Summary
שיטת הקרנה פונקציונלית קומבינטורית לתובנה להשפעות של ההרכב המולקולרי של microenvironments על תפקודים תאיים מתוארת. השיטה מנצלת את הטכנולוגיות קיימות microarray מבוססים לייצר מערכים של microenvironments קומבינטורית מוגדר התומכים הידבקות תא וניתוח פונקציונלי.
Abstract
יחסי הגומלין בין התאים וסביבתם Microenvironment יש השלכות תפקודיות להתנהגות סלולרית. ברמת התא הבודדה, microenvironments שונה יכול לכפות בידול, הגירה, ופנוטיפים תפוצה, וגם ברמת רקמות microenvironment תהליכים מורכב כמו המורפוגנזה וtumorigenesis 1. לא רק שתא ותכולה מולקולרית של השפעת microenvironments את התאים מבפנים, אבל כך גם הגמישות 2 ו 3 גיאומטריה של הרקמה. מוגדר כסכום הכולל של תאי תאים,-ECM, ומסיסות אינטראקציות של גורמים, בנוסף למאפיינים פיסיים, microenvironment הוא מורכב. פנוטיפים של תאים בתוך רקמה באופן חלקי בשל התכולה הגנומי שלהם וחלקו בשל האינטראקציות קומבינטורית עם microenviroment. אתגר גדול הוא לקשר שילובים ספציפיים של רכיבי microenvironmental עם התנהגויות ייחודיות.
אף אוזן גרון "> כאן, אנו מציגים את פלטפורמת המיקרו microarray (MEArray) להקרנה פונקציונלית מבוססת תאים של אינטראקציות עם microenvironments קומבינטורית 4. השיטה מאפשרת שליטה בו זמנית של ההרכב המולקולרי ומודולוס האלסטיות, ומשלבת את השימוש של microarray הזמין באופן נרחב וטכנולוגיות micropatterning. מסכי MEArray דורשים מעטים כמו 10,000 תאים לכל מערך, המאפשרים לימודים תפקודיים של תאים מסוגים נדירים כגון תאי אב מבוגרים. מגבלה של הטכנולוגיה היא שmicroenvironments רקמות שלמים לא ניתן סכם לחלוטין על MEArrays. עם זאת, השוואה של תגובות באותו סוג תא לmicroenvironments נלווה רב, למשל שילובי pairwise של חלבוני ECM המאפיינים את הרקמה נתונה, תספקנה תובנה כיצד רכיבי microenvironmental לעורר פנוטיפים תפקודיים רקמות ספציפיות.MEArrays ניתן להדפיס תוך שימוש במגוון רחב של רקומביננטי groגורמי wth, הציטוקינים וחלבונים מטוהרים ECM, והצירוף. הפלטפורמה היא מוגבלת רק על ידי הזמינות של חומרים כימיים ספציפי. MEArrays ניתן לניתוח נושן, אבל לרוב משמש לניתוחי נקודת סיום של פונקציות תאיות הניתנות למדידה בבדיקות ניאון. לדוגמה, סינתזת דנ"א, אפופטוזיס, רכישה של מדינות מובחנות, או ייצור של מוצרי גן ספציפיים נמדדת בדרך כלל. בקצרה, את הזרימה הבסיסית של ניסוי MEArray היא להכין שקופיות מצופות מצע הדפסה ולהכין את צלחת ההורים של חלבונים, כי הם להיות מודפסים. אז המערכים מודפסים עם רובוט microarray, תאים מותר לצרף, לגדול בתרבות, ולאחר מכן כימי קבועים עם הגיע לנקודת סיום הניסוי. מבחני פלורסנט או colorimetric, הדמיה עם מיקרוסקופים מסורתיים או סורקי microarray, משמשים כדי לחשוף פנוטיפים מולקולריים ותאיים הנוגעים בדבר (איור 1).
Protocol
1. הכנת מצע הדפסה
ההחלטה להשתמש בשקופיות polydimethylsiloxane (PDMS)-מצופה או polyacrylamide (רש"פ)-מצופות תלויה בפרמטרים החשובים של עיצוב ניסיוני. מודולוס האלסטיות של שני הפולימרים יכול להיות מכוון כדי לחקות את stiffnesses של רקמות שונות על ידי שינוי יחס הבסיס / ריפוי של PDMS, ויחס acrylamide / bis-acrylamide של הרשות פלסטינית. PDMS יכול לחקות רקמות נוקשות בטווח של 1-10MPa (סחוס למשל, קרניים, ודפנות עורקים), והרשות פלסטיניות יכולה לחקות רקמות רכות בטווח של 100Pa-100kPa (שד למשל, מוח, כבד וערמונית) 5. PDMS הוא זול, קל להכנה, והגיאומטריה של התכונות המודפסות תהיה זהה לראש של סיכות ההדפסה. לכן הגודל והצורה של התכונות יכולים להיות נשלטו במדויק באמצעות סיכות בגיאומטריות קצה שונות. PDMS הוא יותר הידרופובי מהרשות הפלסטינית, אשר גורם לכמה אתגרים במהלך טיפול התא וimmunosTaining צעדים, ועשוי להיות בקנה אחד עם כמה שורות תאים. כי הרשות הפלסטינית היא הידרוג'ל ומשטח שאינו יליד עכירות, תאים יהיו לצרף רק למקומות שבם יש חלבונים שהידבקות תא תמיכה. הגיאומטריה של התכונות המודפסות על ג'לי רשות לא בדיוק אחר הגיאומטריה של ראש הסיכה, בדרך כלל הם הופכים לעיגולים עקב דיפוזיה, ללא קשר לגיאומטרית הסיכה המשמשת. פרמטרי זמן ופיני מגע הדפסות קוטר ניתן לקבוע באופן אמפירי לגודל תכונה אופטימלי על ג'לי של הרשות הפלסטינית.
Polydimethylsiloxane (PDMS)
- בכוס פלסטיק חד פעמית לשלב בסיס Sylgard 184 סיליקון אלסטומר עם סוכן הריפוי ב10:01 יחס, לערבב נמרצות בכף אז דגה בפעמון ואקום טמפרטורת חדר למשך 30 דקות מעץ או פלסטיק.
- מרכז שקופית סטנדרטית מיקרוסקופ על צ'אק ידי הלחץ של הוואקום coater ספין, אז טפטוף 0.5 מ"ל של פולימר אלסטומר המעורב אל מרכז שקופית פני השטח. ספין ב6000 סל"ד עבור 60 שניות.
- לרפא את שקופיות PDMS המצופים בתנור 70 ° C או על פלטה חשמלית דיגיטלית (מוגן מפני אבק) עבור 4 שעות ללילה.
- שקופיות נרפאו יכולות לשמש באופן מיידי, או מאוחסנות במשך כמה חודשים בשקופית תיבה שנחתמה בתוכה שקית פלסטיק ושמר במגירה. PDMS מושך אבק כך זה צריך להיות גם מוגן מפני זרימת אוויר חדר.
- הערה: Nitrile כפפות או אחרות שאינן לטקס חובה ללבוש בעת עבודה עם ערכת אלסטומר PDMS. מגע מקרי עם כפפות גומי ימנע פילמור PDMS.
Polyacrylamide (הרשות הפלסטינית)
- תחריט NaOH: שקופיות מקום ברחוב של חום בשעת 80 ° C. הוסף 1 המ"ל NaOH 0.1N בכל שקופית, והקפד לכסות את כל פני השקופית. בואו NaOH להתאדות (סרט לבן צריך להיוצר על שקופית השטח). מאז ג'ל הרשות יכול רק לצרף תקיפות על משטחים חרוטים NaOH, ג'ל הרשות הפלסטינית לנתק במהלך ייבוש שלב אם השקופית כל הגולשאס אינו מכוסה על ידי NaOH. אם שקופית המשטח לא היה מכוסה לגמרי, חוזר על ידי הוספת 1 המ"ל NaOH 0.1N. שקופיות לאחר מכן ניתן לאחסן בטמפרטורת חדר (RT) במשך כמה ימים. הערה: חלופה לתחריט NaOH היא אוזון או פלזמה לנקות את השקופיות.
- 3-Aminopropyltriethoxysilane ציפוי (קופי אדם): במנדף, שקופיות מניחות בתבנית 15 מ"ל, ולהוסיף 300 קופי μl על כל שקופית חרוטה NaOH. תן לקופים מגיבים עם NaOH מחליק למשך 5 דקות. עולה על זמן זה יגרום קושי בכביסה מן מגיב קופים unreacted. לשטוף ביסודיות עם מי קופים deionized פעמים עד שלוש פעמים בשני הצדדים של השקופיות. אם הכביסה אינה שלמה, קופים יהיו חמצון על ידי Glutaraldehyde כדי ליצור הפקדת חום בשקופיות בשלב 1.8.
- חמצון Glutaraldehyde: לשאוב את כל הפתרונים משקופיות המשטחים. בכל צלחת 15 סנטימטרים, להוסיף המ"ל glutaraldehyde 0.5% 25 ב PBS. מגיב למשך 30 דקות באזור חשוך. לאחר 30 דקות, לשאוב כל glutaraldehyde ולהשתמש עובדים לא מוךמגבוני atory (Kimwipes למשל) כדי לייבש את השקופיות בזהירות. שקופיות אז יכולות להיות מאוחסנות בRT עד יום אחד.
- הכנת ג'ל: לאחר הכנת תערובות רשות כולל acrylamide, BIS-acrylamide וDDH 2 O בפי בטבלה שלהלן, דגה למשך 30 דקות, ואז למקם את תערובות רשות על קרח להאט פילמור. הוסף APS וTEMED ומערבב היטב לפני קבלת זכות בג'לי. תערובות Pipet רשות לשקופית המשטחים והמקום 24 המ"מ x 50 מ"מ, מספר 1 coverslips על גבי הרשות הפלסטינית. הימנע לחיצת coverslip ושקופיות זכוכית יחד ולמנוע היווצרות בועה. לג'לי> 40000 אבא להשתמש 100 μl, לג'לי אחר להשתמש μl 350.
| מודולוס הרצוי (Pa) | % Acrylamide | % Bis-acrylamide | Acrylamide ממניות 40% (מ"ל) | Bis-acrylamide ממניית 2% (מ"ל) | מי deionized (מ"ל) | APS (μl) | TEMED (μl) |
| 480 ± 160 3 | 0.06 | 0.75 | 0.3 | 8.95 | 100 | 10 | |
| 4470 ± 1190 | 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 100 | 10 |
| 40400 ± 2390 | 8 | 0.48 | 2 | 2.4 | 5.6 | 100 | 10 |
מעובד מתוך 6,7.
- בוא ג'ל הרשות פלמר ל2 שעות, ולאחר מכן להסיר coverslips מתחת למי deionized.
- שטוף את שקופיות ג'ל הרשות פלסטינית בצנצנות Coplan גדולות במים למשך הלילה (~ 8 שעות) כדי להסיר acrylamides unreacted.
- מגלשות יבשות בתנור ° C 37 עבור 2-4 שעות או עד שהרשות הפלסטינית ג'ל מתקשות לחלוטין.
- שקופיות ג'ל רשות ניתן לאחסן ב 4 ° C למשך חודש אחד בשקופית קופסה אטומה.
2. הכנת פלייט מאסטר חלבון
- כל שאול החלבוניםד להיות aliquoted במניות של פתרוני 10X במאגרים המומלצים על ידי הספק ואוחסן ב -80 ° C. רוב חלבוני ECM הם מסיסים במי deionized, אבל החומציות ייתכן שתצטרך להיות מותאמת עם טיפין של חומצה אצטית. רוב גורמי גדילה, הציטוקינים ותחומים תאיים קולטני רקומביננטי ערוכים PBS עם BSA, אבל תנאי יצרן ישתנו. סנן את aliquots החלבון דרך 0.45 מיקרומטר 4-מ"מ ניילון מזרק מסנן (Nalgene) לפני האחסון.
- עצב את צלחת אב בהתאם לשילובים ודילולי חלבון רצויים. תאים חסידים בדרך כלל להסתמך על הנוכחות של ECM התואם לפחות אחד לתווך הידבקות תא, אבל נוגדנים לאפיטופים בתא שטח יכולים גם לתווך מצורף לפעמים. זה רעיון טוב להוסיף צבע FITC בחינם או חלבון fluorphore מצומדות לאחד לפחות, כך שגם מערכים יכולים להיות בקלות בכיוון אחר.
- הכן צלחת האדון על ידי דילול שילובי החלבונים עם חיץ הדפסה המורכבות של 100 מ"מימTris-acetate/20% glycerol/0.05% Triton-100X pH 5.2. בדרך כלל בכל היטב של צלחת 384 גם מכיל לא יותר מ 10 μl.
- רשום את התוכן של כל אחד גם בכל צלחת שנייה בקובץ בסיס נתונים מופרד כרטיסייה ולספק כל צלחת הורים עם מספר זיהוי ייחודי. תאריך 6 ספרות אחריו ראשי התיבות של המעצב לעתים קרובות משרת את המטרה (MMDDYYinitial). בגלל הכרכים גם הם קטנים, aliquots חלבון יכול להיות מנוצל ביעילות ליצירת מספר גדול של צלחות לשכפל. מומלץ צלחות אב מאוחסנות ב-80 ° C וכל צלחת הורים צריכים לעבור לא יותר משני מחזורי הקפאת הפשרה.
3. הדפסת MEArray
- MEArrays ניתן להדפיס עם רובוטי הדפסת microarray הקונבנציונליים ביותר. מדפסות סיכת נוצה המשתמשות בסיליקון או סיכות נירוסטה לעבוד היטב, אבל צמיגות חלבון יכולה להיות בעייתית. מדפסות נימים הן רובוטי הדפסת microarray אידיאליים עבור יישום זה, כפי שהם פועליםהיטב עם פתרוני חלבון דביקים.
- כדי להשיג כוח סטטיסטי טוב בתוך מערך, 10-12 נקודות לשכפל של כל microenvironment מומלצות. עיצוב שכזה יאפשר השוואת הפעילות בmicroenvironment אחד ביחס למשנה באותו המערך באמצעות סטטיסטיקה פשוטה מבחן t. המבחן של Dunnette ניתן להשתמש כדי להשוות בין פעילות בסביבת בקרה בmicroenvironments אחר. עיצוב זה עובד הכי טוב כאשר הפנוטיפ תפקודי נקשר עם microenvironment השליטה לפני ביצוע ניסויי MEArray.
- יש לשמור על לחות סביב 50%. בקרת לחות חשובה משום שלחות נמוכה יכולה לייבש את הפתרון בתוך את הסיכות או בבארות של צלחת האדון גורם תצהיר יעיל על מצע ההדפסה. לחות ניתן לשלוט ביעילות על ידי כורכת הרובוט עם יריעות פלסטיק אינן נקבוביות והן באמצעות מכשיר אדים ודה מכשיר אדים להגדיר לשמור על לחות של 50%. plattens הדפסה מקוררת יכול להיות usefאול לשימור חלבונים מסוימים, אבל זהירות יש לנקוט כדי למנוע התעבות מ טביעה בשקופיות.
- כל מערך מודפס צריך להיות מתויג עם שקופיות תוויות מקפיא הוכחה מקודדות עם מספר סידורי שמורכב מהמזהה של צלחת ההורים ואחריה מספר בן שלוש ספרות (MMDDYYinitial-nnn). כפי שכל מערך משמש או להפיץ, פרטים של הטיפולים הניסיוניים יש לשמור במסד נתונים. מעקב את תאריכי הדפסה ואת המספרים של מחזורי הקפאת הפשרה של צלחות האב יעזור לזהות את התנאים האופטימליים לשמירה על שחזור.
- MEArrays המודפס צריך להיות מאוחסן בשקופיות תיבות חתומות ב -20 ° C לא יותר מפעם אחת בחודש. Reproducibility ניכר יורד לאחר מכן.
4. תאי יונקי culturing על MEArrays לאנליזה פונקציונלית
- צרף תאי תרבות: כדי להגביל את עוצמת הקול של מדיה ומספרים של תרבות תא הנדרשת על MEArrays, קאמרי פלסטיק הוא fitted להקיף מערך המודפס. למערכים רבים, חלל אחד משקופית 2-קאמרית (Nunc) המכילה שטח של 4.2 סנטימטר 2 ניתן להשתמש. הסרת התאים משקופיות הקאמריות המיוצרות וחתך את התאים במחצית עם סכין גילוח. השתמש במזרק 3 מ"ל ליישם חרוז דק של סיליקון אקווריום (DAP) לקצה חדר ולחץ על פני השטח של MEArray. הימנע מלהניח את תא סיליקון אקווריום מיושם על תכונות המערך.
- חסימה ושטיפה: MEArrays צריך להיות שטוף היטב כדי להסיר מונומרים unreacted, שיכול להיות רעיל לתאים. אם שקופיות PDMS מצופים היו בשימוש, ולאחר מכן את האזורים שבבין התכונות המודפסות ראשון צריכים להיות חסומים בציפוי הלא עכירות כדי למנוע הידבקות תא; דגירת המערכים בPluronic 1% F108 (BASF) במים או 2% BSA ב מים במשך 15 דקות תחת ואקום. שקופיות ג'ל הרשות הפלסטינית אינן דורשות צעד חסימה. בכל המקרים, יש לשטוף את מערכים עם תקשורת סלולרית התרבות שלוש פעמים במשך חמש דקות (תלויה בחירת מדיהעל התאים המשמשים, אך שימוש באנטיביוטיקה מומלץ ללא קשר לאמצעי תקשורת או לתאים). ג'לי הרשות הפלסטינית דורש דגירה נוספת 30 דקות בתקשורת לrehydrate ג'ל.
- קובץ מצורף תא: ארבעה עד חמישה מערכים יכולים להתאים בתוך של 15 סנטימטרים בודדים צלחת פטרי סטרילית. כסה את צלחת פטרי עם מכסה כדי לשמור על מערכי סטרילי. הוסף חצי מנפח התקשורת הסופית לMEArray ידי הוספת התאים בתקשורת לריכוז סופי של 10,000 עד 1,000,000 תאים / מ"ל. תאים יהיו לצרף לתכונות המודפסות בשיעורים שונים בהתאם להרכב microenvironment המודפס. בדקו מצורף אחיד, על ידי הצגת המערכים באמצעות מיקרוסקופ שלב הפוך בתוך 15 עד 20 דקות במרווחים. בטלטול MEArrays קדימה ואחורה בעדינות, תאים הקשורים באופן דוגמת ניתן להבדיל בין התאים הצפים, הפנויים.
- הסרת תאים מאוגדים: ברשות MEArrays המצופה, תאים לא הכרוכים עלולים להישאף והתקשורת יכולה להיות מוחלפת עם נפח מתאים. על PMEArrays DMS-מצופה, התקשורת לעולם לא יכולה להיות הוסרה לחלוטין מהבאר, כי התאים להתייבש ולמות באופן כמעט מיידי. לכן על MEArrays PDMS מצופה, תאים המאוגדים יש להסיר על ידי תהליך של חילופים רצופים של מחצית מהנפח של תקשורת עד כל תאים מאוגדים יוסרו, כפי שנקבעו על ידי בדיקה מיקרוסקופית. השפעת דה ההרטבה של PDMS היא פחות בולטת, כאשר תקשורת סרום המכיל משמשת בהשוואה לאמצעי תקשורת מוגדרת, וכאשר BSA משמש לחסימת האזורים הודפסו בהשוואה לPluronics F108.
- תאים יכולים להיות מתורבתים בMEArrays ממוקם בתוך 15 סנטימטר של צלחות פטרי במשך ימים רבים עם שינויים בתקשורת רגיל. שינויים בתקשורת על שקופיות PDMS חייבים להיעשות עם שינויים רצופים של מחצית מנפח התקשורת.
- fixatives הנפוץ, כגון paraformaldehyde ומתנול / אצטון, הם תואמים למערכות MEArray. כאשר הכתימו תאים בMEArrays רשות מצופית, fixatives ניתן להוסיף ונשטף בדיוק כפי שהם היו בהליך הכתמה קונבנציונלית.עם זאת, כאשר הכתמת תאים בMEArrays PDMS המצופה, השטח חייב להישאר רטוב גם בקיבעון. לשאוב מחצית מהתקשורת ולהחליף עם מקבע. חזור על התהליך כמה פעמים עד שגם הוא מלא ברוב של מקבע. לאחר קיבוע, מקבע מוחלף בהדרגה באותו אופן עם חיץ חסימה מתאימה לצעד הבא בניתוח.
- Immunostaining משמש בדרך כלל כדי לנתח פונקציות סלולריות. שגרת צביעה תשתנה, אבל כשעובד על MEArrays PDMS, צריכים לבצע כל כביסה וצעד שאיפה כאמורה לעיל, בהדרגה לשנות את הפתרונים ולא מאפשרת למשטח רטוב דה. דה ההרטבה תגרום חפצים בכתמים.
- התאים ניתן להסיר בעזרת סכין גילוח. Coverslips יכול להיות מותקן על גבי MEArrays המוכתם באמצעות Fluoromount-G (הדרום יוטק). איתור יכול להתבצע עם רוב סורקי ססגוניות קרינת microarray או במיקרוסקופי confocal עם ממונעמצבי תמונת רכישת אריחים.
5. נציג תוצאות
דוגמא תצהיר של חלבון בדוגמת על מודפס PDMS-שייט MEArray באמצעות סיכות סיליקון קצותיהן מרובעים על רובוט נוצת סיכת microarray הדפסה מוצגת באיור 2. תצהיר של חלבונים שונים המודפסים יכול להיות מאומת על ידי נוגדנים באמצעות immunofluorescence (איור 2 א). דילולים של פתרוני החלבון בצלחת האב הם שיקוף של הכמות (עוצמת ניאון) שתופקד על פני מצע ההדפסה (איור 2 ב '). תאים צריכים לצרף את התכונות המודפסות באופן ברור בדוגמת (האיור 2C).
דוגמה לניסוי MEArray מראה כי דילולים הפוכים של שני חלבוני Microenvironment הושרו פרופילי ביטוי הקרטין ספציפיים באופן ריכוז תלוי חלבון בעמ אפיתל חלב אנושי multipotentשורת תאי rogenitor (D920 תאים), מוצגת באיור 3. חלקות בועה שימושיות לקביעה אם פנוטיפים ספציפיים שהוטלו על תאים בתכונות לשכפל של סדרת דילול. לדוגמה, אם מולקולה מסוימת בmicroenvironment גורמת פנוטיפ ברור, ברגע שהרכיב המאלף כבר מדולל מספיק לתוך רקע של ECM ניטראלי פנוטיפ צריך לשנות או להיעלם. איתור immunofluorescence של קרטין 8 ו 14 חלבוני נימת ביניים הקרטין בוצע עם אקסון 4200a (התקנים מולקולריים) סורק microarray. סדרת דילול עשר לשכפל הודפסה על כל MEArray, ו2 יחס היומן של קרטין 8 עד 14 קרטין אומר עוצמת קרינה שגרף כעלילת בועה לתת רעיון מציאותי של וריאציה ושחזור של האות. הראה הוא נתונים מMEArray שנקבע לאחר שתאים מחוברים ומאוגדים תאים נשטפו (איור 3 א), ולאחר 24 שעות של cultuמחדש (איור 3 ב '). לניתוח זה קטן יחסית, לכיוון אחד ANOVA שמש לקביעת שונות מהאות הממוצעת בכל נקודת זמן, ומקובצי T-בדיקות שני זנב שמשו כדי לקבוע אם דילולים השונים של סוג אני קולגן והאנושי רקומביננטי P- cadherin גרם לשינוי בביטוי קרטין. לא הייתה שום חריגה מהממוצע בין תאים על התכונות רק לאחר קובץ מצורף, אך לא היו הבדלים משמעותיים בביטוי קרטין בין תאים לאחר 24 שעות של חשיפה לmicroenvironments שונה. T-בדיקות וידאו שסוג גבוה אני ריכוזי קולגן שהושרו 8 ביטוי קרטין גבוה יותר, בעוד שריכוזים גבוהים P-cadherin הושרו 14 אות קרטין חזקה אחרי 24 שעות. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים שmicroenvironments P-cadherin המכיל יטיל של K14-להביע פנוטיפ myoepithelial על בתאים חלב דו עצמת 4.
דוגמה לכל scanneד MEArray מודפס על 40,000 אבא רשות ג'ל מוצג באיור 4.
איור 1. תרשים זרימה של הליך MEArray. ראשית, את מצע ההדפסה מוכן או עם PDMS או הרשות פלסטינית. שנית, צלחות האב הן ערוכים ומבוארות במסד נתונים. שלישית, MEArrays מודפסים ומקודד במספרים סידוריים. רביעית, תרבות תאים מחוברים, משטחים בלוקים ו / או שטוף, אז התאים מותרים לצרף ותאים לא כרוכים נשטפים. החמישי, תאים יכולים להיות מטופלים עם כתמים או ביו assay לאחר תקופת דגירה המבוססת על עיצוב ניסיוני. לבסוף, תמונות של MEArray ניתן להשיג ונתחו עם סורק ותוכנה מתאימים.
איור 2. Deposשפע ition והיחסי של חלבונים מודפסים ניתן לאמת עם immunostaining לפני מצורף תא. ) נוגדנים שהוכרו הסוג IV קולגן וlaminin-111 שמשו כדי לאמת את נוכחותם בתכונות מודפסות של MEArray. ב) שימוש בתכונת ממוצע פיקסל עוצמת ניתוח בNIH ImageJ תוכנה, השפע היחסי של שני חלבונים על פני סדרה של דילולים, החל מפתרון חלבון 200 מיקרוגרם / מ"ל, ניתן להעריך באופן איכותי. ג) מיקרוסקופ שלב של D920 תאים המחוברים לתכונות מרובעות של MEArray PDMS מצופה מודפס.
איור 3. דוגמה לניתוח MEArray באמצעות שינויים בביטוי קרטין בשורת תאי אב multipotent כפונקציות של זמן וmicroenvironment. כל בועה מייצגת יחס של קרטין 8 וקרטין 14 רמות החלבון 10-15 תאים המחוברים למכוערתture בMEArray. הביטוי היה נחוש עם בדיקות immunofluorescent. ) מציג את יחסי הקרטין בתאים רק לאחר התקשרות, ו-B) מציג את יחסי הקרטין לאחר 24 שעות במערך שהיה מצופה במקביל. הריכוז המרבי של שני החלבונים היה 200 מיקרוגרם / מ"ל ומדולל 2-קיפול. הקוטר של בועה מייצג את סדר הגודל של 2 יחס היומן של קרטין 8 ועוצמת אומרת קרטין 14, וקידוד הצבעים הכתומים ולבנים מציינים ערכים> 0 ו< 0, בהתאמה. F-ערכים לכיוון אחד ANOVA ו-P-ערכים מ-T-בדיקות, ולוחיות זיהוי עם חצי אוכלוסיות השוואה, מוצגים.
איור 4. דוגמה לMEArray סריקה רכשה באמצעות רכישת רעפים במצב סריקת ליזר מיקרוסקופ confocal. HCC1569 תאים שאפשרנו לשלב את ה-DNA האנלוגי edu עבור 4 שעות לפני הקיבעון.DAPI (כחול) וEDU (אדום) מוצגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת MEArray מוצגת כאן מאפשרת ניתוח פונקציונלי של תאים ואינטראקציות Microenvironment קומבינטורית 4. ניתוח MEArray משלב שימוש בטכנולוגיות בסיסיות micropatterning, ביולוגיה של תא, ורובוטי הדפסה microarray ומכשירי ניתוח הזמינים במתקנים מרובים משתמשים רבים. מסכי MEArray תואמים סוגי תאים חסידים ביותר, אם כי ניסוחי מדיה סרום נטולי ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים במקרים מסוימים לכלול BSA או <1% בסרום, אשר יכול לשפר את הקובץ מצורף. שיטה זו היא מוגבלת על ידי הזמינות של חומרים כימיים לניתוח תפקוד תאי נתון; מבחנים פלואורסצנטי מבוססים הם תואמים את רוב המערך מבוסס מערכות הדמיה, אבל מבחני colorimetric יכולים גם לעבוד היטב. וריאציות אחרות של שיטה זו קיימות ותומכות ברעיון הכללי שmicroenvironments מורכב ניתן גזור תפקודי לגלות מה תפקידי מולקולות Microenvironment בודדות וצירופיהן לשחק במגוון רחב של תפקוד תאtions 8,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
ML נתמך על ידי NIA (R00AG033176 וR01AG040081) ועל ידי מעבדת מחקר ופיתוח בימוי, ארה"ב מחלקת אנרגית החוזה # DE-AC02-05CH11231.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
- LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
- Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
- Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
- Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
- Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
- Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).
