento ng curvatura membrana. Qui, presentiamo un metodo efficace per una varietà di preparazione di liposomi biologicamente rilevanti.

Estrusione manuale con siringhe a tenuta di gas e membrane in policarbonato ^10,5 è una pratica comune, ma l'eterogeneità si osserva spesso quando si usa dimensioni dei pori <100 nm a causa a causa della variabilità della pressione manuale applicata. Abbiamo impiegato una pressione costante controllata apparato di estrusione per preparare liposomi sintetici cui diametri compresi tra 30 e 400 nm. Light scattering dinamico (DLS) ^10, microscopia elettronica ¹¹ e tracciamento analisi delle nanoparticelle (NTA) ¹² sono stati usati per quantificare le dimensioni del liposoma come descritto nel nostro protocollo, con polistirene commerciale (PS) perle utilizzate come standard di calibrazione. Una correlazione quasi lineare è stata osservata tra le dimensioni dei pori e dei lavoratori liposomi determinati sperimentalmente, che indica l'alta fedeltà della nostra pressione controllata preparazione liposomiale incontratoHod. Inoltre, abbiamo dimostrato che questo vescicola metodo di preparazione lipidica è generalmente applicabile, indipendente di varie dimensioni liposomi. Infine, abbiamo anche dimostrato in uno studio corso di tempo che questi liposomi preparati sono rimasti stabili per un massimo di 16 ore. Un rappresentante di dimensioni nano protocollo di preparazione liposomiale è illustrato di seguito.

Protocol

1. Preparazione liposomica

1. Recuperare un flaconcino da 20 ml in vetro con una rivestita di teflon cap.
2. Pulire la vetreria e le siringhe con cloroformio prima dell'uso per evitare contaminazioni.
3. Trasferire 100 ul di cloroformio distillata al flacone di vetro con un 250 microlitri a tenuta d'aria siringa di vetro.
4. Aggiungere 30 microlitri di metanolo distillata al flacone stesso bicchiere con un 100 pl a tenuta d'aria siringa di vetro.
5. Per preparare un mM 2 7:1.5:1.5 fosfatidilcolina (POPC): fosfatidiletanolammina (PAPA): soluzione di lipide colesterolo, trasferire 216 microlitri di 10 mg / mL POPC, 42 pl di 10 L mg / mL PAPA e 20 di 11 mg / mL Le soluzioni di colesterolo nel CHCl ₃ al flaconcino 20 ml di vetro.
6. Evaporare i solventi organici utilizzando lento flusso di argon o azoto gassoso fino ad una pellicola sottile di lipidi si osserva sul fondo della fiala.
7. Porre la fiala di vetro non livellata in un essiccatore sotto vuoto per almeno 30 minuti per rimuovere il solvente residuo.
8. Transfer 2 mL di tampone, precedentemente passati attraverso un filtro da 0,2 micron, per la fiala di vetro per idratare i lipidi.
9. Incubare la miscela a 4 ° C per una notte e utilizzare entro 48 ore.

2. Freeze-and-disgelo: Per i formati liposomi di 30 - 100 nm solo

1. Congelare sospensione liposomica in azoto liquido per 15 secondi.
2. Scongelare sospensione liposomica utilizzando un blocco di riscaldamento a 42 ° C di temperatura per ~ 3 minuti.
3. Ripetere le fasi 2.1 e 2,2 per un totale di 5 cicli.

3. Estrusione

Seguire le istruzioni Avestin per assemblare correttamente il Liposofast LF-50 estrusore, utilizzando lo schema dello strumento nel loro libro guida.

1. Posizionare il grande schermo di supporto foro (con fori circolari) nella base di supporto del filtro, seguita dal piatto circolare sinterizzato (senza fori), un disco di scarico (25 mm di diametro), e una membrana di policarbonato (25 mm di diametro).
2. Posizionare il piccolo, neroO-ring sulla parte superiore della membrana per fissarlo alla base di supporto del filtro.
3. Fissare l'estrusore top filtro serrando 4 viti nei 4 fori corrispondenti.
4. Montare l'unità di filtro estrusore a sotto la canna dell'estrusore grande. Aggiungere la soluzione liposoma alla canna del cilindro. Posizionare il seguente superiore del cilindro di estrusione per: grande circolare O-ring, cap stretto, circolare grande O-ring, cap circolare.
5. Collegare il regolatore del gas verso l'alto cilindro estrusore e chiudere tutte le valvole per evitare perdite d'aria, compresa la valvola limitatrice della pressione. Posizionare un flacone di vetro da 20 ml o 50 ml beuta sotto il gruppo estrusore filtro. Una valvola di sicurezza è collegato al regolatore e rilascerà se la pressione supera 600 psi. Accendere il gas azoto e aprire la valvola di gas collegata al estrusore.
6. Aumentare la pressione di azoto a 25 psi per liposomi 400 nm, 125 psi per liposomi 100 nm e 400-500 psi per 30 nm liposomi.
7. Guarda il susp liposomaensione come viene espulso nel contenitore durante essendo spinto da azoto. Tenere sotto corrente d'azoto fino a quando non osservanza di una qualsiasi liquido che passa attraverso il filtro estrusore nel flaconcino di vetro.

4. Dynamic Light Scattering (DLS) Analisi

1. Preparare 50 pl di una soluzione di 20 pM liposomi.
2. Accendere la sorgente di alimentazione e la fonte della lampada.
3. Aprire il software DYNAPRO.
4. Impostare il software per MS / X modello di algoritmo per individuare liposomi di 30 nm e 100 nm e MS800 modello di algoritmo per rilevare> 100 nm liposomi.
5. Collegare l'hardware.
6. Dispensare 14 l di campione liposoma in cuvetta di quarzo e inserto nel supporto cella.
7. Premere start.
8. Premere stop dopo ~ 20 - 30 acquisizioni.
9. Analizzare i picchi di diametro medio liposomi registrati sul istogramma.

5. Nanoparticelle Analisi Tracking (NTA)

1. Preparare una 500 uL, 0,1 pM liposomasoluzione.
2. Sciacquare il vano campione con acqua ed etanolo.
3. Asciugare il vano campione con un panno privo di tovagliolo di carta.
4. Accendere la sorgente di potenza del laser e il computer.
5. Fornire 300 pl di soluzione 0,1 pM liposoma di compartimento campione.
6. Aprire il controllo della temperatura e del software di monitoraggio delle nanoparticelle Analysis.
7. Cattura Premere tasto per accendere il laser.
8. Utilizzare le regolazioni orizzontali e verticali per spostare il palco e regolare la messa a fuoco microscopio.
9. Impostare la temperatura desiderata (20 ° C) e tempo di registrazione (almeno 30 secondi).
10. Premere il pulsante Record per prendere cornici multiple delle particelle liposomi per un periodo di tempo specificato. Analizzare i picchi corrispondenti alle dimensioni del diametro liposomi sull'istogramma in quanto segue il movimento di ogni particella.

6. Risultati rappresentativi

Uno schema che illustra il metodo di estrusione è prisentiva in Figura 1. Per ottenere risultati ottimali, preparazione di liposomi con diametro di 30 nm richiede una pressione elevata di circa 500 psi e diametri di 100 nm richiede una pressione di 125 psi per ottenere un tasso rapido filtro. Per diametri di 400 nm, una bassa pressione di circa 25 psi viene raccomandato per ottenere un tasso più lento filtro, che permette di allungare le vescicole grandi, e formare liposomi omogenee. Abbiamo condotto una serie di esperimenti per determinare la pressione ottimale per la produzione di consistenti dimensioni sub-micron vescicole. Abbiamo variato la pressione così come il numero di estrusione passa attraverso filtri di policarbonato con dimensioni dei pori di 30, 100 e 400 nm e scoperto pressione appropriata per ciascuna dimensione desiderata. Per pori 30 nm, pressione inferiore a 500 psi ridurrà la portata, causando allungamento e quindi le dimensioni delle vescicole grandi. Per i pori 100 nm, un flusso costante è stato raggiunto a 125 psi. Per pori 400 nm, a bassa pressione (25 psi) permette di allungare le vescicole in s vescicola maggioreizes. A goccia a goccia lenta filtraggio del flusso è ottimale per creare più sub-micron vescicole ^13.

Abbiamo eseguito DLS per determinare le dimensioni del liposoma estrusi attraverso tre diametri differenti, cioè 30, 100 e 400 nm. DLS è un metodo consolidato che raccoglie la luce diffusa per determinare il diametro particellare. Noi liposomi estrusi idrati di 2 mM attraverso una membrana di policarbonato 30 nm a 500 psi con 5 passa attraverso i pori del filtro, una membrana di 100 nm a 125 psi policarbonato con 5 passa attraverso il poro filtro 400 nm e una membrana di policarbonato a 25 psi con 2 passa attraverso il poro filtro. I diametri dei liposomi e misurato da DLS per 30, 100 e 400 nm pori erano 66 ± 28, 138 ± 18 e 360 ± 25 nm (Figura 2). Una sospensione di perline di polistirene da 50 nm è stato usato come standard di calibrazione, come illustrato nella figura 2, dove è registrato un diametro di 47 ± 16 nm. La percentuale polydispersity dimostra che non vi sia sovrapposizione all'interno dimensioni liposomi. È tipico osservare diametri superiori a 30 nm usando analisi DLS a causa della distorsione noto questo strumento ha verso particelle più grandi ^12. Intensità di dispersione della luce da particelle grandi e piccole sono raccolti contemporaneamente da un metodo di rilevazione e quindi più difficili da risolvere i liposomi in sospensione ^12. Nonostante questa limitazione strumentale, la curva di calibrazione descrive una correlazione lineare vicino.

NTA è una nuova tecnologia che misura la dimensione di ogni particella da osservazioni dirette di diffusione in un mezzo liquido, indipendentemente indice di rifrazione o la densità delle particelle. Questa tecnica ad alta risoluzione può essere utilizzato per integrare la misurazione di liposomi con DLS. La NTA ha registrato diametro di 95 ± 48 e 356 ± 51 nm, due 100 nm e 400 nm soluzioni di polistirene sono stati utilizzati per la calibrazione. Soluzioni lipidiche di 30 nm e 100 nm sono state osservate avere un comp più diametro coltivabile rispetto alle DLS come illustrato nella figura 3, producendo dimensioni medie di 29 ± 14, 95 ± 17 e 359 ± 73 nm. Il NTA può essere una tecnica di caratterizzazione più generale di quantificare particelle microscopiche dalla sua sensibilità permette di misurare particelle di 50 a 1000 nm. La curva di calibrazione mostra una correlazione lineare tra i pori della membrana di policarbonato rispetto al diametro registrata NTA.

Misure liposomi	Soglia di rilevamento	Prevista particelle dimensione minima (nm)
30 nm	11	30
100 nm	11	100
400 nm	21	400

Tabella 1. Parametri NanoSight.

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Figura 1. Diagramma di flusso del metodo di estrusione, che descrive come la pressione e flusso di azoto controlla l'omogeneità di differenti diametri liposomi. A seguito di idratazione liposomi, vescicole unilamellari di diverse dimensioni vengono estrusi attraverso i pori della membrana diverse filtro in policarbonato a pressioni diverse.

Figura 2. Dinamici Light Scattering (DLS) dati che descrivono le dimensioni seguenti quantitativi di liposoma estrusione. (A) grafici a barre sono mostrati per descrivere i diametri dei tre campioni liposomi. Uno standard di calibrazione 50 nm polistirene (PS) perline è stato usato come riferimento. I diametri medi liposomi sono indicate sopra la barra per ciascun campione. L'asse x descrive le dimensioni dei pori che le soluzioni sono state estruse attraverso. L'asse y indica lo spessore registrato da DLS. Sebbene i 30 nm e 100 nm registrare formatied valori superiori a loro dimensioni dei pori, mentre maggiore è la dimensione 400 nm registrata una dimensione leggermente inferiore, la curva di taratura (b) mostra una correlazione quasi lineare, dove l'asse x esprime le dimensioni dei pori della membrana di policarbonato, e l'asse y descrive registrata diametro liposoma da DLS.

Figura 3. Nanoparticelle tracciamento Analysis (NTA), dati che descrivono le dimensioni dei liposomi seguenti estrusione. (A) I grafici a barre rappresentano il diametro di ciascun campione liposoma. L'asse x descrive le dimensioni dei pori che le soluzioni sono state estruse attraverso. L'asse y indica lo spessore dimensione registrato dal NTA. I diametri medi liposomi sono classificati come sopra ogni campione. (B) La curva di taratura NTA mostra una correlazione più lineare rispetto alla curva di taratura DLS tra i filtri di dimensioni dei pori della membrana rispetto al diametro registrato. L'asse x descrive le dimensioni dei pori della membrana di policarbonato. L'asse y indica lo spessore registrato liposoma da NTA.

Figura 4. Negativi macchia microscopia elettronica di trasmissione (TEM) risultati immagini ogni dimensione liposoma (500 pM) seguita da estrusione. Carbonio Formvar griglie maglia sono stati scaricati negativamente prima della colorazione del campione, dove acetato di uranile 1% in acqua è stato utilizzato per colorare i campioni prima dell'essiccazione e immagini a 34.000 ingrandimento ×. Formati 30, 100 e 400 nm sono chiaramente distinti l'uno dall'altro. L'ingrandimento è stato fissato a 25.000 ×. La barra della scala rappresenta il 0,5 micron.

Figura 5. Una volta portate esperimento è stato condotto con tre dimensioni liposomi. Dynamic Light Scattering (DLS) è stata misurata per ogni soluzione di liposomi di estrusione immediatamente successivo. Tutte le soluzioni di liposomi sono stati conservati a 4 °C per una notte. I loro diametri sono state registrate dai DLS dopo una notte di incubazione. Poca o nessuna modifica è stata osservata dopo 16 ore di incubazione.

Discussion

Utilizzando il Avestin Liposofast LF-50 Estrusore, abbiamo dimostrato come piccole dimensioni, liposomi sintetici vengono preparati attraverso una pressione sistema controllato. È importante notare che formano vescicole multilamellari spontaneamente dopo idratazione liposoma, che può portare alla produzione di nanoparticelle più piccole. Queste piccole vescicole multilamellari inevitabilmente fluire attraverso maggiore è la dimensione dei pori di membrana di policarbonato, causando eterogeneità in soluzioni di vescicole unilamellari prodotti da una grande poro filtro. Pertanto, si consiglia di ridurre la pressione di flusso di azoto quando grandi dimensioni dei pori sono utilizzati (cioè 25 psi per diametro di 400 nm pori come descritto sopra) per dare i lipidi tempo sufficiente a fondere ed allungato in grandi vescicole, aumentando l'omogeneità dei la soluzione. Per i liposomi con diametro <100 nm, alta pressione (cioè 400-500 psi per 30 e 100 nm come descritto sopra) viene applicato per un rapido estrusione per aumentare l'efficienza di cattura lipidie dimensioni omogeneità.

A pochi passi notevoli sono consigliate per garantire accurate, preparazione riproducibile liposomi. È preferibile preparare vescicole con il volume minimo di 3,0 mL di campione per estrusione con il metodo descritto. I campioni con concentrazioni di lipidi superiore a 2 mM richiederà la pressione di azoto superiore di> 500 psi per diametri <100 nm, che dovrebbe essere realizzato con cautela considerando che tale pressione è al di là del limite strumentale superiore. Una raccomandazione di passaggi ripetitive (5 ~ 7 reiterazioni) attraverso il filtro estrusore migliorerà l'omogeneità soluzione vescicola. Utilizzo di fiale e siringhe in vetro per la preparazione del campione eviterà il rilascio da tubi di polipropilene in grado di contaminare il campione liposomi. E 'anche fondamentale per filtrare i liposomi che ne derivano per rimuovere eventuali particelle di polvere possibili residue.

Nel metodo sopra descritto, abbiamo impiegato due metodi per caratterizzare le dimensioni liposoma, namely DLS e NTA. Entrambe le tecniche hanno mostrato una correlazione quasi lineare tra le dimensioni dei pori rispetto al reale diametro osservato liposomi. Tuttavia, si dovrebbe tenere a mente che una eterogeneità statisticamente significativa, ma inconsistente di vescicole lipidiche è stata osservata utilizzando entrambi i metodi di caratterizzazione. In sintesi, abbiamo descritto una ben controllata metodo per la produzione di liposomi sintetici nano-dimensioni, con coerenza ed efficacia.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Sigma-Aldrich	02432-25ML	95% stabilizers
High Grade Methanol	Sigma-Aldrich	179337-4L
Liposofast LF-50 Extruder	Avestin, Inc.
Phospholipids	Avanti Polar Lipids
Polycarbonate Pores	Avestin, Inc.		25 mm diameter
Drain discs PE	Avestin, Inc.	230600	25 mm diameter