Summary
Et kombinatorisk funktionel screeningsmetode til at få indsigt i konsekvenserne af den molekylære sammensætning af mikromiljøer på cellulære funktioner er beskrevet. Fremgangsmåden drager fordel af eksisterende mikroarray-baserede teknologier til at generere arrays af definerede kombinatoriske mikromiljøer, som understøtter celleadhæsion og funktionel analyse.
Abstract
Samspillet mellem celler og deres omgivende mikromiljø har funktionelle konsekvenser for cellulær adfærd. På enkelt celle niveau, kan forskellige mikromiljøer pålægge differentiering, migration og spredning fænotyper, og på vævsniveau mikromiljøet processer så kompleks som morfogenese og tumorigenese 1. Ikke alene cellulære og molekylære indhold af mikromiljøer virkninger cellerne inden, men det gør elasticiteten 2 og geometri 3 i vævet. Defineres som summen af celle-celle-,-ECM og-opløselige faktor interaktioner, ud over de fysiske egenskaber, er mikromiljøet kompleks. Fænotyperne af celler inden for et væv er delvis på grund af deres genomiske indhold og delvist på grund af de kombinatoriske interaktioner med microenviroment. En stor udfordring er at forbinde specifikke kombinationer af microenvironmental komponenter med karakteristiske adfærd.
ent "> Her præsenteres mikromiljøet microarray (MEArray) platform for cellebaseret funktionel screening af interaktioner med kombinatoriske mikromiljøer 4. Metoden giver mulighed for samtidig kontrol af den molekylære sammensætning og elasticitetsmodulet, og kombinerer brugen af almindeligt tilgængelig microarray og micropatterning teknologier. MEArray skærme kræver så få som 10.000 celler pr matrix, hvilket letter funktionelle studier af sjældne celletyper, såsom voksne stamceller. En begrænsning af teknologi er, at hele væv mikromiljøer kan ikke helt gentaget på MEArrays. En sammenligning af reaktioner i samme celletype til mange relaterede mikromiljøer, f.eks parvise kombinationer af ECM-proteiner, der karakteriserer et givet væv, vil tilvejebringe indsigt i, hvordan microenvironmental komponenter fremkalder vævsspecifikke funktionelle fænotyper.MEArrays kan udskrives ved hjælp af en lang række rekombinant GroGJ faktorer, cytokiner og oprenset ECM proteiner og kombinationer deraf. Platformen er kun begrænset af tilgængeligheden af specifikke reagenser. MEArrays er modtagelige for tidsforkortet analyse, men oftest anvendes til slutpunkt analyser af cellulære funktioner, der er målbare med fluorescerende prober. For eksempel er DNA-syntese, apoptose, erhvervelse af differentierede stater, eller produktion af specifikke genprodukter almindeligvis måles. Kort beskrevet er den grundlæggende strøm af en MEArray eksperiment er at fremstille objektglas overtrukket med trykning substrater og forberede masterplade af proteiner, der skal udskrives. Derefter arrays er trykt med en microarray robot, er cellerne lov til at fæstne, vokse i kultur, og derefter er kemisk fikseret efter at have nået den eksperimentelle endpoint. Fluorescerende eller kolorimetriske assays, afbildet med traditionelle mikroskoper eller microarray scannere, der anvendes til at afsløre de relevante molekylære og cellulære fænotyper (figur 1).
Protocol
1. Udskrivning substrater Forberedelse
Beslutningen om at bruge polydimethylsiloxan (PDMS)-coatede eller polyacrylamid (PA)-coatede objektglas afhænger af de vigtige parametre for det eksperimentelle design. Elasticitetsmodulet af begge polymerer kan indstilles til at efterligne de stivheder i forskellige væv ved at ændre basen / hærdningsforhold af PDMS, og acrylamid / bis-acrylamid forhold på PA. PDMS kan efterligne stivere væv i området fra 1-10 MPa (fx brusk, hornhinden, og arterievægge), og PA kan efterligne blødere væv i området fra 100Pa-100kPa (fx bryst, hjerne, lever, og prostata) 5. PDMS er billigt, let at tilberede, og geometrien af de trykte funktioner vil være identisk med lederen af de trykkerier ben. Således størrelsen og formen af de funktioner kan styres præcist ved hjælp af nåle med forskellige tip geometrier. PDMS er mere hydrofob end PA, som forårsager nogle problemer under håndtering af celler og immunosopretholdelse trin, og kan være uforenelige med nogle cellelinjer. Fordi PA er en hydrogel og en indfødt ikke-fouling overflade, vil cellerne kun vedhæfte til pletter, hvor der er proteiner, der understøtter celleadhæsion. Geometrien af de trykte funktioner på PA geler ikke præcist at følge geometrien af knappenålshoved, normalt bliver de kredse på grund af diffusion, uanset knappenålshoved geometri, der bruges. Udskrivning kontakttid og pin diameter parametre kan bestemmes empirisk for at opnå optimal funktion størrelse på PA-geler.
Polydimethylsiloxan (PDMS)
- I en plastikflaske cup kombinere Sylgard 184 silikoneelastomer base med hærdemidlet i et forhold på 10:1, blandes kraftigt med en af træ eller plastic tungen depressor derefter afgasses i en stuetemperaturvakuumovn vakuum bell i 30 minutter.
- Midten en standard mikroskopobjektglas på vakuumpumpe aktiverede aksel med en spin coater, så støvregn 0,5 ml af den blandede elastomer polymer på midten af præparatglassets overflade. Spin på6000 rpm i 60 sekunder.
- Hærde PDMS-overtrukne objektglas i en 70 ° C ovn eller på en digital varmeplade (beskyttet mod støv) i 4 timer til natten over.
- Hærdede slides kan anvendes straks, eller opbevares i flere måneder i et dias boks, der er forseglet i en plastik Ziploc pose og opbevares i en skuffe. Den PDMS tiltrækker støv, så det skal være godt beskyttet mod rum luftcirkulation.
- Bemærk: Nitril eller andre ikke-latex-handsker skal bæres, når man arbejder med PDMS elastomer kit. Tilfældig kontakt med latex-handsker vil hæmme PDMS polymerisation.
Polyacrylamid (PA)
- NaOH ætsning: Anbring objektglassene på varmeblok ved 80 ° C. Tilsæt 1 ml 0,1 N NaOH på de enkelte dias, og sørg for at dække hele slide overfladen. Lad NaOH fordampe (en hvid film bør være på diasset overflade). Da PA gel kun kan vedhæfte fast på NaOH ætsede overflade, vil PA gel løsne under udtørring skridt, hvis hele slide surface er ikke omfattet af NaOH. Hvis glidefladen ikke var dækket helt, gentages ved tilsætning af 1 ml 0,1 N NaOH. Objektglas kan derefter opbevares ved stuetemperatur (RT) i flere dage. Bemærk: Et alternativ til NaOH ætsning er at ozon-eller plasma-ren dias.
- 3-aminopropyltriethoxysilan (APES) belægning: I et stinkskab, placer objektglassene i et 15 ml skål og tilsæt 300 gl APES på hver NaOH ætset dias. Lad APES reagerer med NaOH glider i 5 min. Overskridelse denne gang vil medføre besvær med at vaske ud uomsat APES reagens. Skyl APES grundigt med deioniseret vand 2-3 gange på begge sider af glassene. Hvis vasketøjet ikke er fuldstændig, vil APES oxideres med glutaraldehyd til dannelse af en brun afsætning på objektglas i trin 1.8.
- Glutaraldehyd oxidation: Aspirer alle løsningerne fra glidefladerne. I hver 15 cm skål, 25 ml 0,5% glutaraldehyd i PBS. Reagere i 30 minutter i et mørkt område. Efter 30 minutter aspireres al glutaraldehyd og bruge ikke-lint arbejdskraftBAGGRUNDEN servietter (f.eks Kimwipes) til at tørre forsigtigt dias. Objektglas kan derefter opbevares ved stuetemperatur i op til en dag.
- Gel forberedelse: Efter at have forberedt PA blandinger, herunder acrylamid, bis-acrylamid og Hedeselskabet 2 O i overensstemmelse med nedenstående tabel, afgasses i 30 min, og derefter placere PA blandinger på is for at bremse polymerisation. Tilføj APS og TEMED og bland godt lige før gelerne. Pipette PA blandinger på objektglasset overflader og sted 24 mm x 50 mm, nummer 1 dækglas på toppen af PA. Undgå at trykke dækglas og objektglas sammen og undgå bobledannelse. For geler> 40.000 Pa bruge 100 ul, for andre geler bruger 350 ul.
| Ønskede elasticitetsmodul (Pa) | Acrylamide% | Bis-acrylamid% | Acrylamid fra 40% lager (ml) | Bis-acrylamid fra 2% lager (ml) | Deioniseret vand (ml) | APS (pi) | TEMED (pi) |
| 480 ± 160 3 | 0,06 | 0,75 | 0,3 | 8,95 | 100 | 10 | |
| 4470 ± 1190 | 5 | 0,15 | 1,25 | 0,75 | 8 | 100 | 10 |
| 40.400 ± 2390 | 8 | 0,48 | 2 | 2,4 | 5,6 | 100 | 10 |
Tilpasset fra 6,7.
- Lad PA gel polymerisere i 2 timer, og derefter fjerne dækglas under deioniseret vand.
- Vask PA gel objektglassene i store Coplan krukker i vand natten over (~ 8 timer) til fjernelse af uomsatte acrylamider.
- Tørre dias i en 37 ° C ovn i 2-4 timer, eller indtil PA gel helt hærder.
- PA-gel-objektglas kan opbevares ved 4 ° C i en måned i en forseglet slide boks.
2. Protein Master Plate Forberedelse
- Alle proteiner skuldred blive alikvoteret i lagre af 10X løsninger i bufferne anbefalet af udbyderen og opbevaret ved -80 ° C. De fleste ECM-proteiner er opløselige i deioniseret vand, men pH-værdien kan være nødvendigt at justere med dråber eddikesyre. De fleste vækstfaktorer, cytokiner og rekombinante ekstracellulære domæner fra receptorer fremstilles i PBS med BSA, men producentens betingelser vil variere. Filtrere protein alikvoter gennem et 0,45 um 4 mm nylon sprøjtefilter (Nalgene) inden opbevaring.
- Design en master plade i overensstemmelse med ønsket protein kombinationer og opløsninger. Adhærente celler normalt benytte tilstedeværelsen af mindst en kompatibel ECM at mediere celleadhæsion, men antistoffer mod celleoverflade-epitoper kan også mediere vedhæftning tider. Det er en god idé at tilføje frit FITC farvestof eller en fluorphore-konjugeret protein med mindst en brønd, således at matrixer kan let orienteres senere.
- Forbered master pladen ved at fortynde protein kombinationer med udskrivning buffer bestående af 100 mMTris-acetate/20% glycerol/0.05% Triton-100X pH 5,2. Typisk hver brønd af en 384-brøndsplade indeholder højst 10 pi.
- Optage indholdet af hver brønd i hver master plade i en tabulatorsepareret database fil og give hver enkelt mester plade med et unikt identifikationsnummer. En seks-cifret dato efterfulgt af kunstnerens initialer ofte tjener formålet (MMDDYYinitial). Fordi brønden mængder er små, kan protein alikvoter anvendes effektivt til at frembringe et stort antal gentagne plader. Det anbefales, at master-plader opbevares ved -80 ° C og hver masterplade bør underkastes ikke mere end to fryse-optøningscyklusser.
3. MEArray Printing
- MEArrays kan udskrives med de fleste konventionelle microarray trykning robotter. Fjerpen pin printere, der bruger enten silikone eller rustfrit stål pins fungerer godt, men protein viskositet kan være problematisk. Kapillar printere er ideelle microarray trykning robotter til denne ansøgning, da de arbejderGodt med viskose proteinopløsninger.
- For at opnå en god statistisk styrke i et array, er 10 til 12 gentagne pletter af hver mikromiljø anbefales. En sådan udformning vil tillade sammenligning af aktivitet i et mikromiljø i forhold til en anden i samme array ved hjælp af simple T-test statistikker. Dunnette test kan bruges til at sammenligne aktiviteten i et kontrolmiljø med andre mikromiljøer. Denne konstruktion fungerer bedst, når en funktionel fænotype er blevet forbundet med kontrol mikromiljø før udførelse af MEArray eksperimenter.
- Luftfugtighed holdes omkring 50%. Fugtstyring er vigtigt, fordi en lav fugtighed kan tørre opløsningen inde tappene eller i brøndene i masterplade forårsager ineffektiv aflejring på de trykkerier substrater. Fugtighed kan styres effektivt ved drapering robotten med ikke-porøs plastfolie og ved anvendelse af både en fugter og en affugter sat til at holde 50% fugtighed. Afkølet trykning plattens kan useful til at bevare nogle proteiner, men skal udvises forsigtighed for at undgå at der dannes kondens på dias.
- Hvert trykt opstilling bør mærkes med fryser-bevis objektglasmærkater kodet med et serienummer, der består af master pladens identifikator efterfulgt af et trecifret tal (MMDDYYinitial-nnn). Da hver opstilling anvendes eller distribueres, skal oplysninger om deres eksperimentelle behandlinger skal holdes i en database. Sporing datoerne for trykning og antallet af fryse-tø cykler af master plader vil hjælpe med at identificere de optimale betingelser for at opretholde reproducerbarhed.
- Trykte MEArrays bør opbevares i forseglede slide bokse ved -20 ° C i højst en måned. Reproducerbarhed mærkbart falder derefter.
4. Dyrkning af pattedyrceller om MEArrays til funktionel analyse
- Vedhæft kultur kamre: For at begrænse mængden af medier og antal celle krævede kultur på MEArrays, en plastik kammer er fitted at omgive den trykte array. For mange arrays, kan et enkelt kammer fra en 2-kammer slide (Nunc), der indeholder et areal på 4,2 cm2 anvendes. Fjern kamrene fra de fremstillede kammer slide og skær kamrene i halvdel med et barberblad. Anvende en 3 ml sprøjte til at anvende en tynd vulst af akvarie-silicone (DAP) til kanten af et kammer og tryk på overfladen af en MEArray. Undgå at placere anvendt akvarium silicone kammer på arrayet funktioner.
- Blokering og skylning: MEArrays skal være godt skylles for at fjerne uomsatte monomerer, som kan være toksisk for celler. Hvis PDMS-overtrukne objektglas blev anvendt, skal regionerne i mellem de trykte kendetegn først skal blokeres med en ikke-fouling overtræk til at forhindre celleadhæsion, inkubere arrays i 1% Pluronic F108 (BASF) i vand eller 2% BSA i vand i 15 minutter under vakuum. PA gel slides ikke kræver en blokerende trin. I alle tilfælde, skylles arrays med cellekulturmedier tre gange i fem minutter (alle valg afhængeraf de anvendte celler, men anvendelse af antibiotika anbefales uanset mediet eller celler). PA geler kræver yderligere 30 min inkubation i medierne for at rehydrere gelen.
- Cellebinding: Fire til fem arrays kan passe inde i en enkelt 15 cm steril petriskål. Dække petriskål med låg at holde arrays sterile. Tilsæt halvdelen af det endelige medielydstyrken til MEArray ved tilsætning af cellerne i mediet til en slutkoncentration på 10.000 til 1.000.000 celler / ml. Celler vil knytte til de trykte funktioner på forskellige satser alt efter sammensætningen af den trykte mikromiljø. Check ensartet binding ved at se arrays gennem et omvendt fase-mikroskop i 15-20 minutters intervaller. Ved forsigtigt at ryste MEArrays frem og tilbage, kan celler, der er knyttet på en mønstret måde adskilles fra de flydende, ikke-bundne celler.
- Fjernelse af ubundne celler: Til PA-overtrukne MEArrays, kan de ubundne celler aspireret, og mediet kan erstattes med en passende størrelse. På PDMS-overtrukne MEArrays, kan mediet aldrig helt fjernet fra brønden, fordi cellerne tørre ud og dø næsten omgående. Således på PDMS-overtrukne MEArrays skal ubundne celler fjernes ved en proces af successive udveksling af halvdelen af mængden af mediet, indtil alle ubundne celler fjernes, som bestemt ved mikroskopisk undersøgelse. Den de-befugtning virkning af PDMS er mindre fremtrædende, når serum-holdige medier anvendes sammenlignet med definerede medier, og når BSA anvendes til at spærre de ikke trykte områder sammenlignet med Pluronics F108.
- Celler kan dyrkes på MEArrays placeret inde på 15 cm petriskåle i mange dage med normale udskiftning af medium. Medier ændringer på PDMS slides skal ske med successive ændringer af halvdelen af medielydstyrken.
- Fælles fiksativer, såsom paraformaldehyd og methanol / acetone, er forenelige med MEArray systemer. Når farvning af celler på PA-coatede MEArrays, kan fikseringsmidler tilsættes og vaskes bort på samme måde som de ville være i en konventionel farvningsprocedure.Men når farvning af celler på PDMS-overtrukne MEArrays skal overfladen være våd selv under fikseringen. Aspirere halvdelen af medierne og erstatte med et fiksativ. Gentage processen flere gange, indtil den fyldes med et flertal af fiksativ. Efter fiksering bliver fiksativ gradvist erstattes på samme måde med blokeringsbuffer, der passer til det næste trin af analysen.
- Immunofarvning er almindeligt anvendt til at analysere cellulære funktioner. Farvning rutiner vil variere, men når der arbejdes på PDMS MEArrays, er man nødt udføre hver vask og aspiration trin som ovenfor, gradvist ved at ændre de løsninger og aldrig lade den overflade, de-vådt. De-befugtning vil give fejl i farvning.
- Kamrene kan fjernes ved hjælp af et barberblad. Dækglas kan monteres oven på farvede MEArrays med Fluoromount-G (Southern Biotech). Påvisning kan udføres med de fleste flerfarvet fluorescens microarray scannere eller konfokale mikroskoper med motoriseretflisebelagt billedoptagelse tilstande.
5. Repræsentative resultater
Et eksempel på mønstret proteinaflejring på et trykt PDMS-coasted MEArray med en firkantet spids silicium benene på en fjerpen pin microarray-printing robot er vist i figur 2. Aflejring af forskellige proteiner, der udskrives kan verificeres ved immunfluorescens under anvendelse af antistoffer (figur 2A). Fortyndinger af proteinopløsninger i masterplade er afspejler det beløb (fluorescensintensitet), der er deponeret på den trykte substrater overflade (figur 2B). Cellerne bør lægge til de trykte funktioner i en indlysende mønstrede måde (figur 2C).
Et eksempel på en MEArray eksperiment viser, at inverse fortyndinger af to mikromiljø proteiner fremkaldte specifikke keratin udtryk profiler i en proteinkoncentration-afhængig måde i en human multipotent brystepitelceller progenitor cellelinie (D920-celler), er vist i figur 3.. Boble plots er anvendelige til bestemmelse af, om bestemte fænotyper knyttes til celler på gentagne elementer i en fortyndingsrække. For eksempel, hvis et bestemt molekyle i et mikromiljø forårsager en tydelig fænotype, når instruktive komponent er blevet fortyndet nok til en baggrund af en neutral ECM fænotypen skulle ændre eller forsvinde. Immunofluorescens detektering af keratin 8 og keratin 14 mellemliggende filamenter proteiner blev udført med en Axon 4200a (Molecular Devices) microarray scanner. Tolv replikat fortyndingsserien blev trykt på hvert MEArray, og log 2 mellem keratin 8 til keratin 14 gennemsnitlig fluorescensintensitet blev afbildet grafisk som en boble plot for at give et realistisk billede af variation og reproducerbarhed af signalet. Vist er data fra en MEArray, der var fastsat efter cellerne var fastgjort, og ubundne celler blev vasket bort (fig. 3A), og efter 24 timer i culture (figur 3B). Til dette relativt lille analyse blev en envejs ANOVA anvendt til at bestemme variansen fra middelværdien signal ved hvert tidspunkt, og grupperes to-halet t-test blev anvendt til at bestemme, om de forskellige fortyndinger af type I collagen og rekombinant human P- cadherin forårsagede ændringer i keratin ekspression. Der var ingen afvigelse fra middelværdien blandt celler på de funktioner lige efter påsættelse, men der er væsentlige forskelle i keratin ekspression mellem cellerne efter 24 timers eksponering for de forskellige mikromiljøer. T-tests bekræftet, at høj type I collagen koncentrationer fremkaldte højere keratin 8 udtryk, hvorimod høje P-cadherin koncentrationer fremkaldte en stærk keratin 14 signal efter 24 timer. Dette resultat var konsistent med tidligere rapporter om, at P-cadherin-holdige mikromiljøer vil pålægge af K14-udtrykkende myoepithelial fænotype bi-potente mamma progenitorceller 4.
Et eksempel på en hel scanned MEArray trykt på en 40000 Pa PA gel er vist i figur 4..
Fig. 1. Et rutediagram af MEArray procedure. Først er de trykkerier substrata fremstillet enten med PDMS eller PA. For det andet master pladerne er parate og kommenteret i en database. For det tredje er de MEArrays trykkes og kodet med serienumre. Det fjerde er kultur kamre fastgjort, overflader er blokke og / eller skylles, dernæst Cellerne lades vedhæfte og ubundne celler vaskes bort. For det femte kan cellerne behandles med farvning eller bioassay efter en periode med inkubation baseret på eksperimentelle design. Endelig kan Images of MEArray skal indhentes og analyseres med passende scanner og software.
Figur 2. Indlånition og relative overflod af trykte proteiner kan kontrolleres med immunfarvning før cellebinding. A) Antistoffer, der er anerkendt type IV collagen og laminin-111 blev anvendt til at verificere deres tilstedeværelse i trykte funktioner i en MEArray. B) Anvendelse af en gennemsnitlig pixelintensitet analyse funktion i NIH ImageJ software, den relative forekomst af de to proteiner på tværs af en række fortyndinger, fra en 200 mg / ml proteinopløsning, kan vurderet kvalitativt. C) Fase mikrograf af D920-celler er knyttet til kvadratiske funktioner i en trykt PDMS-overtrukne MEArray.
Fig. 3. Et eksempel på en MEArray analyse under anvendelse af ændringer i keratin ekspression i en multipotent progenitorcelle linje som en funktion af tid og mikromiljø. Hver boble repræsenterer forhold mellem keratin 8 og keratin 14 proteinniveauer 10-15 celler fastgjort til en feaTure i en MEArray. Ekspression blev bestemt med immunfluorescerende prober. A) viser keratin forhold i celler, lige efter fastgørelse, og B) viser de keratin-forhold efter 24 timer på et array, der blev udpladet parallelt. Den maksimale koncentration af begge proteiner var 200 ug / ml og fortyndet 2-fold. Diameteren af en boble repræsenterer størrelsen af log 2 mellem keratin 8 og keratin 14 gennemsnitsintensiteten, og den orange og hvide farvekodning indikerer værdier> 0 og <0 hhv. F-værdierne for envejs ANOVA og P-værdier fra T-test, og beslag med pile identificerer populationer sammenlignet, er vist.
Fig. 4. Et eksempel på en MEArray scanning erhvervet under anvendelse af en flisebelagt dataopsamling på en laserscanning konfokal mikroskop. HCC1569 celler vi lov til at inkorporere DNA analog Edu i 4 timer forud for fiksering.DAPI (blå) og edu (rød) er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
The MEArray metode præsenteres her muliggør funktionelle analyser af celle-og kombinatoriske mikromiljø interaktioner 4. MEArray analyse kombinerer brugen af basale micropatterning teknologier, cellebiologi og microarray trykning robotter og analyse enheder, der er tilgængelige i mange flerbruger faciliteter. MEArray skærme er kompatible med de fleste adhærente celletyper, men serumfrie medier formuleringer kan være nødvendigt at justere i nogle tilfælde at inkludere BSA eller <1% serum, hvilket kan forbedre fastgørelsen. Denne fremgangsmåde er begrænset af tilgængeligheden af reagenser til analyse af en bestemt cellulær funktion, fluorescens-baserede assays er kompatible med de fleste matrix-baseret billedsystemer, men kolorimetriske assays kan også fungere godt. Andre variationer af denne metode findes og støtter den generelle idé, at komplekse mikromiljøer kan funktionelt dissekeres at afsløre, hvad roller individuelle mikromiljø molekyler og kombinationer deraf spiller i forskellige celle-funktioner 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
ML støttes af NIA (R00AG033176 og R01AG040081) og Laboratory Directed Forskning og Udvikling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
