Summary
세포 기능에 microenvironments의 분자 구성의 영향에 통찰력을 얻기위한 조합 기능 검사 방법을 설명합니다. 방법은 세포 접착 및 기능 분석을 지원하는 정의 조합 microenvironments의 배열을 생성하기 위해 기존의 microarray 기반 기술을 활용합니다.
Abstract
세포와 주변 microenvironment 사이의 상호 작용은 세포의 행동에 기능 결과가 있습니다. 단일 세포 수준에서 독특한 microenvironments는 차별화, 마이그레이션 및 확산 phenotypes을 부과 할 수 있으며, 조직 수준에서 microenvironment는 morphogenesis와 tumorigenesis 일처럼 복잡한 처리합니다. 만 내 microenvironments 영향 세포의 세포와 분자 내용을했지만 때문에 탄성 2, 조직의 구조 3 할 수 없습니다. 셀 - 셀, - ECM, 및 가용성 요소 상호 작용의 합으로 정의, 물리적 특성뿐 아니라, microenvironment가 복잡합니다. 조직 내에서 세포의 phenotypes는 게놈 콘텐츠 및 microenviroment과 조합 상호 작용에 부분적으로 인해 부분적으로 인해 수 있습니다. 주요 과제는 독특한 행동과 microenvironmental 구성 요소의 특정 조합을 연결하는 것입니다.
다닐 "> 여기에서, 우리는 조합 microenvironments 4 상호 작용의 셀 기반의 기능 검사에 대한 microenvironment microarray (MEArray) 플랫폼을 제시한다. 방법은 분자의 조성과 탄성 계수의 동시 제어 할 수 있으며, 널리 사용 가능한 microarray의 사용을 결합 그리고 micropatterning 기술. MEArray 화면 그러한 성인 전구 세포와 같은 희귀 한 세포 유형의 기능 연구를 용이하게 배열 10,000 세포처럼 몇이 필요합니다. 기술의 한계는 전체 조직 microenvironments이 완전히 MEArrays에 recapitulated 할 수 있습니다.의 그러나, 비교 수많은 관련 microenvironments에 동일한 셀 유형의 응답 예를 들어 특정 조직을 특징 ECM 단백질의 pairwise 조합, microenvironmental 구성 요소가 조직 별 기능 phenotypes을 이끌어내는 방법에 통찰력을 제공 할 것입니다.MEArrays는 재조합 촉진제 다양한을 사용하여 인쇄 할 수 있습니다wth 요인 크린 시토 킨 및 정화 ECM 단백질, 그리고 그 조합. 플랫폼은 특정 시약의 가용성에 의해 제한됩니다. MEArrays 시간은 실효 분석 의무가 있지만, 대부분 형광 프로브와 measureable 아르 세포 기능의 엔드 포인트 분석에 사용됩니다. 예를 들어, DNA 합성, apoptosis, 차별화 된 국가의 수집, 또는 특정 유전자 제품의 생산은 일반적으로 측정합니다. 간단히, MEArray 실험의 기본 흐름이 인쇄 substrata으로 코팅 슬라이드를 준비하고 인쇄 할 아르 단백질의 마스터 판을 준비하는 것입니다. 그런 다음 배열은 microarray 로봇과 함께 인쇄되어, 세포는 첨부 문화에 성장하고 화학적 실험 엔드 포인트에 도달시 고정 할 수 있습니다. 기존의 현미경이나 microarray 스캐너와 이미징 형광 또는 colorimetric assays은, 관련 분자 및 세포 phenotypes (그림 1)을 공개하는 데 사용됩니다.
Protocol
1. 인쇄 Substrata 준비
(PA) polydimethylsiloxane (PDMS) - 코팅 또는 polyacrylamide - 코팅 슬라이드를 사용하는 결정은 실험 설계의 중요한 매개 변수에 따라 달라집니다. 두 고분자의 탄성 계수는 PDMS의 기본 / 치료 비율 및 PA의 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 비율을 변경하여 다른 조직의 강성을 모방하도록 설계 할 수 있습니다. PDMS은 1 10MPa (예 연골, 각막, 그리고 동맥 벽)의 범위에서 엄격한 조직을 모방 할 수 있으며, PA는 100Pa-100kPa (예 : 유방암, 뇌, 간, 전립선) 5의 범위에서 부드럽고 조직을 모방 할 수 있습니다. PDMS는 준비, 저렴한 간단하고, 인쇄 기능의 형상은 인쇄 핀의 머리에 동일해야합니다. 따라서 기능의 크기와 모양은 정확하게 다른 팁 구조와 핀을 사용하여 제어 할 수 있습니다. PDMS는 세포 처리 및 immunos 동안 몇 가지 문제의 원인이되는, PA보다 더 소수성입니다단계를 taining, 그리고 일부 세포 라인과 호환 될 수 있습니다. PA는 히드로 겔과 기본 비 오염 표면이기 때문에, 세포는 지원하는 세포 접착 단백질이 있습니다 명소에 연결합니다. PA의 젤에 인쇄 된 기능의 구조가 정확히 바보의 형상을 따라하지 않는, 보통 사람들 확산으로 인해 원,에 관계없이 사용되는 핀의 대가리 형상의이됩니다. 인쇄 접촉 시간과 핀 직경 매개 변수는 경험적으로 PA의 젤에 최적의 기능 크기를 결정 할 수 있습니다.
Polydimethylsiloxane (PDMS)
- 일회용 플라스틱 컵에 10시 1분 비율 경화 요원과 함께 Sylgard 184 실리콘 탄성 중합체 기반을 결합, 30 분의 상온 진공 종의 가스를 제거하다 그리고 억압자 나무 또는 플라스틱 혀 힘차게 섞는다.
- 센터 다음 스핀 coater의 진공 작동 척에 대한 표준 현미경 슬라이드, 시럽 슬라이드 표면의 중심 위에 혼합 탄성 중합체의 0.5 ML. 에 스핀60 초에 6,000 RPM.
- 70 ° C의 오븐에 또는 밤에 4 시간의 디지털 핫 플레이트 (먼지로부터 보호)에있는 PDMS 코팅 슬라이드를 치료.
- 치료 슬라이드는 즉시 사용하거나, 플라스틱 Ziploc 가방 안에 봉인하고 서랍에 보관되어있는 슬라이드 상자에 몇 달 동안 저장할 수 있습니다. 이 잘 실내 공기 순환으로부터 보호되어야합니다 있도록 PDMS는 먼지를 끌고 있습니다.
- 참고 : PDMS 엘라스토머 키트와 함께 작업 할 때 니트릴 또는 기타 비 라텍스 장갑을 착용해야합니다. 라텍스 장갑과 부대 연락처 PDMS 중합을 억제합니다.
Polyacrylamide (PA)
- NaOH 에칭 : 80에서 열 블록에 삽입 슬라이드 ° C. 전체 슬라이드 표면을 커버하여 각 슬라이드에 한 ML 0.1N NaOH를 추가합니다. NaOH합니다 (흰색 필름 슬라이드 표면에 형성한다) 증발 보자. PA 젤은 NaOH 에칭 표면에 단단히 부착 할 수 있기 때문에, PA 젤은 전체 슬라이드 서핑하는 경우 단계를 건조하는 동안 분리합니다에이스는 NaOH에 포함되지 않습니다. 슬라이드 표면이 완전히 커버되지 않은 경우, 1 ML 0.1N NaOH를 추가하여 반복합니다. 슬라이드 그 다음 몇 일 동안 실온 (RT)에 저장할 수 있습니다. 참고 : NaOH 에칭에 대한 대안은 오존 또는 슬라이드를 플라즈마 청소하는 것입니다.
- 3 Aminopropyltriethoxysilane (원숭이) 코팅 : 연기 후드에서 15 ML 요리의 장소 슬라이드, 각 NaOH 에칭 슬라이드에는 300 μl 원숭이를 추가합니다. NaOH 5 분 동안 슬라이드로 원숭이가 반응 봅시다. 이 시간을 초과하면 unreacted 원숭이 시약을 세탁기에 어려움을 초래하게됩니다. 슬라이드의 양쪽에 탈 이온수로 철저하게 2 ~ 3 배를 유인원을 씻으십시오. 세탁이 완료되지 않은 경우, 원숭이는 단계 1.8에서 슬라이드에 갈색 보증금을 형성하기 위해 글 루타 알데히드에 의해 산화 될 것입니다.
- 글 루타 알데히드 산화 : 슬라이드 표면의 모든 솔루션을 기음. 각 15cm 요리에 PBS 25 ML 0.5 % 글 루타 알데히드를 추가합니다. 어두운 지역에서 30 분에 반응한다. 30 분 후, 모든 글 루타 알데히드를 기음과 비 보푸라기가 노동을 사용하여atory 와이프 (예 : Kimwipes)주의 깊게 슬라이드를 건조합니다. 슬라이드 그런 다음 포기 하루에 RT에 저장할 수 있습니다.
- 젤 준비 : 30 분 동안 가스를 제거하다, 아래 표와 따라에 아크릴 아미드, 비스 - 아크릴 아미드와 ddH 2 O를 포함 PA 혼합물을 준비하고 중합을 억제하기 위해 얼음에 PA 혼합물을 배치 한 후. APS를 추가하고 TEMED 오른쪽 젤을하기 전에 잘 섞는다. 슬라이드 표면과 장소 24mm로 Pipet PA 혼합물 X 50mm, 번호 PA의 상단에 1 coverslips. 함께 coverslip과 유리 슬라이드를 눌러 방지하고 거품 형성을 피할 수 있습니다. 다른 젤은 350 μl를 사용을위한 젤의 경우> 40,000 아빠는 100 μl를 사용합니다.
| 원하는 계수 (PA) | 아크릴 아미드의 % | 비스 - 아크릴 아미드의 % | 40 % 주식의 아크릴 아미드 (ML) | 2 %의 주식에서 비스 - 아크릴 아미드 (ML) | 탈 이온수 (ML) | APS (μl) | TEMED (μl) |
| 480 ± 160 3 | 0.06 | 0.75 | 0.3 | 8.95 | 100 | 10 | |
| 4470 ± 1190 | 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 100 | 10 |
| 40,400 ± 2,390 | 8 | 0.48 | 이 | 2.4 | 5.6 | 100 | 10 |
6,7에서 적응.
- PA 젤은 2 시간에 중합하자하고 탈 이온수에서 coverslips를 제거합니다.
- unreacted acrylamides을 제거 할 (~ 8 시간) 밤 물에 큰 Coplan 병에 PA 젤 슬라이드를 씻으십시오.
- 2-4 시간 또는 PA 젤까지 37 ° C의 오븐에 드라이 슬라이드가 완전히 경화.
- PA 젤 - 슬라이드는 슬라이드 밀봉 상자에 한 달 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
2. 단백질 마스터 플레이트 준비
- 모든 단백질 shoulD 업체에서 권장하는 버퍼에 10X 솔루션의 주식 aliquoted 및 -80 ° C.에 저장 대부분의 ECM 단백질은 탈 이온수에 용해하지만, pH는 아세트산의 물방울을 조정해야 할 수 있습니다. 대부분의 성장 요인 크린 시토 킨, 그리고 재조합 수용체 세포 도메인은 BSA와 PBS에 준비가되어 있지만, 제조업체 조건 달라집니다. 0.45 μm 저장하기 전에 4 mm 나일론 주사기 필터 (Nalgene)를 통해 단백질 aliquots을 필터링 할 수 있습니다.
- 원하는 단백질의 조합과 dilutions에 따라 마스터 판을 디자인합니다. 자기편 세포는 보통 세포 부착을 중재 할 하나 이상의 호환 ECM의 존재에 의존하지만, 세포 표면 epitopes에 대한 항체는 또한 때때로 첨부 파일을 중재 할 수 있습니다. 이 배열 나중에 쉽게 중심이 될 수 있도록, 적어도 하나에 무료로 FITC의 염료 또는 fluorphore - 복합 단백질을 추가하는 것이 좋습니다.
- 100 mm의 구성 인쇄 버퍼로 단백질 조합을 diluting하여 마스터 판을 준비Tris-acetate/20 % glycerol/0.05 % 트리톤 - 100X 산도 5.2. 일반적으로 384도 판의 각도 더 이상 10 μl가 포함되어 있지 않습니다.
- 탭으로 구분 된 데이터베이스 파일의 각 마스터 플레이트에 각도의 내용을 기록하고 고유 한 식별 번호로 각각의 마스터 플레이트를 제공합니다. 디자이너의 이니셜 뒤에 6 자리 날짜가 종종 목적을 (MMDDYYinitial) 제공합니다. 잘 볼륨이 작기 때문, 단백질 aliquots는 복제 접시의 큰 숫자를 생성하는 효율적으로 사용할 수 있습니다. 그것은 마스터 플레이트는 -80 ° C에서 각 마스터 플레이트는 더 이상 두 개보다 냉동 해동 사이클을 받아야합니다 저장하는 것이 좋습니다.
3. MEArray 인쇄
- MEArrays는 대부분의 기존 microarray 인쇄 로봇과 인쇄 할 수 있습니다. 실리콘이나 스테인레스 스틸 핀 중 하나를 사용 퀼의 핀 프린터는 잘 작동하지만, 단백질의 점도가 문제가 될 수 있습니다. 사람들이 작업 모세관 프린터는이 응용 프로그램에 이상적 microarray 인쇄 로봇 아르점성 단백질 솔루션과 잘.
- 배열 내에서 좋은 통계 전력을 달성하려면 각 microenvironment의 10-12 복제 명소 권장합니다. 이러한 디자인은 단순 T-테스트 통계를 사용하여 동일한 배열에서 다른 상대 한 microenvironment에 활동의 비교를 할 수 있습니다. Dunnette의 테스트는 다른 microenvironments과 제어 환경에서 활동을 비교하는 데 사용할 수 있습니다. 기능 표현형이 MEArray 실험을 수행하기 전에 제어 microenvironment과 관련이 때 디자인은 최상의 상태로 작동합니다.
- 습도 50 % 주변에 유지해야합니다. 낮은 습도 핀 내부 또는 인쇄 substrata에 비효율적 인 증착을 일으키는 마스터 플레이트의 우물에서 솔루션을 건조 할 수 있기 때문에 습도 조절이 중요합니다. 습도는 비 다공성 플라스틱 시트로 로봇을 draping와 50 %의 습도를 유지하도록 설정 가습기와 드 - 가습기를 모두 사용하여 효과적으로 제어 할 수 있습니다. 냉각 인쇄 plattens는 usef 할 수 있습니다일부 단백질을 보존을위한 UL,하지만주의가 슬라이드에 형성에서 응축을 피하기 위해 이동해야합니다.
- 각각의 인쇄 배열은 세 자리 숫자 (MMDDYYinitial-NNN) 다음 마스터 판의 식별자로 구성되어 일련 번호와 인코딩 냉동고 방지 슬라이드 레이블로 표시해야합니다. 모든 배열을 사용 또는 배포로 자신의 실험 치료에 대한 자세한 내용은 데이터베이스에 유지해야합니다. 인쇄 날짜와 마스터 플레이트의 동결 - 해동 사이클의 수를 추적하는 것은 재현성을 유지하기위한 최적의 조건을 식별하는 데 도움이 될 것입니다.
- 인쇄 MEArrays는 더 이상보다 달 -20 ° C에서 밀봉 된 슬라이드 상자에 보관해야합니다. 재현성이 현저 이후 거부합니다.
4. 기능 분석을위한 MEArrays에서 배양 포유류의 세포
- 문화 챔버 첨부 : 미디어 MEArrays에 세포 필요한 문화의 숫자의 볼륨을 제한하려면 플라스틱 챔버는 F입니다itted 인쇄 배열을 둘러싸고 있습니다. 많은 배열의 경우 4.2 cm 2의 면적을 포함하는 2 챔버 슬라이드 (Nunc)에서 단일 챔버 사용할 수 있습니다. 제조 챔버 슬라이드에서 챔버를 제거하고 면도날로 반으로 방을 잘라. MEArray의 표면에 챔버 및 보도의 가장자리에 수족관 실리콘의 얇은 구슬 (DAP)를 적용 할 3 ML의 주사기를 사용합니다. 배열 기능에 적용 수족관 실리콘 챔버를 삽입하지 마십시오.
- 차단 및 린스 : MEArrays는 셀에 독성이 될 수 unreacted 단량체를 제거하기 위해 잘 헹구어 있어야합니다. PDMS-코팅 슬라이드가 사용 된 경우에는 인쇄 기능 사이의 영역은 먼저 세포 부착을 방지하기 위해 비 오염 코팅 차단해야합니다, 물에 1 % Pluronic F108 (BASF) 또는 2 %의 BSA의 배열을 품다 진공 하에서 15 분 물. PA 겔 슬라이드 차단 단계를 필요하지 않습니다. 모든 경우에, (미디어 선택에 따라 다릅니다 5 분 동안 세포 배양 매체와 배열을 세 번 헹굼사용 된 셀에 있지만, 항생제의 사용)는 관계없이 미디어 또는 셀의 권장합니다. PA의 젤은 젤을 rehydrate하는 미디어 추가 30 분 부화가 필요합니다.
- 셀 첨부 파일 : 4 ~ 5 배열 멸균 페트리 접시 하나 15cm의 내부에 맞게 할 수 있습니다. 배열은 무균 유지하기 위해 뚜껑으로 페트리 접시를 커버. 10,000 백만 셀 / ML의 최종 농도에 미디어에서 셀을 추가하여 MEArray에 최종 미디어 볼륨의 절반을 추가합니다. 셀은 인쇄 microenvironment의 구성에 따라 다른 속도로 인쇄 된 기능에 연결됩니다. 15-20 분 간격의 역 무대 현미경을 통해 배열을 확인하여 균일 한 첨부 파일을 확인합니다. 부드럽게 앞뒤로 MEArrays을 흔들어함으로써, 패턴 방식으로 연결 셀은 플로팅, 무소속의 세포로부터 구별 할 수 있습니다.
- 언 바운드 세포의 제거 : PA-코팅 MEArrays에서 언 바운드 세포 흡입 할 수 있으며, 미디어가 적절한 볼륨으로 대체 할 수 있습니다. P에세포 밖으로 건조하고 거의 즉사하기 때문에 DMS-코팅 MEArrays은 미디어 완전히 잘 제거되지 않을 수 있습니다. 모든 언 바운드 세포와 같은 미세 검사에 의해 결정, 제거 될 때까지 따라서 PDMS 코팅 MEArrays에, 언 바운드 셀은 미디어의 볼륨의 절반의 연속 교류의 과정에서 제거해야합니다. PDMS의 해제 으러 효과는 혈청 함유 미디어가 정의 미디어에 비해 사용하면 덜 유명한이며, 경우 BSA는 Pluronics F108에 비해 unprinted 영역을 차단하는 데 사용됩니다.
- 전지는 일반 미디어 변화 많은 일이 15cm의 배양 접시 내부에 위치 MEArrays에서 배양 할 수 있습니다. PDMS 슬라이드에 미디어 변경 사항은 미디어 볼륨의 절반의 연속 변화를 수행해야합니다.
- 이러한 paraformaldehyde과 메탄올 / 아세톤 등의 일반적인 fixatives는 MEArray 시스템과 호환됩니다. PA-코팅 MEArrays에 세포를 얼룩 경우, fixatives을 추가 할 수 있으며, 그들은 종래의 착색 절차에 마찬가지로 씻어.그러나 PDMS 코팅 MEArrays에 세포를 얼룩 때, 표면은도 고정 기간 동안 서부 유럽 표준시 있어야합니다. 미디어의 절반을 기음과 정착액을 교체하십시오. 잘은 정착액의 과반수로 가득 몇 번까지 과정을 반복합니다. 고정 후, 정착액은 점차 분석의 다음 단계에 적합한 차단 버퍼와 같은 방식으로 대체됩니다.
- Immunostaining는 일반적으로 세포의 기능을 분석하는 데 사용됩니다. 착색 루틴은 다양 할 수 있지만, PDMS의 MEArrays에 작업 할 때, 하나의 요구는 모든 세척 이상으로 흡인 단계를 수행하기 위해 점차적으로 솔루션을 변경하고 드 젖은로 표면을 허용하지 않습니다. 드 - 으러는 착색의 유물을 초래하게됩니다.
- 방은 면도날의 도움으로 제거 할 수 있습니다. Coverslips는 Fluoromount-G (남부 생명 공학)를 사용하여 스테인드 MEArrays의 상단에 장착 할 수 있습니다. 감지는 대부분의 다색 형광 microarray 스캐너이나 방문객과 공 촛점 현미경에서 수행 할 수 있습니다타일 이미지 수집 모드.
5. 대표 결과
의 패턴 단백질 증착의 예 인쇄 된 PDMS-coasted 그림 2에 표시됩니다 퀼 핀 microarray - 인쇄 로봇에 평방 스쳐 실리콘 핀을 사용하여 MEArray. 인쇄 여러 단백질의 증착은 immunofluorescence 사용하는 항체 (그림 2A)에서 확인할 수 있습니다. 마스터 플레이트에있는 단백질 솔루션 Dilutions는 인쇄 substrata 표면 (그림 2B)에 입금되어있는 금액 (형광 강도)의 반영입니다. 셀 명백한 패턴 방식 (그림 2C)의 인쇄 기능에 연결해야합니다.
이 microenvironment 단백질의 역 dilutions는 인간의 multipotent 유방 상피 P의 단백질 농도에 의존 방식으로 특정 각질 표현 프로필을 elicited을 보여 MEArray 실험의 예rogenitor 셀 라인 (D920 전지)는 그림 3에 표시됩니다. 버블 플롯은 특정 phenotypes가 희석 시리즈의 복제 기능에 대한 세포에 부과하는 여부를 결정하는 데 유용합니다. microenvironment에서 특정 분자가 뚜렷한 표현형의 원인이있는 경우 예를 들어, 한 번 될지는 구성 요소는 표현형 변경하거나 사라지게해야 중립적 인 ECM의 배경에 충분히 희석되었습니다. 각질 8 각질 14 중간 필라멘트 단백질의 Immunofluorescence 감지 축삭 4200a (분자 장치) microarray 스캐너를 통해 수행되었다. 열두 복제 희석 시리즈는 각 MEArray에 인쇄하고, 각질 14 각질 8 로그이 비율은 형광 강도는 신호의 변화와 재현성의 현실적인 아이디어를 제공하는 거품 플롯으로 그래프이라는 것을 의미했다. 표시는 세포 부착 한 및 언 바운드 세포 (그림 3A) 씻어 된 후 해결되었습니다 MEArray에서 데이터이며, cultu 24 시간 후재 (그림 3B). 이 상대적으로 작은 분석을 들어, 편도 ANOVA는 두 꼬리 T-테스트를 결정하는 데 사용 된 각 시점에서의 평균 신호의 변화를 결정하는 데 사용하고, 그룹화되었는지 여부를 유형의 서로 다른 dilutions I가 콜라겐과 재조합 인간 P- cadherin은 각질 표현의 변화를 일으켰습니다. 단지 첨부 파일 후 기능에 대한 세포 사이의 평균로부터 변화가 없었하지만, 세포 사이에 각질 표현에 큰 차이는 다른 microenvironments에 노출 24 시간 후가있었습니다. T-테스트는 검증이 높은 유형 I 고 P-cadherin의 농도는 24 시간 후 강한 각질 14 신호를 elicited 반면 콜라겐 농도가 높은 각질 8 식을 elicited. 이 결과는 P-cadherin 함유 microenvironments는 이중 강력한 유방 전구 세포 4 K14 - 표현 myoepithelial 표현형의 부과됩니다 이전 보고서와 일치했다.
전체 scanne의 예40,000 아빠 PA 젤에 인쇄 D MEArray은 그림 4에 표시됩니다.
그림 1. MEArray 절차의 흐름 차트입니다. 첫째, 인쇄 substrata는 PDMS 또는 PA로 하나 준비가되어 있습니다. 둘째, 마스터 플레이트가 데이터베이스에 준비하고 주석이 있습니다. 셋째, MEArrays는 인쇄 일련 번호로 인코딩됩니다. 넷째, 문화 챔버가 부착되어 표면 블록 및 / 또는 헹구어 다음 셀이 부착 할 수 있으며, 언 바운드 세포 씻어 아르 수 있습니다. 다섯째, 세포는 실험 설계에 따라 부화 기간 후 얼룩이나 바이오 검정으로 처리 할 수 있습니다. 마지막으로, MEArray의 이미지를 획득하고 적절한 스캐너와 소프트웨어로 분석 할 수 있습니다.
그림 2. Depos인쇄 단백질의 ition와 상대 풍부한이 세포 부착하기 전에 immunostaining을 확인할 수 있습니다. A) 유형 IV 콜라겐을 인식하고 laminin은-111은 MEArray의 인쇄 기능에서의 존재를 확인하는 데 사용 된 항체. B) NIH ImageJ 소프트웨어, 200 μg / ML 단백질 솔루션부터 dilutions 일련의,에서 두 단백질의 상대적 풍부한의 평균 픽셀 강도 분석 기능을 사용하여 질적 평가 할 수 있습니다. 인쇄 PDMS 코팅 MEArray의 사각형 기능에 첨부 된 D920 전지의 C) 위상 현미경.
그림 3. 시간과 microenvironment의 기능으로 multipotent 전구 세포 라인에 각질 표현의 변화를 사용하여 MEArray 분석의 예라고 할 수 있습니다. 각 거품이 각질 8 각질의 비율 유한 요소 분석법에 부착 10-15 셀로부터 14 단백질 수준을 나타냅니다MEArray에 진짜야. 표현식은 immunofluorescent 프로브로 결정했습니다. A) 만 첨부 한 후 세포의 각질 비율을 표시하고, B) 병렬로 도금 된 배열에서 24 시간 후 각질 비율을 보여줍니다. 두 단백질의 최대 농도는 200 μg / ML 및 희석 2 배이었다. 거품의 직경은 각질 8 각질 14 평균 강도의 로그 2 비율의 크기를 나타내고, 주황색과 흰색 색상 코딩은 각각, 가치> 0 <0을 나타냅니다. 편도 ANOVA와 T-테스트와 비교하여 인구를 식별하는 화살표가있는 괄호에서 P-값에 대한 F-값은 표시됩니다.
그림 4. MEArray 스캔의 예는 공 촛점 현미경 레이저에 타일 수집 모드를 사용 받았습니다. 우리가 고정하기 전에 4 시간의 DNA 아날로그 에듀을 통합 할 수 HCC1569 세포.DAPI (파란색)와 에듀는 (빨간색) 표시됩니다.
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Discussion
여기에 제시된 MEArray 방법은 셀 및 조합 microenvironment의 상호 작용 4 기능 분석을 할 수 있습니다. MEArray 분석은 기본 micropatterning 기술, 세포 생물학, 및 microarray 인쇄 로봇과 많은 다중 시설에서 사용할 수있는 분석 기기의 사용이 조화를 이루고 있습니다. 혈청이없는 미디어 공법은 첨부 파일을 향상시킬 수 BSA 또는 <1 %의 혈청을 포함하는 경우에 조정해야 할 수도 있지만 MEArray 화면은 가장 자기편 세포 유형과 호환됩니다. 이 방법은 특정 세포의 기능을 분석 시약의 가용성에 의해 제한됩니다, 형광 기반 assays는 배열 기반의 대부분의 이미징 시스템과 호환됩니다하지만, colorimetric의 assays는 잘 작동 할 수 있습니다. 이 방법의 다른 변형은 복잡한 microenvironments이 기능 개인 microenvironment 분자와 조합 그 세포 func의 다양한에서 재생 어떤 역할을 나타 내기 위해 해부 할 수있는 일반적인 아이디어를 존재 및 지원tions 8,9.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
ML은 NIA (R00AG033176 및 R01AG040081)와 실험실 감독 연구 및 개발, # DE-AC02-05CH11231 에너지 계약의 미국과로 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
