Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Fabrikasjon og bruk av mikromiljøet microarrays (MEArrays)

Published: October 11, 2012 doi: 10.3791/4152

Summary

En kombinatoriske funksjonell screening metode for å få innsikt i konsekvensene av den molekylære sammensetningen av microenvironments på cellulære funksjoner er beskrevet. Metoden utnytter eksisterende microarray-baserte teknologier for å generere matriser med definerte kombinatoriske microenvironments som støtter celleadhesjon og funksjonell analyse.

Abstract

Samspillet mellom cellene og deres omkringliggende mikromiljøet har funksjonelle konsekvenser for mobilnettet atferd. På enkelt celle nivå, kan distinkte microenvironments pålegge differensiering, migrering og spredning fenotyper, og på vev nivå mikromiljøet behandler like kompleks som morphogenesis og tumorigenesis en. Ikke bare gjør cellen og molekylære innhold microenvironments tyngre cellene innenfor, men det gjør elastisiteten 2 og geometri 3 av vevet. Definert som summen totalt celle-celle,-ECM og-oppløselige faktor interaksjoner, i tillegg til fysiske egenskaper, er mikromiljøet kompleks. De fenotyper av celler innenfor et vev er delvis på grunn av deres innhold genomisk og delvis grunnet de kombinatoriske interaksjoner med microenviroment. En stor utfordring er å knytte spesifikke kombinasjoner av microenvironmental komponenter med karakteristiske atferd.

ent "> Her presenterer vi mikromiljøet microarray (MEArray) plattform for celle-baserte funksjonell screening av interaksjoner med kombinatoriske microenvironments 4. Metoden gir mulighet for samtidig betjening av den molekylære sammensetningen og elastisitetsmodul, og kombinerer bruk av allment tilgjengelig microarray og micropatterning teknologier. MEArray skjermer krever så få som 10.000 celler per array, noe som letter funksjonelle studier av sjeldne celletyper som voksne stamceller. En begrensning av teknologien er at hele vev microenvironments kan ikke være helt rekapitulert på MEArrays. Men sammenligning av responser i samme celletype til en rekke relaterte microenvironments, for eksempel parvise kombinasjoner av ECM proteiner som karakteriserer en gitt vev, vil gi innsikt i hvordan microenvironmental komponenter lokke fram vevsspesifikke funksjonelle fenotyper.

MEArrays kan skrives ved hjelp av et bredt utvalg av rekombinant growth faktorer, cytokiner, og renset ECM proteiner, og kombinasjoner derav. Plattformen er bare begrenset av tilgjengeligheten av spesifikke reagenser. MEArrays er mottagelig for tid-lapsed analyse, men oftest brukes til fastsat analyser av cellulære funksjoner som er målbare med fluorescerende prober. For eksempel, er DNA-syntese, apoptose, oppkjøp av differensierte stater, eller produksjon av spesifikke genprodukter vanligvis målt. Kort, er den grunnleggende flyt av en MEArray eksperiment for å forberede lysbilder belagt med utskrift undergrunn og å forberede master plate av proteiner som skal skrives ut. Da arrays skrives ut med en microarray robot, er celler lov til å feste, vokse i kultur, og deretter er kjemisk festet på nå eksperimentelle endepunkt. Fluorescerende eller kolorimetrisk analyser, fotografert med tradisjonelle mikroskop eller microarray skannere, brukes til å avsløre relevante molekylære og cellulære fenotyper (figur 1).

Protocol

1. Utskrift Substrata Forberedelse

Avgjørelsen om å bruke polydimetylsiloksan (PDMS)-belagte eller polyakrylamid (PA)-belagte objektglass avhenger viktige parametere for eksperimentell design. Elastisitetsmodulen av begge polymerer kan være innstilt til å etterligne stivhetene av forskjellige vev ved å endre basen / kur forholdet PDMS, og akrylamid / bis-akrylamid-forhold av PA. PDMS kan etterligne stivere vev i området 1-10MPa (f.eks brusk, hornhinne og arterieveggene) og PA kan etterligne mykere vev i størrelsesorden 100 Pa-100kPa (f.eks bryst, hjerne, lever, og prostata) 5. PDMS er billig, lett å tilberede, og geometrien av de trykte funksjoner vil være identisk med lederen for utskrift pins. Dermed størrelsen og formen av funksjonene kan kontrolleres nøyaktig ved hjelp av pinner med forskjellige tips geometrier. PDMS er mer hydrofob enn PA, noe som fører til noen utfordringer i cellen håndtering og immunosopprettholde trinnene, og kan være inkompatibel med noen cellelinjer. Fordi PA er en hydrogel og en innfødt ikke-groe overflaten, vil celler bare legge til steder hvor det er proteiner som støtter celleadhesjon. Geometrien av de trykte funksjonene på PA gels ikke presist følger geometrien i knappenålshode, vanligvis blir de sirkler på grunn diffusjon, uavhengig av knappenålshode geometri som er brukt. Skrive ut kontakttid og pin diameter parametre kan empirisk bestemt for optimal funksjon størrelse på PA gels.

Polydimetylsiloksan (PDMS)

  1. I en engangs plastkopp kombinere Sylgard 184 silikonelastomer base med herder i forholdet 10:1, bland kraftig med en tre eller plast tungen depressor deretter Degas i en romtemperatur vakuum bell i 30 min.
  2. Oss en standard objektglass på vakuum aktuerte chuck av en spin belegningsinnretning, deretter duskregn 0,5 ml av den blandede elastomer polymer på midten av glideflate. Spinne på6000 rpm i 60 sek.
  3. Kurere PDMS-belagte lysbilder i en 70 ° C ovnen eller på en digital kokeplate (beskyttet mot støv) for 4 timer til over natten.
  4. Herdet lysbilder kan brukes umiddelbart, eller lagres i flere måneder i et lysbilde boks som er forseglet i en plastpose Ziploc pose og holdt i en skuff. Den PDMS tiltrekker seg støv, så det må være godt beskyttet mot rommet luftsirkulasjon.
  5. Merk: Nitril eller andre ikke-latex hansker må brukes når du arbeider med PDMS elastomer kit. Tilfeldig kontakt med latekshansker vil hemme PDMS polymerisasjon.

Polyakrylamid (PA)

  1. NaOH etsing: Plasser lysbilder på varme blokk ved 80 ° C. Tilsett 1 ml 0,1 N NaOH på hvert lysbilde, og pass på å dekke hele lysbildet overflaten. La NaOH fordampe (en hvit film bør danne på lysbildet overflaten). Siden PA gel kan bare legge fast på NaOH etset overflater, vil PA gel løsne under tørking ut trinnet hvis hele lysbildet surfeess er ikke omfattet av NaOH. Hvis glideflate ikke ble fullstendig dekket, gjenta ved tilsetning av 1 ml 0,1 N NaOH. Lysbilder kan så lagres ved romtemperatur (RT) i flere dager. Merk: Et alternativ til NaOH etsning er for ozon-eller plasma-clean lysbildene.
  2. 3-aminopropyltrietoksysilan (APES) belegg: I en avtrekkshette, sted lysbilder i en 15 ml parabol, og legge 300 ul APES på hver NaOH etset lysbilde. La APES reagere med NaOH glir i 5 min. Overskridelse av denne tiden vil føre til vanskeligheter med å vaske ut ureagert APES reagens. Vaske ut APES grundig med avionisert vann to til tre ganger på begge sider av lysbildene. Dersom tøyet er ikke fullført, vil APES bli oksidert av Glutaraldehyde å danne en brun innskudd på lysbilder i trinn 1.8.
  3. Glutaraldehyd oksidasjon: Aspirer alle løsningene fra sklieflate. I hvert 15 cm tallerken, tilsett 25 ml 0,5% glutaraldehyd i PBS. Reagere i 30 minutter i et mørkt område. Etter 30 min, aspirer all glutaraldehyd og bruke ikke-lint arbeidskraftatory kluter (f.eks Kimwipes) å nøye tørke lysbildene. Lysbilder kan så lagres ved romtemperatur i opptil en dag.
  4. Gel preparatet: Etter å forberede PA blandinger inkludert akrylamid, bis-akrylamid og DDH 2 O i henhold til tabellen nedenfor, Degas i 30 min, og deretter plassere PA blandinger på isen for å bremse ned polymerisasjon. Legg APS og TEMED og bland godt rett før du gjør gels. Pipet PA blandinger bort på de glideflatene og sted 24 mm x 50 mm, nummer 1 dekkglass på toppen av PA. Unngå å trykke dekkglass og glass lysbilde sammen og unngå bobledannelse. For gels> 40000 Pa bruke 100 ul, for andre gels bruke 350 ul.
Ønsket modulus (Pa) Akrylamid% Bis-akrylamid% Akrylamid fra 40% lager (ml) Bis-Akrylamid fra 2% lager (ml) Deionisert vann (ml) APS (ul) TEMED (ul)
480 ± 160 3 0,06 0,75 0.3 8,95 100 10
4470 ± 1190 5 0,15 1,25 0,75 8 100 10
40400 ± 2390 8 0,48 2 2.4 5.6 100 10

Tilpasset fra 6,7.

  1. La PA gel polymerisering i 2 timer, og deretter fjerne dekkglass etter avionisert vann.
  2. Vask PA gel lysbilder i store Coplan krukker i vann over natten (~ 8 timer) for å fjerne ureagerte akrylamid.
  3. Tørre lysbilder i en 37 ° C ovn for 2-4 hr eller inntil PA gel stivner helt.
  4. PA gel-lysbilder kan lagres ved 4 ° C i en måned i en forseglet lysbilde boksen.

2. Protein Master Plate Forberedelse

  1. Alle proteiner should bli alikvoteres i bestander av 10X løsninger i bufferne anbefalt av leverandør og lagret ved -80 ° C. Fleste ECM proteiner er løselig i deionisert vann, men pH kan være nødvendig å justere med dråper eddiksyre. De fleste vekstfaktorer, cytokiner, og rekombinante reseptor ekstracellulære domener er utarbeidet i PBS med BSA, men produsenten vil variere. Filtrere protein alikvoter gjennom en 0,45 um 4-mm nylon sprøytefilter (Nalgene) før lagring.
  2. Utforme en master plate i samsvar med ønskede protein kombinasjoner og fortynninger. Adherente celler vanligvis avhengige av nærvær av minst en kompatibel ECM å mediere celleadhesjon, men antistoff mot celleoverflaten epitopes kan også formidle vedlegg iblant. Det er en god ide å legge fri FITC fargestoff eller en fluorphore-konjugert protein til minst en brønn, slik at matriser kan være lett orientert senere.
  3. Forbered master plate ved å fortynne protein kombinert med utskrift buffer består av 100 mMTris-acetate/20% glycerol/0.05% Triton-100X pH 5,2. Typisk vil hver brønn av en 384-brønners plate ikke inneholder mer enn 10 pl.
  4. Skrive ned innholdet i hver brønn i hver master plate i en tabulatordelt data base fil og gi hver master plate med et unikt identifikasjonsnummer. En seks-sifret dato etterfulgt av designerens initialer serverer ofte formålet (MMDDYYinitial). Fordi brønnvolumer er små, kan protein alikvoter brukes effektivt til å generere et stort antall gjentatte plater. Det anbefales at malplater blir lagret ved -80 ° C, og hver malplate bør gjennomgå mer enn to fryse-tine-sykluser.

3. MEArray Printing

  1. MEArrays kan skrives ut med de fleste konvensjonelle microarray utskrift roboter. Quill pin skrivere som bruker enten silikon eller rustfritt stål pinner fungerer godt, men protein viskositet kan være problematisk. Kapillære skrivere er ideelle microarray utskrift roboter for dette programmet, siden de fungerergodt med væskefylte protein løsninger.
  2. For å oppnå god statistisk styrke i en matrise, er 10 til 12 replikatmålinger flekker av hver mikromiljø anbefales. Slik utforming vil tillate sammenligning av aktivitet i en mikromiljøet forhold til en annen i den samme rekke ved hjelp av enkle T-testobservatorer. Dunnette test kan brukes til å sammenligne aktivitet i en kontroll miljø med andre microenvironments. Denne utformingen fungerer best når en funksjonell fenotype har vært forbundet med kontroll mikromiljøet før du utfører MEArray eksperimenter.
  3. Fuktighet bør opprettholdes rundt 50%. Fuktighet kontroll er viktig fordi en lav luftfuktighet kan tørke løsningen inne pinnene eller i brønnene i malplate forårsaker ineffektiv avsetning på utskrift substratet. Fuktighet kan kontrolleres effektivt ved drapering roboten med ikke-porøst plastfolie og ved bruk av både en luftfukter og en de-luftfukter satt for å opprettholde 50% luftfuktighet. Avkjølt utskrift plattens kan være useful for å bevare noen proteiner, men forsiktighet må tas for å unngå kondens dannes på lysbildene.
  4. Hver utskrevne rekke skal merkes med fryser-proof lysbilde etiketter kodet med et serienummer som består av master plate identifikator etterfulgt av et tresifret tall (MMDDYYinitial-nnn). Som hver matrise brukes eller distribueres, bør detaljer om sine eksperimentelle behandlinger opprettholdes i en database. Sporing datoene for utskrift og antall fryse-tine sykluser av malplater vil bidra til å identifisere de optimale forholdene for å opprettholde reproduserbarhet.
  5. Trykte MEArrays bør lagres i forseglede lysbilde bokser ved -20 ° C for ikke mer enn en måned. Reproduserbarhet avtar merkbart etterpå.

4. Dyrking pattedyrceller på MEArrays for Funksjonell analyse

  1. Fest kultur kamre: For å begrense volumet av media og antall celler kreves kultur på MEArrays, er en plast kammer fitted å omgi den trykte tabellen. For mange matriser, kan et enkelt kammer fra en 2-kammer lysbilde (Nunc) som inneholder et område av 4,2 cm 2 brukes. Fjern kamrene fra det produserte kammer lysbilde og kutte kamrene i halvparten med et barberblad. Bruk en 3 ml sprøyte til å anvende en tynn streng av akvarium silikon (DAP) til kanten av et kammer, og trykk på overflaten av en MEArray. Unngå å plassere brukt akvarium silikon kammer på tabellen funksjoner.
  2. Blokkering og skylling: MEArrays må være godt skylt for å fjerne uomsatte monomerer, som kan være toksiske for cellene. Hvis PDMS-belagte lysbilder ble brukt, da regionene i mellom de trykte trekk først må være blokkert med en ikke-tilgroingsbelegg å forhindre celleadhesjon; Inkuber arrays i 1% Pluronic F108 (BASF) i vann eller 2% BSA i vann i 15 minutter under vakuum. PA gel lysbilder ikke krever en blokkering trinn. I alle tilfeller, skyll matriser med cellekulturmedier tre ganger i fem minutter (media valg avhengerpå de celler som brukes, men bruken av antibiotika er anbefalt uansett media eller celler). PA gels krever ytterligere 30 min inkubasjon i medier å rehydrere gelen.
  3. Celleadhesjon: Fire til fem arrays kan passe på innsiden av en enkelt 15 cm sterile petriskål. Dekk petriskål med et lokk for å holde oppstillingene sterilt. Tilsett halvparten av den endelige medievolumet til MEArray ved å legge cellene i medier til en endelig konsentrasjon på 10.000 til 1.000.000 celler / ml. Celler vil feste til trykte funksjoner på ulike priser avhengig av sammensetningen av den trykte mikromiljøet. Sjekk for uniform vedlegg ved å vise arrays gjennom en omvendt fase mikroskop i 15 til 20 minutters mellomrom. Ved å forsiktig risting MEArrays frem og tilbake, kan cellene fester i en mønstret måte skilles fra de flytende, unattached celler.
  4. Fjerning av ubundne celler: på PA-belagte MEArrays, kan de ikke-bundne cellene suges og media kan erstattes med et passende volum. På PDMS-belagte MEArrays, kan mediet aldri være helt fjernet fra brønnen fordi cellene tørke ut og dø nesten umiddelbart. Dermed på PDMS-belagte MEArrays, må de ikke-bundne cellene fjernes ved en prosess med suksessive utveksling av halvparten av volumet av media til eventuelle ubundne celler fjernet, som bestemt ved mikroskopisk inspeksjon. Den de-fukting effekt PDMS er mindre fremtredende når serum-holdige medier brukes sammenlignet definerte medier, og når BSA brukes til å blokkere de blanke områder sammenlignet med Pluronics F108.
  5. Celler kan dyrkes på MEArrays plassert på innsiden av 15 cm petriskåler for mange dager med normal medier endringer. Media endringer på PDMS lysbilder må gjøres med påfølgende endringer av halvparten av medievolumet.
  6. Vanlige fiksativer som paraformaldehyd og metanol / aceton, er kompatible med MEArray systemer. Når flekker celler på PA-belagte MEArrays kan fiksativ legges til og vasket bort akkurat som de ville være i en konvensjonell farging prosedyre.Men når flekker celler på PDMS-belagte MEArrays må overflaten holdes våte selv under fiksering. Aspirer halvparten av media og erstatte med et bindemiddel. Gjenta prosessen noen ganger inntil brønnen er fylt med et flertall av fikseringsmiddel. Etter fiksering blir fiksativ gradvis erstattet på samme måte med blokkerende buffer som er egnet for det neste trinn av analysen.
  7. Farging er ofte brukt til å analysere cellulære funksjoner. Farging rutiner vil variere, men i arbeidet med PDMS MEArrays, trenger man å utføre hver vask og aspirasjon skritt som ovenfor, gradvis endring løsningene og aldri tillate overflaten de-vått. De-wetting vil føre gjenstander i farging.
  8. Kamrene kan fjernes ved hjelp av et barberblad. Dekkglass kan monteres på toppen av farget MEArrays hjelp Fluoromount-G (Southern Biotech). Deteksjon kan utføres med de fleste flerfarget fluorescens microarray skannere eller på confocal mikroskoper med motorisertflislagt bildetakingsenheter moduser.

5. Representant Resultater

Et eksempel på mønstret protein avsetning på et trykt PDMS-suste MEArray ved hjelp av en firkantet-tipped silisium pins på en fjærpenn pin microarray-utskrift robot er vist i figur 2. Nedfall av ulike proteiner som skrives kan bekreftes av immunofluorescence bruker antistoffer (figur 2A). Fortynninger av proteinoppløsninger i malplate er reflekterende av beløpet (fluorescerende intensitet) som avsettes på trykkteknikker undergrunn overflaten (figur 2B). Cellene skal feste til de trykte funksjoner i en åpenbar mønstret måte (Figur 2C).

Et eksempel på en MEArray eksperiment som viser at inverse fortynninger av to mikromiljøet proteiner fremkalte spesifikke keratin uttrykk profiler i et protein konsentrasjonsavhengig måte i en menneskelig multipotent mammary epitelial progenitor cellelinje (D920 celler), er vist i figur 3.. Boble plott er nyttig for å bestemme hvorvidt bestemte fenotyper er påtvunget celler på replikate funksjonene i en fortynningsserie. For eksempel, hvis en bestemt molekyl i en mikromiljøet forårsaker en distinkt fenotype, når instruktive komponenten har blitt fortynnet nok inn en bakgrunn av et nøytralt ECM fenotypen bør endre eller forsvinne. Immunfluorescens påvisning av keratin 8 og keratin 14 mellomliggende filament proteiner ble utført med en Axon 4200a (Molecular Devices) microarray scanner. Tolv replikere fortynningsserie ble trykt på hvert MEArray, og log 2 forholdet av keratin 8 til keratin 14 bety fluorescensintensitet ble grafisk som en boble plott for å gi et realistisk bilde av variasjon og reproduserbarhet av signalet. Vist er data fra en MEArray som ble løst etter celler hadde festet og bundne celler ble vasket bort (Figur 3A) og etter 24 timer av culture (figur 3B). For denne relativt liten analyse, ble en enveis ANOVA brukes til å bestemme avvik fra midlere signal ved hvert tidspunkt, og gruppert to-tailed t-tester ble brukt til å bestemme hvorvidt de forskjellige fortynninger av type I kollagen og rekombinant humant P- cadherin ført til endringer i keratin uttrykk. Det var ingen variasjon fra gjennomsnittet blant celler på funksjonene like etter vedlegg, men det var signifikante forskjeller i keratin uttrykk blant celler etter 24 timer av eksponering for de forskjellige microenvironments. T-tester bekreftet at høy type I kollagen konsentrasjoner fremkalte høyere keratin 8 uttrykk, mens høye P-cadherin konsentrasjoner fremkalte en sterk keratin 14 signal etter 24 timer. Dette resultatet var konsistent med tidligere rapporter om at P-cadherin-holdige microenvironments vil pålegge av K14-uttrykke myoepithelial fenotype på bi-potente mammary stamceller 4.

Et eksempel på en hel scanned MEArray trykt på en 40.000 Pa PA gel er vist i figur 4.

Figur 1
Figur 1. Et flytskjema av MEArray prosedyren. Først blir utskrift undergrunnen fremstilles enten med PDMS eller PA. Sekund, malplater er forberedt og kommenterte i en database. Tredje, MEArrays trykte og kodet med serienumre. Fjerde, er kultur kamre festet, overflater er blokker og / eller skylles, så cellene har lov til å feste og ubundet celler er vasket bort. Femte, kan cellene behandles med flekker eller bio-assay etter en inkubasjonsperiode basert på eksperimentelle design. Endelig kan Images of MEArray bli innhentet og analysert med egnet skanner og programvare.

Figur 2
Figur 2. Deposition og relativ overflod av trykte proteiner kan verifiseres med farging før celleadhesjon. A) Antistoffer som anerkjente type IV kollagen og laminin-111 ble brukt til å bekrefte sin tilstedeværelse i trykte funksjoner i en MEArray. B) Bruk av en gjennomsnittlig pikselintensiteten analyse funksjonen i NIH ImageJ programvare, den relative overflod av de to proteinene på tvers av en serie av fortynninger, som starter fra en 200 ug / ml protein-løsning, kan kvalitativt vurderes. C) Fase micrograph av D920 celler festet til firkantede funksjoner i en trykt PDMS-belagt MEArray.

Figur 3
Figur 3. Et eksempel på en analyse ved hjelp av endringer MEArray i keratin uttrykk i en multipotent progenitor cellelinje som en funksjon av tid og mikromiljø. Hver boble representerer forholdstall på keratin 8 og keratin 14 proteinnivåer 10-15 celler festet til en featur i en MEArray. Expression ble bestemt med immunofluorescerende prober. A) viser de keratin Nøkkeltall i celler like etter vedlegg, og B) viser de keratin Nøkkeltall Etter 24 timer på en matrise som ble platet i parallell. Den maksimale konsentrasjonen av begge proteiner var 200 ug / ml og fortynnet to ganger. Diameteren på en boble representerer størrelsen av loggen 2 forholdet av keratin 8 og keratin 14 midlere intensitet, og den oransje og hvit fargekoding indikerer verdier> 0 og <0, henholdsvis. F-verdier for enveis ANOVA og P-verdier fra T-tester, og braketter med piler som identifiserer bestander sammenlignet, vises.

Figur 4
Figur 4. Et eksempel på en MEArray scan ervervet ved hjelp av en flislagt oppkjøp modus på en laserskanning confocal mikroskop. HCC1569 celler vi lov til å innlemme DNA analog Edu i 4 timer før fiksering.DAPI (blå) og Edu (rød) vises.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den MEArray metoden presentert her gjør funksjonelle analyser av cellen og kombinatoriske mikromiljøet interaksjoner 4. MEArray analyse kombinerer bruk av grunnleggende micropatterning teknologier, cellebiologi og microarray utskrift roboter og analyse enheter som er tilgjengelige i mange flerbruker anlegg. MEArray skjermer er kompatible med de fleste adherente celletyper, selv serumfrie medier formuleringer kan måtte justeres i noen tilfeller å inkludere BSA eller <1% serum, som kan forbedre vedlegg. Denne metoden er begrenset av tilgjengeligheten av reagenser for å analysere en gitt cellulær funksjon; fluorescens-baserte analyser er kompatible med de fleste array-basert avbildningssystemer, men kolorimetriske analyser kan også fungere godt. Andre variasjoner av denne metoden finnes og støtte den generelle ideen at komplekse microenvironments kan funksjonelt dissekert å avsløre hva roller individuelle mikromiljø molekyler og kombinasjoner derav spiller i en rekke celle funksjoner 8,9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

ML er støttet av NIA (R00AG033176 og R01AG040081) og ved Laboratory Regi Forskning og Utvikling, US Department of Energy kontrakt # DE-AC02-05CH11231.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass slides 25 mm x 75 mm VWR 48311-600
Glass coverslips (no.1) 24 mm x 50 mm VWR 48393-241
Staining dish (or Coplan jar) VWR 25461-003
Petri dishes (15 cm) BD Falcon 351058
NaOH (1.0N) Sigma-Aldrich S2567
APES (>98% (3-Aminopropyl)triethoxysilane) Sigma-Aldrich A3648
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G7651 50% in water
APS (>98% Ammonium Persulfate) Sigma-Aldrich A3678 Prepare 10% working solution with ddH2O
TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine) Sigma-Aldrich T9281
Acrylamide (40%) Sigma-Aldrich A4058
Bis-Acrylamide (2% w/v) Fisher BioReagents BP1404-250
0.45 μm Syringe filter 4-mm nylon Nalgene 176-0045
FITC Sigma-Aldrich F4274
PDMS (polydimethylsiloxane) Dow Corning 3097358-1004 Sylgard 184 Elastomer kit via Ellsworth Adhesives
2-chamber slides NUNC 177380
Pluronic F108 BASF 30089186
Aquarium sealant Dow Corning DAP 00688
Fluormount-G Southern Biotech 0100-01
Disposable plastic cups
Tongue depressors
Nitrile gloves
Plastic microscope slide boxes
Spin coater WS-400B-6NPP/LITE Laurell Technologies Corporation
Oven
Digital hotplate
384-well plates A brand appropriate for the microarray robot
Microarray printing robot
Inverted phase and fluorescence microscope
Axon microarray scanners Molecular Devices Multiple configurations exist

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
  2. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  3. McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).
  4. LaBarge, M. A. Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).
  5. Kim, H. N. Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering. Annals of biomedical engineering. , (2012).
  6. Boudou, T., Ohayon, J., Picart, C., Pettigrew, R. I., Tracqui, P. Nonlinear elastic properties of polyacrylamide gels: implications for quantification of cellular forces. Biorheology. 46, 191-205 (2009).
  7. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology. Chapter 10, Unit 10 (2010).
  8. Flaim, C. J., Chien, S., Bhatia, S. N. An extracellular matrix microarray for probing cellular differentiation. Nat. Methods. 2, 119-125 (2005).
  9. Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments. Mol. Syst. Biol. 2, 37 (2006).

Tags

Molecular Biology biokjemi cellebiologi biofysikk mikromiljøet microarray MEArray funksjonell celle-baserte analysen PDMS cellekultur
Fabrikasjon og bruk av mikromiljøet microarrays (MEArrays)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, C. H., Lee, J. K., LaBarge, M.More

Lin, C. H., Lee, J. K., LaBarge, M. A. Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays). J. Vis. Exp. (68), e4152, doi:10.3791/4152 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter