Summary
एक मिश्रित सेलुलर कार्यों पर microenvironments की आणविक संरचना के प्रभावों में अंतर्दृष्टि पाने के लिए कार्यात्मक स्क्रीनिंग पद्धति में वर्णित है. विधि मौजूदा माइक्रोएरे आधारित प्रौद्योगिकी का लाभ लेता है परिभाषित मिश्रित microenvironments के arrays कि कोशिका आसंजन और कार्यात्मक विश्लेषण का समर्थन उत्पन्न.
Protocol
1. मुद्रण Substrata तैयारी
polydimethylsiloxane (PDMS) लेपित या polyacrylamide (पीए) लेपित स्लाइड्स का उपयोग करने का निर्णय प्रयोगात्मक डिजाइन के महत्वपूर्ण मानकों पर निर्भर करता है. दोनों पॉलिमर के लोचदार मापांक PDMS का अनुपात / आधार इलाज, और फिलीस्तीनी अथॉरिटी के अनुपात / बीआईएस acrylamide acrylamide में फेरबदल करके विभिन्न ऊतकों के stiffnesses नकल tuned किया जा सकता है. PDMS 1 10MPa (जैसे उपास्थि, कॉर्निया और धमनियों की दीवारों) की सीमा में stiffer ऊतकों की नकल है, और कर सकते हैं PA 5 100Pa 100kPa (जैसे स्तन, मस्तिष्क, जिगर, और प्रोस्टेट) की सीमा में नरम ऊतकों की नकल कर सकते हैं. PDMS सस्ती, आसान करने के लिए तैयार है, और मुद्रित सुविधाओं की ज्यामिति मुद्रण पिन के सिर के समान हो जाएगा. इस प्रकार और सुविधाओं के आकार के आकार अलग टिप geometries के साथ ठीक हो पिन का उपयोग कर नियंत्रित किया जा सकता है. PDMS पीए की तुलना में अधिक hydrophobic है, जो सेल से निपटने और immunos के दौरान कुछ चुनौतियों का कारण बनता हैकदम taining, और कुछ सेल लाइनों के साथ असंगत हो सकता है. क्योंकि पीए एक hydrogel और एक देशी सतह गैर दूषण है, कोशिकाओं केवल स्थानों जहां प्रोटीन कोशिका आसंजन का समर्थन कर रहे हैं के लिए देते हैं जाएगा. पीए gels पर मुद्रित सुविधाओं की ज्यामिति ठीक सिरा ज्यामिति का पालन नहीं करते हैं, वे आम तौर पर प्रसार के कारण हलकों, सिरा ज्यामिति का उपयोग किया जाता है जो बिना हो. मुद्रण संपर्क समय और पिन व्यास मापदंडों empirically पीए gels पर इष्टतम सुविधा आकार के लिए निर्धारित किया जा सकता है.
Polydimethylsiloxane (PDMS)
- एक 10:1 अनुपात में इलाज के एजेंट के साथ एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक के कप में Sylgard 184 सिलिकॉन elastomer आधार गठबंधन करने के लिए, एक लकड़ी या प्लास्टिक फिर 30 मिनट के लिए एक कमरे के तापमान निर्वात घंटी में कष्टकारक degas जीभ के साथ सख्ती मिश्रण.
- केंद्र एक स्पिन coater के वैक्यूम actuated चक पर एक मानक खुर्दबीन स्लाइड, तो बूंदा बांदी स्लाइड सतह के केन्द्र पर मिश्रित elastomer बहुलक के 0.5 मिलीलीटर. पर स्पिन60 सेकंड के लिए 6,000 rpm.
- इलाज एक 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में या 4 घंटे के लिए रात भर के लिए एक डिजिटल गर्म थाली (धूल से रक्षा) पर PDMS लेपित स्लाइड.
- ठीक स्लाइड्स तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है, या कि एक प्लास्टिक Ziploc बैग के भीतर सील है और एक दराज में रखा एक स्लाइड बॉक्स में कई महीनों के लिए भंडारित किया. PDMS धूल को आकर्षित करती है तो यह अच्छी तरह से कमरे में हवा परिसंचरण से संरक्षित किया जाना चाहिए.
- नोट: Nitrile या अन्य गैर लाटेकस दस्ताने जब PDMS elastomer किट के साथ काम कर रहे हैं पहना होना चाहिए. लाटेकस दस्ताने के साथ आकस्मिक संपर्क PDMS polymerization को बाधित करेगा.
Polyacrylamide (पीए)
- NaOH नक़्क़ाशी: गर्मी ब्लॉक पर 80 में जगह स्लाइड डिग्री सेल्सियस प्रत्येक स्लाइड पर 1 मिलीग्राम 0.1N NaOH जोड़ें, यकीन है कि पूरे स्लाइड सतह को कवर करने के लिए बना है. लुप्त हो जाना NaOH (स्लाइड सतह पर एक सफेद फिल्म फार्म चाहिए). चूंकि PA जेल केवल NaOH etched सतहों पर मजबूती से संलग्न कर सकते हैं, पीए जेल पूरे स्लाइड सर्फ अगर कदम बाहर सुखाने के दौरान अलग होगाइक्का NaOH द्वारा कवर नहीं है. यदि स्लाइड की सतह पूरी तरह से नहीं किया गया था, 1 मिलीग्राम 0.1N NaOH जोड़कर दोहराएँ. स्लाइड्स तो कई दिनों के लिए कमरे के तापमान (आर टी) में संग्रहित किया जा सकता है. नोट: NaOH नक़्क़ाशी एक वैकल्पिक ओजोन या स्लाइड्स प्लाज्मा साफ करने के लिए है.
- 3 Aminopropyltriethoxysilane कोटिंग (वानर): एक धूआं हुड में, एक 15 मिलीलीटर पकवान में जगह स्लाइड, और प्रत्येक NaOH etched स्लाइड पर 300 μl वानर जोड़ने. वानर प्रतिक्रिया के साथ NaOH 5 मिनट के लिए स्लाइड. इस समय से अधिक unreacted वानर अभिकर्मक धोने में कठिनाई का कारण होगा. बाहर वानर विआयनीकृत जल के साथ अच्छी तरह से स्लाइड के दोनों पक्षों पर दो से तीन बार धोएं. यदि धोने पूरा नहीं हुआ है, वानर glutaraldehyde द्वारा ऑक्सीकरण जाएगा 1.8 चरण में स्लाइड पर एक भूरे रंग जमा के रूप में.
- Glutaraldehyde ऑक्सीकरण: स्लाइड सतहों से सभी समाधान Aspirate. हर 15 सेमी डिश में 25 मिलीलीटर पीबीएस में 0.5% glutaraldehyde जोड़ने. एक अंधेरे क्षेत्र में 30 मिनट के लिए प्रतिक्रिया. 30 मिनट के बाद, सभी glutaraldehyde aspirate और गैर - एक प्रकार का वृक्ष श्रम का उपयोग करेंध्यान स्लाइड्स सूखी atory (जैसे Kimwipes) पोंछे. स्लाइड्स तो आरटी पर भंडारित किया जा सकता है और एक दिन के लिए.
- जेल तैयारी: तालिका के साथ नीचे अनुसार, degas एक्रिलामाइड, बीआईएस acrylamide और DDH 2 हे सहित पीए मिश्रण को 30 मिनट के लिए, तैयारी और फिर बर्फ पर पीए मिश्रण जगह करने के लिए नीचे polymerization धीमी करने के बाद. ए पी एस जोड़ें और TEMED और सही जैल करने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण. Pipet स्लाइड सतहों और जगह 24 मिमी पर पीए मिश्रण x 50 मिमी, फिलीस्तीनी अथॉरिटी के शीर्ष पर 1 coverslips संख्या. Coverslip और गिलास स्लाइड के साथ दबाने से बचें और बुलबुला गठन से बचने के. जैल के लिए 40,000> पा 100 μl उपयोग करते हैं, के लिए अन्य जैल 350 μl का उपयोग करें.
| वांछित मापांक (पा) | Acrylamide% | बीआईएस acrylamide% | 40% शेयर से Acrylamide (एमएल) | 2% शेयर से बीआईएस Acrylamide (एमएल) | विआयनीकृत पानी (एमएल) | ए पी एस (μl) | TEMED (μl) |
| 480 ± 160 3 | 0.06 | 0.75 | 0.3 | 8.95 | 100 | 10 | |
| 4470 ± 1190 | 5 | 0.15 | 1.25 | 0.75 | 8 | 100 | 10 |
| 40,400 ± 2390 | 8 | 0.48 | 2 | 2.4 | 5.6 | 100 | 10 |
6,7 से अनुकूलित.
- PA जेल polymerize 2 घंटे के लिए, और फिर विआयनीकृत जल के तहत coverslips हटाने.
- रातोंरात (~ 8 घंटा) unreacted acrylamides हटाने पानी में बड़ी Coplan जार में पीए जेल स्लाइड्स धो लें.
- 2-4 घंटे के लिए या पीए जेल तक एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में सूखी स्लाइड पूरी तरह से मज़बूत बनाता है.
- PA जेल स्लाइड एक मोहरबंद स्लाइड बॉक्स में एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
2. प्रोटीन मास्टर प्लेट तैयारी
- सभी प्रोटीन shoul10X समाधान के शेयरों में प्रदाता द्वारा सिफारिश buffers में aliquoted और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत अधिकांश ECM प्रोटीन विआयनीकृत पानी में घुलनशील हैं, लेकिन पीएच एसिटिक एसिड की बूंदों के साथ समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है. अधिकांश वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, और पुनः संयोजक रिसेप्टर कोशिकी डोमेन BSA साथ PBS में तैयार कर रहे हैं, लेकिन निर्माता भिन्न परिस्थितियों जाएगा. एक 0.45 सुक्ष्ममापी 4 मिमी नायलॉन सिरिंज (Nalgene) भंडारण करने से पहले फिल्टर के माध्यम से प्रोटीन aliquots फ़िल्टर.
- वांछित प्रोटीन संयोजन और dilutions के साथ अनुसार एक मास्टर प्लेट डिजाइन. पक्षपाती कोशिकाओं को आम तौर पर कम से कम एक संगत कोशिका आसंजन मध्यस्थता ECM की उपस्थिति पर निर्भर है, लेकिन कोशिका की सतह epitopes एंटीबॉडी भी लगाव कभी कभी मध्यस्थता कर सकते हैं. यह एक अच्छा विचार है कि कम से कम करने के लिए अच्छी तरह से एक मुफ्त FITC डाई या एक प्रोटीन fluorphore संयुग्मित जोड़ें ताकि arrays आसानी से उन्मुख बाद हो सकता है.
- मुद्रण बफर के साथ प्रोटीन संयोजन 100 मिमी से बना कमजोर द्वारा मास्टर थाली तैयार% Tris-acetate/20% glycerol/0.05 ट्राइटन 100X 5.2 पीएच. आम तौर पर एक थाली 384 अच्छी तरह से प्रत्येक अच्छी तरह से कोई 10 से अधिक μl शामिल हैं.
- एक टैब सीमांकित डेटा बेस के साथ फ़ाइल में प्रत्येक मास्टर थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से सामग्री रिकॉर्ड और एक अद्वितीय पहचान संख्या के साथ प्रत्येक मास्टर प्लेट प्रदान. एक छह अंकों डिजाइनर के पहले अक्षर के बाद की तारीख अक्सर उद्देश्य (MMDDYYinitial) में कार्य करता है. क्योंकि अच्छी तरह मात्रा छोटे हैं, प्रोटीन aliquots कुशलता से इस्तेमाल किया जा सकता है दोहराने प्लेटों की एक बड़ी संख्या उत्पन्न. यह सिफारिश की है कि मास्टर प्लेटों -80 डिग्री सेल्सियस और प्रत्येक मास्टर थाली कोई दो से अधिक फ्रीज पिघलना चक्र से गुजरना चाहिए संग्रहित कर रहे हैं.
3. MEArray मुद्रण
- MEArrays सबसे पारंपरिक मुद्रण माइक्रोएरे रोबोट के साथ मुद्रित किया जा सकता है. कलम पिन प्रिंटर है कि या तो सिलिकॉन या स्टेनलेस स्टील पिन का उपयोग अच्छी तरह से काम करते हैं, लेकिन प्रोटीन चिपचिपापन समस्याग्रस्त किया जा सकता है. केशिका प्रिंटर इस आवेदन के लिए आदर्श मुद्रण माइक्रोएरे रोबोट हैं, क्योंकि वे कामचिपचिपा प्रोटीन समाधान के साथ अच्छी तरह से.
- एक सरणी के भीतर अच्छा सांख्यिकीय शक्ति प्राप्त करने के लिए 10 से 12 प्रत्येक microenvironment के दोहराने स्पॉट की सिफारिश की है. इस तरह की एक डिजाइन एक ही सरल टी परीक्षण आँकड़ों का उपयोग सरणी में एक रिश्तेदार microenvironment में गतिविधि की तुलना की अनुमति देगा. Dunnette परीक्षण अन्य microenvironments के साथ एक नियंत्रण वातावरण में गतिविधि की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस डिजाइन सबसे अच्छा काम करता है जब एक कार्यात्मक phenotype MEArray प्रयोगों प्रदर्शन से पहले किया गया है नियंत्रण microenvironment के साथ जुड़े.
- आर्द्रता 50% के आसपास बनाए रखा जाना चाहिए. आर्द्रता नियंत्रण के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि एक कम नमी पिंस अंदर या मास्टर मुद्रण substrata पर अक्षम बयान के कारण थाली के कुओं में समाधान शुष्क कर सकते हैं. आर्द्रता गैर झरझरा प्लास्टिक की चादर के साथ रोबोट draping और दोनों एक humidifier और एक de-humidifier के लिए 50% की नमी बनाए रखने के लिए सेट का उपयोग प्रभावी ढंग से नियंत्रित किया जा सकता है. ठंडा मुद्रण plattens usef हो सकता हैकुछ प्रोटीन के संरक्षण के लिए उल, लेकिन सावधानी के लिए स्लाइड पर बनाने से संक्षेपण से बचने के लिए लिया जाना चाहिए.
- प्रत्येक मुद्रित सरणी फ्रीजर प्रूफ स्लाइड एक सीरियल नंबर है कि मास्टर प्लेट पहचानकर्ता के बाद तीन अंकों की संख्या (MMDDYYinitial nnn) होते हैं साथ इनकोडिंग लेबल के साथ लेबल किया जाना चाहिए. हर सरणी के रूप में इस्तेमाल किया है या वितरित किया जाता है, उनके प्रयोगात्मक उपचार के विवरण एक डेटाबेस में रखा जाना चाहिए. छपाई की तिथियाँ और फ्रीज पिघलना चक्र का मास्टर प्लेटों की संख्या ट्रैकिंग reproducibility को बनाए रखने के लिए इष्टतम स्थितियों की पहचान में मदद मिलेगी.
- सील स्लाइड बक्से में मुद्रित MEArrays -20 डिग्री सेल्सियस पर कोई एक से अधिक महीने के लिए भंडारित किया जाना चाहिए. Reproducibility ज़ाहिर उसके बाद गिरावट आती है.
4. कार्यात्मक विश्लेषण लिए MEArrays पर संवर्धन स्तनधारी कोशिकाओं
- संस्कृति कक्षों संलग्न करें: मीडिया और सेल आवश्यक संस्कृति की MEArrays पर संख्या की मात्रा को सीमित करने के लिए, एक प्लास्टिक कक्ष चitted मुद्रित सरणी के चारों ओर करने के लिए. कई arrays के लिए एक दो - कक्ष (Nunc) स्लाइड है कि 4.2 2 सेमी का एक क्षेत्र शामिल से एक एकल कक्ष का इस्तेमाल किया जा सकता है. निर्मित चैम्बर स्लाइड से कक्षों निकालें और एक रेजर ब्लेड के साथ आधे में कक्षों में कटौती. एक 3 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करने के लिए एक और एक MEArray की सतह पर चैम्बर प्रेस के किनारे करने के लिए मछलीघर सिलिकॉन की एक पतली मनका (डीएपी) लागू करने के लिए. सरणी सुविधाओं पर लागू मछलीघर सिलिकॉन कक्ष रखने से बचें.
- अवरुद्ध और rinsing: MEArrays करने के लिए अच्छी तरह से rinsed unreacted monomers, जो कोशिकाओं को विषाक्त हो सकता है को दूर करने की जरूरत है. PDMS - लेपित स्लाइड्स का इस्तेमाल कर रहे थे, तो मुद्रित सुविधाओं के बीच में क्षेत्रों 1 करने के लिए एक गैर - दूषण कोशिका आसंजन को रोकने के कोटिंग के साथ अवरुद्ध हो की जरूरत है, पानी में 1% F108 (BASF) Pluronic या 2% में BSA में arrays सेते हैं वैक्यूम के अंतर्गत 15 मिनट के लिए पानी. पीए जेल स्लाइड अवरुद्ध कदम की आवश्यकता नहीं है. सभी मामलों में, पांच मिनट के लिए सरणियों सेल संस्कृति मीडिया के साथ तीन बार कुल्ला (मीडिया पसंद निर्भर करता हैइस्तेमाल किया कोशिकाओं पर है, लेकिन मीडिया या कोशिकाओं के चाहे एंटीबायोटिक दवाओं के इस्तेमाल की सिफारिश की है). पीए जैल मीडिया में अतिरिक्त 30 मिनट ऊष्मायन जेल rehydrate की आवश्यकता होती है.
- सेल लगाव: चार से पांच arrays एक एकल 15 सेमी बाँझ पेट्री डिश के अंदर फिट कर सकते हैं. Arrays बाँझ रखने के लिए एक ढक्कन के साथ कवर पेट्री डिश. मीडिया में कोशिकाओं को 10,000 से 1,000,000 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता जोड़कर MEArray अंतिम मीडिया की मात्रा का आधा जोड़ें. प्रकोष्ठों सुविधाओं अलग मुद्रित microenvironment की संरचना के आधार पर दरों पर मुद्रित करने के लिए देते हैं जाएगा. 15 से 20 मिनट के अंतराल में एक औंधा चरण माइक्रोस्कोप के माध्यम से arrays को देखने के द्वारा वर्दी लगाव के लिए जाँच करें. धीरे MEArrays झटकों से आगे और पीछे, एक नमूनों तरीके में संलग्न कोशिकाओं अस्थायी, स्वाधीन कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.
- अनबाउंड कोशिकाओं के निकालना: पीए लेपित MEArrays पर, अनबाउंड कोशिकाओं और aspirated जा सकता मीडिया एक उचित मात्रा के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है. पी परडीएमएस लेपित MEArrays, मीडिया पूरी तरह से अच्छी तरह से हटा दिया है कभी नहीं हो सकता है क्योंकि कोशिकाओं को बाहर सूखी और लगभग तुरंत मर सकते हैं. PDMS लेपित MEArrays पर इस प्रकार, अनबाउंड कोशिकाओं मीडिया की मात्रा के आधे के लगातार आदान - प्रदान की एक प्रक्रिया से हटा दिया जाना चाहिए जब तक किसी भी अबाध कोशिकाओं को निकाल रहे हैं, के रूप में सूक्ष्म निरीक्षण द्वारा निर्धारित है. de-गीला PDMS के प्रभाव कम प्रमुख है जब सीरम युक्त मीडिया परिभाषित मीडिया की तुलना में प्रयोग किया जाता है, और जब BSA unprinted F108 Pluronics तुलना क्षेत्रों को ब्लॉक करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- कोशिकाओं सामान्य मीडिया परिवर्तन के साथ कई दिनों के लिए 15 सेमी के पेट्री डिश के अंदर रखा MEArrays पर संवर्धित किया जा सकता है. PDMS स्लाइड पर मीडिया परिवर्तन मीडिया मात्रा के आधे के लगातार परिवर्तन के साथ किया जाना चाहिए.
- Paraformaldehyde मेथनॉल और / एसीटोन के रूप में आम fixatives,, MEArray सिस्टम के साथ संगत कर रहे हैं. जब पीए लेपित MEArrays पर कोशिकाओं धुंधला, fixatives और जोड़ा जा सकता है धुल बस के रूप में वे एक पारंपरिक धुंधला हो जाना प्रक्रिया में होगा.हालांकि जब PDMS लेपित MEArrays पर कोशिकाओं धुंधला, सतह निर्धारण के दौरान भी गीला रहना चाहिए. मीडिया के आधे Aspirate और एक बंधक के साथ बदलें. दोहराएँ प्रक्रिया लगानेवाला के बहुमत के साथ कुछ समय तक अच्छी तरह से भरा है. निर्धारण के बाद, धीरे - धीरे लगानेवाला अवरुद्ध बफर के साथ एक ही तरीके है कि विश्लेषण के अगले कदम के लिए उपयुक्त है में बदल दिया है.
- Immunostaining सामान्यतः सेलुलर कार्यों का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. धुंधला दिनचर्या भिन्न हो सकते हैं, लेकिन जब PDMS MEArrays पर काम कर, एक की जरूरत है हर धोने और इसके बाद के संस्करण के रूप में कदम आकांक्षा का प्रदर्शन करने के लिए, धीरे - धीरे समाधान को बदलने और de-गीला सतह की अनुमति कभी नहीं. De गीला धुंधला हो जाना में कलाकृतियों का कारण होगा.
- कक्षों एक धार की सहायता से हटाया जा सकता है. Coverslips दाग Fluoromount जी (दक्षिणी बायोटेक) का उपयोग MEArrays के शीर्ष पर रखा जा सकता है. पता लगाने के सबसे बहुरंगा प्रतिदीप्ति माइक्रोएरे स्कैनर के साथ या मोटर चालित साथ confocal सूक्ष्मदर्शी पर किया जा सकता हैटाइल छवि अधिग्रहण मोड.
5. प्रतिनिधि परिणाम
नमूनों प्रोटीन बयान का एक उदाहरण पर एक मुद्रित PDMS coasted MEArray एक वर्ग इत्तला दे दी एक कलम पिन रोबोट माइक्रोएरे मुद्रण पर सिलिकॉन पिंस चित्रा 2 में दिखाया का उपयोग. विभिन्न प्रोटीन है कि मुद्रित कर रहे हैं के बयान immunofluorescence एंटीबॉडी का उपयोग (2 चित्रा) द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. मास्टर थाली में प्रोटीन समाधान के dilutions (फ्लोरोसेंट तीव्रता) राशि है कि मुद्रण substrata सतह (चित्रा 2B) पर जमा है प्रतिबिंबित करता है. सेल एक स्पष्ट नमूनों ढंग (चित्रा 2C) में मुद्रित सुविधाओं के लिए संलग्न करना चाहिए.
एक MEArray दिखा रहा है कि दो microenvironment प्रोटीन की व्युत्क्रम dilutions एक मानव multipotent स्तन उपकला पी में एक प्रोटीन एकाग्रता पर निर्भर ढंग विशिष्ट केरातिन अभिव्यक्ति प्रोफाइल हासिल प्रयोग का एक उदाहरणrogenitor सेल (D920 कोशिकाओं) लाइन, चित्रा 3 में दिखाया गया है. बुलबुला भूखंडों को निर्धारित करने के लिए कि क्या विशिष्ट phenotypes दोहराने सुविधाओं पर एक कमजोर पड़ने श्रृंखला के कोशिकाओं पर लागू कर रहे हैं के लिए उपयोगी होते हैं. उदाहरण के लिए, अगर एक microenvironment में एक विशेष अणु एक अलग phenotype का कारण बनता है, एक बार शिक्षाप्रद घटक phenotype परिवर्तन या गायब हो जाना चाहिए एक तटस्थ ECM की पृष्ठभूमि में किया गया है पर्याप्त पतला. केरातिन 8 और केरातिन 14 मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन की इम्यूनोफ्लोरेसेंस पता लगाने के एक अक्षतंतु 4200a (आणविक उपकरणों) माइक्रोएरे स्कैनर के साथ प्रदर्शन किया गया था. बारह दोहराने कमजोर पड़ने श्रृंखला प्रत्येक MEArray पर मुद्रित किया गया है, और लॉग 2 8 केरातिन केरातिन 14 अनुपात मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता एक बुलबुला साजिश के रूप में रेखांकन किया गया था करने के लिए संकेत की भिन्नता और reproducibility के एक यथार्थवादी विचार दे. दिखाया एक MEArray है कि कोशिकाओं के बाद संलग्न था और अबाध कोशिकाओं को दूर धोया गया (चित्रा 3A) तय की गई थी से डेटा है, और cultu के 24 घंटे के बादपुनः (3B चित्रा). इस अपेक्षाकृत छोटे विश्लेषण के लिए एक तरह से एनोवा प्रत्येक समय बिंदु पर मतलब संकेत से विचरण का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और समूहीकृत दो पूंछ टी परीक्षण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि क्या प्रकार के विभिन्न I कोलेजन और पुनः संयोजक मानव पी dilutions cadherin केरातिन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का कारण बना. लगाव के बाद सिर्फ सुविधाओं पर कोशिकाओं के बीच माध्य से कोई बदलाव किया गया था, लेकिन वहाँ अलग microenvironments के लिए जोखिम के 24 घंटे के बाद केरातिन अभिव्यक्ति में कोशिकाओं के बीच महत्वपूर्ण मतभेद थे. टी परीक्षण सत्यापित है कि उच्च प्रकार मैं कोलेजन सांद्रता उच्च केरातिन 8 अभिव्यक्ति हासिल है, जबकि उच्च पी cadherin सांद्रता के 24 घंटे के बाद एक मजबूत केरातिन 14 संकेत हासिल. यह परिणाम पिछली रिपोर्टों के साथ संगत है कि पी cadherin युक्त microenvironments K14 व्यक्त myoepithelial phenotype के द्वि - शक्तिशाली स्तन पूर्वज 4 कोशिकाओं पर लागू होगा.
एक पूरे scanne का एक उदाहरणघ एक 40,000 पा पा जेल पर मुद्रित MEArray 4 चित्र में दिखाया गया है.
चित्रा 1 MEArray प्रक्रिया के एक प्रवाह चार्ट. सबसे पहले, मुद्रण substrata या तो PDMS या पीए के साथ तैयार हैं. दूसरा, गुरु प्लेटें एक डेटाबेस में तैयार कर रहे हैं और एनोटेट. तीसरा, MEArrays मुद्रित और सीरियल नंबर के साथ इनकोडिंग. चौथा, संस्कृति कक्षों जुड़े होते हैं, सतहों, ब्लॉक और / या rinsed, तो कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति दी जाती है और अबाध कोशिकाओं धुल रहे हैं. पांचवां, कोशिकाओं ऊष्मायन की अवधि के बाद प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर धुंधला हो जाना या जैव - परख के साथ इलाज किया जा सकता है. अंत में, MEArray की छवियाँ और प्राप्त किया जा सकता है उपयुक्त स्कैनर और सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया.
चित्रा 2 depos.मुद्रित प्रोटीन की ition और रिश्तेदार बहुतायत सेल लगाव पहले immunostaining के साथ सत्यापित किया जा सकता है. ए) एंटीबॉडी कि प्रकार चतुर्थ कोलेजन को मान्यता दी है और laminin-111 एक MEArray की मुद्रित सुविधाओं में उनकी उपस्थिति को जांचने के लिए इस्तेमाल किया गया. बी) के एक औसत NIH ImageJ सॉफ्टवेयर, dilutions की एक श्रृंखला, एक 200 छ / मिलीलीटर प्रोटीन समाधान से शुरू में दो प्रोटीन के रिश्तेदार बहुतायत में पिक्सेल तीव्रता विश्लेषण सुविधा का उपयोग, गुणात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है. सी) D920 मुद्रित PDMS लेपित MEArray के वर्ग के आकार सुविधाओं के लिए जुड़ी कोशिकाओं के चरण माइक्रोग्राफ.
चित्रा 3. एक MEArray समय और microenvironment के एक कार्य के रूप में एक multipotent पूर्वपुस्र्ष सेल लाइन में केरातिन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का उपयोग विश्लेषण का एक उदाहरण है. प्रत्येक बुलबुला 8 केरातिन और केरातिन के अनुपात 10-15 एक fea जुड़ी कोशिकाओं से 14 प्रोटीन के स्तर का प्रतिनिधित्व करता हैएक MEArray में ture. अभिव्यक्ति immunofluorescent जांच के साथ निर्धारित किया गया था. ए) लगाव के बाद बस कोशिकाओं में केरातिन अनुपात से पता चलता है, और बी) एक सरणी कि समानांतर में चढ़ाया गया था पर 24 घंटे के बाद केरातिन अनुपात से पता चलता है. दोनों प्रोटीन की अधिकतम एकाग्रता 200 छ / मिलीलीटर और 2 गुना पतला था. एक बुलबुले के व्यास केरातिन 8 और केरातिन 14 मतलब तीव्रता लॉग 2 अनुपात की भयावहता का प्रतिनिधित्व करता है, और नारंगी और सफेद रंग कोडिंग> 0 और 0 <मूल्यों को दर्शाता है, क्रमशः. एक तरह से एनोवा और पी टी, परीक्षण और तीर के साथ तुलना में आबादी की पहचान कोष्ठक से मूल्यों के लिए F-मूल्यों, दिखाए जाते हैं.
चित्रा 4. एक MEArray स्कैन का एक उदाहरण एक confocal खुर्दबीन स्कैनिंग लेजर पर एक टाइलों अधिग्रहण मोड का उपयोग कर हासिल कर ली. HCC1569 कोशिकाओं हम 4 घंटा पूर्व निर्धारण के के लिए डीएनए अनुरूप edu शामिल की अनुमति दी.(नीला) DAPI और edu (लाल) दिखाए जाते हैं.
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Discussion
MEArray यहाँ प्रस्तुत विधि सेल और मिश्रित microenvironment बातचीत 4 के कार्यात्मक विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. इस MEArray विश्लेषण बुनियादी micropatterning प्रौद्योगिकियों, कोशिका जीव विज्ञान, और मुद्रण माइक्रोएरे रोबोट और विश्लेषण उपकरणों है कि कई बहुउपयोगकर्ता सुविधाओं में उपलब्ध हैं के प्रयोग को जोड़ती है. MEArray स्क्रीन सबसे पक्षपाती सेल प्रकार के साथ संगत कर रहे हैं, हालांकि सीरम मुक्त मीडिया योगों के लिए कुछ मामलों में समायोजित करने की आवश्यकता BSA या <1% सीरम, जो लगाव में सुधार कर सकते हैं शामिल हो सकते हैं. इस पद्धति का एक दिया सेलुलर समारोह का विश्लेषण करने के लिए अभिकर्मकों की उपलब्धता सीमित है, प्रतिदीप्ति आधारित assays सरणी आधारित सबसे इमेजिंग सिस्टम के साथ संगत कर रहे हैं, लेकिन वर्णमिति assays भी अच्छी तरह से काम कर सकते हैं. इस विधि के अन्य रूपों में मौजूद है और सामान्य से विचार है कि जटिल microenvironments कार्यात्मक प्रकट करने के लिए क्या भूमिका व्यक्तिगत microenvironment अणु और संयोजन क्या है सेल समारोह की एक किस्म में खेलने dissected कर सकते हैं समर्थन8,9 माहौल.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
एमएल एनआईए (R00AG033176 और R01AG040081) और प्रयोगशाला के निर्देश के अनुसंधान और विकास, अमेरिका डे AC02 - 05CH11231 # ऊर्जा अनुबंध की विभाग द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slides 25 mm x 75 mm | VWR | 48311-600 | |
| Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm | VWR | 48393-241 | |
| Staining dish (or Coplan jar) | VWR | 25461-003 | |
| Petri dishes (15 cm) | BD Falcon | 351058 | |
| NaOH (1.0N) | Sigma-Aldrich | S2567 | |
| APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G7651 | 50% in water |
| APS (>98% Ammonium Persulfate) | Sigma-Aldrich | A3678 | Prepare 10% working solution with ddH2O |
| TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Acrylamide (40%) | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| Bis-Acrylamide (2% w/v) | Fisher BioReagents | BP1404-250 | |
| 0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon | Nalgene | 176-0045 | |
| FITC | Sigma-Aldrich | F4274 | |
| PDMS (polydimethylsiloxane) | Dow Corning | 3097358-1004 | Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives |
| 2-chamber slides | NUNC | 177380 | |
| Pluronic F108 | BASF | 30089186 | |
| Aquarium sealant | Dow Corning | DAP 00688 | |
| Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Disposable plastic cups | |||
| Tongue depressors | |||
| Nitrile gloves | |||
| Plastic microscope slide boxes | |||
| Spin coater | WS-400B-6NPP/LITE | Laurell Technologies Corporation | |
| Oven | |||
| Digital hotplate | |||
| 384-well plates | A brand appropriate for the microarray robot | ||
| Microarray printing robot | |||
| Inverted phase and fluorescence microscope | |||
| Axon microarray scanners | Molecular Devices | Multiple configurations exist |
References
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