Summary
Een snelle benadering van interacties en effecten op moleculaire mechanismen van de aanwezigheid van antilichamen in een intracellulaire omgeving onderzoeken beschreven. De werkwijze omvat transfectie van antilichamen in levende cellen met een niet-covalente complexvorming gebaseerd op een lipide formulering. De techniek is toepasbaar voor geïmmortaliseerde cellijnen en primaire cellen.
Abstract
Antilichamen de mogelijkheid om nieuwe inzicht te krijgen in de verschillende evenementen die plaatsvinden in levende systemen. De mogelijkheid om zeer specifieke antistoffen doeleiwitten is toegestaan voor zeer precieze biologische vragen worden aangepakt. Belangrijker is dat antilichamen betrokken bij de pathogenese van een aantal menselijke ziekten zoals systemische lupus erythematosus (SLE), reumatoïde artritis (RA), paraneoplastische syndromen, multiple sclerose (MS) en menselijk T-lymfotroop virus type 1 (HTLV-1) bijbehorende myelopathie / tropische spastische paraparese (HAM / TSP) 1-9. Hoe antilichamen veroorzaken ziekte is een gebied van verder onderzoek, en gegevens suggereren dat de interacties tussen antilichamen en verschillende intracellulaire moleculen resulteert in ontsteking, cellulaire messaging en apoptose 10 veranderd. Het is aangetoond dat patiënten met MS en HAM / TSP auto-antilichamen te produceren voor de intracellulaire RNA bindend eiwit heterogene ribonuclear proteïne A1 (hnRNP A1) 3, 5-7, 9, 11. Recente gegevens wijzen erop dat antilichamen tegen zowel intra-neuronale en oppervlakteantigenen pathogene 3, 5-9, 11. Zo een procedure waarbij voor de studie van intracellulaire antilichamen: eiwit interacties zijn goed inzicht geven in ziekte pathogenese.
Genen worden gewoonlijk getransfecteerd in primaire cellen en cellijnen in cultuur is echter transfectie van antilichamen in cellen gehinderd door verandering van antilichaamstructuur of slechte transfectie-efficiëntie 12. Andere werkwijzen voor transfectie omvatten antilichaam transfectie gebaseerd op kationische liposomen (bestaande uit DOTAP / DOPE) en polyethyleeniminen (PEI), die resulteerden in een tienvoudige afname in antilichaam transfectie in vergelijking met controles 12. De werkwijze uitgevoerd in ons onderzoek is vergelijkbaar met kationische lipidegemedieerde werkwijzen en gebruiken van een lipide-gebaseerd mechanisme niet-covalente complexen met de antilichamen door elektrostatische en hydrophobic interacties 13. We gebruik Ab-DeliverIN reagens, een lipide formulering kan vastleggen antilichamen door niet-covalente elektrostatische en hydrofobe interacties en hen in cellen. Zo chemische en genetische koppelingen zijn niet noodzakelijk voor de levering van functionele antilichamen in levende cellen. Deze methode heeft ons u verschillende antilichaam opsporing en eiwit lokalisatie experimenten, alsmede de analyse van de moleculaire gevolgen van intracellulaire antilichamen: eiwitinteracties 9.
In dit protocol zullen we zien hoe antilichamen transfecteren tot neuronen snel, reproduceerbaar en met een hoge transfectie-efficiëntie. Als voorbeeld zullen we anti-hnRNP A1 en anti-IgG antilichamen. Voor eenvoudige kwantificering van transfectie efficiency we anti-hnRNP A1 antilichamen gemerkt met Atto-550-NHS en FITC-gelabelde IgG. Atto550 NHS is een nieuw label met een hoog moleculair absorptie en quantum yield. Excitatiebron en fluorescerende filters voor Atto550 zijn vergelijkbaar met Cy3 (Ex. 556 Em. 578). Bovendien Atto550 een hoge fotostabiliteit. FITC-gelabelde IgG werden gebruikt als controle om aan te tonen dat deze methode is veelzijdig en niet afhankelijk verven. Deze aanpak en de gegevens die gegenereerd zal helpen bij het begrijpen van de rol die antilichamen tegen intracellulaire doelantigenen zouden kunnen spelen in de pathogenese van ziekten.
Protocol
1. Labeling antilichaam (figuur 1)
- Maak 0,1 M NaHCO3 buffer:
- 8,4 g NaHCO3
- 29,2 g NaCl
- 1 liter H 2 O
- Breng de buffer tot een pH van 8,4 met deze oplossing (10,6 g Na 2 CO 3, 29,2 g NaCl, 1 liter H 2 0).
- Voeg 35 ul Atto550 NHS tot 70 pi anti-hnRNPA1 en 500 ul buffer NaHCO3 en draaien gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Na de een uur durende rotatie, injecteren het mengsel in een kunstnier en overnachting dialyseren in 2 liter PBS.
- De volgende dag concentreren gedialyseerde Atto550 NHS anti-hnRNPA1 met een spin kolom (Amicon Ultra 0,5).
- Na de Atto550 NHS gemerkte anti-hnRNPA1 antilichaam is geconcentreerd, nano-drop monster om de concentratie te bepalen.
2. Transfectie antilichaam (figuur 2)
- Seed 10 5 cellen / putje in 500 ui Dulbecco's Modified Eagle Medium (+10% FBS DMEM/F12 +1% antibioticum) in een 8 ook slide 24 uur voorafgaand aan transfectie. Cell confluentie ten minste 70%.
- Vierentwintig uur na uitzetten, voeg 2 pl Ab-DeliverIN reagens in een Eppendorf buis.
- Voeg vervolgens 2 ug Atto550 NHS gelabeld anti-antilichaam hnRNPA1 (0,5 ug / ul) aan dezelfde Eppendorf buis en incubeer 10-15 minuten bij kamertemperatuur.
- Tijdens de incubatie media zuigen en voeg 394 pl vers DMEM media aan de cellen.
Opmerking: Voeg 500 ul DMEM een kamer van ongerepte cellen als een controle.
- Na incubatie voeg 100 ul DMEM aan het antilichaam mengsel gemengd zijn en neer te pipetteren, en aan de cellen in DMEM voor een totaal volume van 500 ul.
- Wijzig de media na 48 uur van antilichaam levering.
Opmerking: Protocol werd herhaald met FITC gemerkte Rigg als positieve controle.
3. Live en Vaste Imaging om de efficiëntie te bepalen
- Afbeelding cellen live at 48 uur met behulp van de Cy3 filter op een fluorescentiemicroscoop om het imago van de getransfecteerde Atto550 NHS gelabelde antilichamen.
- Na live beeldvorming is voltooid, zuigen de media en fix cellen.
- Na afzuigen media, behandelen cellen met 0,4% paraformaldehyde gedurende 15 min bij kamertemperatuur. Was de cellen 4 x 5 min elk met PBS. Vervolgens monteren cellen met montage media met DAPI reagens en fix dekglaasje aan. Meten transfectie efficiëntie van de gefixeerde cellen met AxioVision software. Als AxioVision software is niet bij de hand, gewoon tellen de gebeurtenissen uit je afbeelding met de hand en steek de stekker resultaten in berekening 3.7. Alternatief kan software worden ImageJ voor deze berekeningen.
- Gebruik eerst de "Gebeurtenissen" meting van het totale aantal cellen tellen in uw beeld van de keuze bij een vergroting van 20x.
- Vervolgens gebruikt u de "Gebeurtenissen" meting aan de cellen die niet meetellensuccesvol getransfecteerde met antilichamen in dezelfde 20x beeld.
- Om de gemeten "Gebeurtenissen" in een Excel-stijl formaat openen, klikt u op "Eigenschappen", klik op de "Meting" tab, en klik om te bekijken "Zoals tabel."
- Tot slot kunt u de volgende berekening om uw transfectie efficiëntie te bepalen door het vergelijken van de twee eerder gemeten gebeurtenissen: ((Totale cellen - niet-getransfecteerde cellen) / Totaal cellen) x 100 = transfectie-efficiëntie.
4. Representatieve resultaten
De live beelden van getransfecteerde (Figuur 3A) ten opzichte van getransfecteerde (Figuur 3B) neuronen blijkt dat de kenmerken van de antilichamen (rood of groen in elke figuur) duidelijk wordt waargenomen in cellen (Figuur 3B, C, D). Na aspiratie en wassen met media antilichamen tussen of aansluitend aan het oppervlak van cellen te verwijderen, gemerkte antilichamen zijn nog aanwezig in neuronen (Figuur 3C, D). Om de transfectie-efficiëntie te berekenen, gebruikt de software AxioVision totale cellen berekenen vergeleken met cellen die niet met succes zijn getransfecteerd. Deze waarden zijn opgenomen in een transfectie-efficiëntie formule om de transfectie-efficiëntie te verkrijgen als percentage van het totale aantal cellen (figuur 4).
Figuur 1. Stroomdiagram van de procedures die worden gebruikt om het etiket antilichamen met de Atto 550 NHS-ester gevolgd door stappen die nodig zijn om de gelabelde antilichamen concentreren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Stroomdiagram van de procedures om gemerkte antilichamen transfecteren in levende cellen in kweek.arge.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Live beelden van de getransfecteerde neuronen 48 uur na transfectie.
Figuur 4. Vaste en gespoeld beelden met gebeurtenissen geteld om transfectie efficiëntie te bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om hypothesen specifieke moleculen en hun expressie testen worden genen en andere vectoren gewoonlijk getransfecteerd in cellen. Het unieke aspect van deze procedure is de mogelijkheid om eenvoudig antilichamen transfecteren in doelcellen. We hebben deze methode in vijf verschillende experimenten elk in duplo. Transfectie efficiëntie resultaten waren vergelijkbaar voor alle experimenten. Belangrijk is dat de methode kan toegang van antilichamen in de cel zonder dat antilichaam structuur of functie. Verder met het gebruik van fluorescentiemicroscopie van levende neuronen kunnen we de transfectie-efficiëntie, die gewoonlijk meer dan 55% vastgesteld. Hierdoor kan men hypothesen rechtstreeks verband met de wisselwerking tussen het antilichaam van belang en zijn intracellulaire target. Hoewel niet hier bestudeerd, Fab fragmenten ook worden gebruikt. Als alternatief kan proeven zodanig worden opgezet dat onderzoeken of het veranderen van kweekomstandigheden zoals het toevoegen van inflammatoire cytokines beïnvloedt expressiof lokalisatie van intracellulaire targets.
Hoe antistoffen zijn gericht intracellulaire antigenen is een doorlopend gebied van onderzoek. Heersende theorie blijkt dat na celbeschadiging, intracellulaire antigenen worden blootgesteld aan de adaptieve immuunrespons, waardoor de vorming van antilichamen aan het doelwitantigeen. De antilichaamreactie hnRNPs in SLE patiënten is een voorbeeld van hoe dit waarschijnlijk optreedt. SLE patiënten maken antilichamen tegen hnRNP P2 en bij apoptose van doelwitcellen, hnRNP P2 wordt getransporteerd naar het celoppervlak waar het beschikbaar is van een autoimmuunreactie 14 genereren. Dit blijkt ook in neurologische ziekte waarbij studies suggereerden dat alleen aan de oppervlakte antigenen op neuronen doelwit zijn van een pathogeen autoimmuunrespons 15, 16. Dit idee wordt nu uitgedaagd. Interessant is dat er nu data suggereren dat antilichamen neuronen in een epitoop specifieke wijze te voeren. Bijvoorbeeld, in autoimmune retinopathie, eennti-enolase antilichamen doorgedrongen neuronen en veranderde de functie van enolase, een cytoplasmatisch glycolytische enzym 17. Verder, in een model van stijve persoon syndroom, anti-amphiphysin antilichamen opgenomen neuronen in vivo, co-gelokaliseerde met presynaptische markers en veranderde GABA afgifte 18. Dit kan worden gerelateerd aan de unieke structuur en functie van neuronen. Studies zoals die hier gepresenteerde deze kwesties, zoals de pathogenese van auto-immuunziekten worden nog steeds bestudeerd en beter begrepen 9.
hnRNP A1 is een intracellulair antigen 5, 9. Daarom hebben we behoefte aan een techniek die ons zou toestaan om te testen of anti-hnRNP A1 antilichamen kunnen bijdragen tot neuronale dysfunctie. Omdat auto-antilichamen tegen hnRNP A1 gevonden in MS en HAM / TSP patiënten 3, 5-7, 9, 11, we anti-hnRNP A1 en controle antilichamen getransfecteerd in neuronen. We bevestigden dat antilichamen de cellen opgenomen en namicroarray analyses (met behulp van zowel controle-IgG en ongerepte neuronen als controle) toonden aan dat genen betrokken bij hnRNP A1-functie zijn veranderd, hetgeen bevestigt dat transfectie niet anti-hnRNP A1 functie 9 te wijzigen. Belangrijker nog microarray analyse toonde een associatie tussen de anti-hnRNP A1 antilichaamreactie met veranderde expressie van spastin, een gen dat wanneer gemuteerd, bootst de klinische fenotype van MS en HAM / TSP patiënten 9. Dit toont dat antilichaam transfectie kunnen worden gebruikt om te testen of antilichamen tegen intracellulaire doelwitten kunnen cellulaire functies veranderen. Dit is nuttig een aantal andere auto-immuunziekten zoals SLE, RA en kanker-gerelateerde paraneoplastische syndromen.
Kortom, de mogelijkheid om op betrouwbare antistoffen transfecteren in levende cellen biedt de mogelijkheid om vragen van antilichaam-functie, antilichaam vragen:. Target interacties en de lokalisatie van doelen in cellen onder normale en ziekte voorwaarden </ P>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door het Bureau van Onderzoek en Ontwikkeling, Medische Research Service, Department of Veterans Affairs. Deze studie werd gefinancierd door een VA Merit Beoordeling Award (voor MCL) en de Universiteit van Tennessee Health Science Center Multiple Sclerose Onderzoek Fonds.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
- Burkhardt, H. Epitope-specific recognition of type II collagen by rheumatoid arthritis antibodies is shared with recognition by antibodies that are arthritogenic in collagen-induced arthritis in the mouse. Arthritis Rheum. 46, 2339-2348 (2002).
- Chester, K. A. Lambert-Eaton syndrome antibodies: reaction with membranes from a small cell lung cancer xenograft. J. Neuroimmunol. 18, 97-104 (1988).
- Lee, S. M. HTLV-1 induced molecular mimicry in neurological disease. Curr. Top Microbiol. Immunol. 29, 125-136 (2005).
- Reeves, W. H. Systemic lupus erythematosus. Antibodies to DNA, DNA-binding proteins, and histones. Rheum. Dis. Clin. North Am. 20, 1-28 (1994).
- Levin, M. C. Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of neurological disease. Nat. Med. 8, 509-513 (2002).
- Lee, S. M. Autoantibodies that recognize functional domains of hnRNPA1 implicate molecular mimicry in the pathogenesis of neurological disease. Neurosci. Lett. 401, 188-193 (2006).
- Kalume, F. Molecular mimicry: cross-reactive antibodies from patients with immune-mediated neurologic disease inhibit neuronal firing. J. Neurosci. Res. 77, 82-89 (2004).
- Levin, M. C. Cross-reactivity between immunodominant human T lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry. J. Infect. Dis. 186, 1514-1517 (2002).
- Lee, S. A potential link between autoimmunity and neurodegeneration in immune-mediated neurological disease. J. Neuroimmunol. 235, 56-69 (2011).
- Smeenk, R. J. Antinuclear antibodies: cause of disease or caused by disease. Rheumatology (Oxford). 39, 581-584 (2000).
- Lee, S. Post-translational glycosylation of target proteins implicate molecular mimicry in the pathogenesis of HTLV-1 associated neurological disease. J. Neuroimmunol. 204, 140-148 (2008).
- Reisinger, H. Serum-free transfection of CHO cells with chemically defined transfection systems and investigation of their potential for transient and stable transfection. Cytotechnology. 60, 115-123 (2009).
- Weill, C. O., Biri, S., Erbacher, P. Cationic lipid-mediated intracellular delivery of antibodies into live cells. Biotechniques. 44, Pvii-Pxi (2008).
- Radic, M. Z. Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein P2 is an autoantibody target in mice deficient for Mer, Axl, and Tyro3 receptor tyrosine kinases. J. Immunol. 176, 68-74 (2006).
- Vincent, A. Successful 'passive transfer' of paraneoplastic stiff person syndrome with antibodies to an intracellular antigen. Brain. 133, 3164-3165 (2010).
- Vincent, A. Stiff, twitchy or wobbly: are GAD antibodies pathogenic. Brain. 131 (Pt 10), 2536-2537 (2008).
- Magrys, A. The role of anti-alpha-enolase autoantibodies in pathogenicity of autoimmune-mediated retinopathy. J. Clin. Immunol. 27, 181-192 (2007).
- Geis, C. Stiff person syndrome-associated autoantibodies to amphiphysin mediate reduced GABAergic inhibition. Brain. 133, 3166-3180 (2010).
