Summary
상호 작용과 세포 내 환경에서 항체의 존재에 관한 분자 메커니즘에 미치는 영향을 조사하기 위해 신속하게 접근 방식이 설명되어 있습니다. 방법은 지질 공식에 따라 비 공유 결합 복잡한 형성을 사용하여 라이브 세포에 항체의 transfection을 포함한다. 기술은 불후의 세포 라인과 기본 셀에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
항체가 생활 시스템에서 일어나는 다양한 이벤트에 소설 통찰력을 얻을 수있는 기능을 제공합니다. 대상 단백질에 매우 구체적인 항체를 생산하는 능력은 해결 될 매우 정확한 생물학적 질문에 사용할 수 있습니다. 중요한 항체는 전신 홍반 루푸스 (SLE), 류마티스 관절염 (RA), paraneoplastic syndromes, 다발성 경화증 (MS)와 인간 T-lymphotropic 바이러스 타입 1 (HTLV-1)를 포함한 인간의 질병의 숫자의 pathogenesis에 연루되어 myelopathy / 열대 경련 paraparesis (햄 / TSP) 1-9 연결된 상태입니다. 항체는 질병이 진행중인 조사의 영역이며, 데이터 항체와 염증의 다양한 세포 내 분자 결과 사이의 상호 작용은 세포 메시징 및 apoptosis 10 변경하는 것이 좋습니다 원인이 방법. 그것은 MS와 햄 / TSP 환자는 세포 내 RNA 결합 단백질 이기종 ribonuclear 단백질에 autoantibodies을 생산하는 것으로 나타되었습니다1월 5일에서 7일까지 (hnRNP A1) 3, 9, 11. 최근 데이터 간 neuronal 및 표면 항원 모두 항체가 병원성 3, 5-9 11아르을 나타냅니다. 따라서, 세포 내 항체의 연구를 위해 할 수있는 절차 : 단백질 상호 작용은 질병 pathogenesis에 큰 통찰력을 부여합니다.
유전자는 일반적으로 기본 세포와 문화에 세포 라인에 transfected 있으며, 세포에 항체의 그러나 transfection이 항체 구조 또는 낮은 transfection 효율을 12 개조에 의해 방해했습니다. transfection의 다른 방법은 양이온 liposomes (DOTAP / 마약으로 구성)과 polyethylenimines (PEI)을 기반으로 항체 transfection을 포함, 컨트롤 12에 비해 항체 transfection의 열 배나 감소로 이어진 둘 다. 우리의 연구에서 수행 한 방법은 양이온 지질로 인한 방법과 유사하고를 통해 항체와 비 공유 결합 복합체를 형성하기 위해 지질 기반 메커니즘을 사용 정전기 및 hydrophobic 상호 작용 13. 우리는 비 공유 결합 정전기와 소수성 상호 작용을 통해 항체를 캡쳐하고 세포 내부를 제공 할 수있는 지질 제제입니다 AB-DeliverIN 시약을 이용. 따라서 화학 및 유전 커플 링은 생활 세포에 기능 항체의 전달에 필요하지 않습니다. 단백질 상호 작용 9 :이 방법은 우리가 다양한 항체는 단백질 현지화 실험뿐만 아니라, 세포 내 항체의 분자 결과의 분석을 추적하고 수행 할 수있게되었습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 빠르게, reproducibly과 transfection 효율의 높은 수준의 뉴런에 항체를 transfect하는 방법을 보여줍니다. 예를 들어, 우리는 반 hnRNP A1 및 안티 IgG 항체를 사용합니다. transfection 효율을 쉽게 정량화를 들어 우리는 아토-550-NHS와 FITC-라벨 IgG으로 표시 방지 hnRNP A1 항체를 사용했습니다. Atto550 NHS는 고분자 흡수 및 양자 순으로 새 레이블연령. 여기 소스와 Atto550에 대한 형광 필터는 Cy3 (예 556 엠. 578)과 비슷합니다. 또한, Atto550 높은 photostability 있습니다. FITC-라벨 IgG는이 방법에 의존 염색 다목적 및 아니라는 것을 보여주기 위해 제어로 사용되었습니다. 이 방법과 생성 된 데이터는 대상 항원을 세포하기 위해 항체 인간 질병의 pathogenesis에서 재생 할 수있는 역할의 이해에 도움이 될 것입니다.
Protocol
1. 항체 라벨 (그림 1)
- 0.1 M NaHCO 3 버퍼를 만들기 :
- 8.4 g NaHCO 3
- 29.2 g NaCl
- 1리터 H 2 O
- 이 솔루션 (10.6 g 오세영 2 CO 3, 29.2 g NaCl, 1리터 H 2 0)과 8.4의 산도에 버퍼를 가져와.
- 70 μl 방지 hnRNPA1 500 μl NaHCO 3 버퍼 35 μl Atto550 NHS를 추가하고 실온에서 1 시간에 회전 할 수 있습니다. 1 시간 긴 회전 후, dialyzer로 혼합물을 주입하고 하루 아침에 PBS 2 리터에 dialyze.
- 다음 날, 스핀 컬럼 (Amicon 울트라 0.5)를 사용하여 안티 - hnRNPA1 dialyzed Atto550 NHS을 집중.
- Atto550 NHS는 반 hnRNPA1 항체가 집중되어 표시 한 후, 나노 드롭 샘플 농도를 결정합니다.
2. 항체 Transfection (그림 2)
- Dulbecc의 씨 10 5 세포 /도 500에 μl이전 transfection로 8도 슬라이드 24 시간의 오의 수정 된 이글 매체 (DMEM/F12 10% FBS 1% 항생제). 셀 confluency는 최소 70 %의합니다.
- 배란 후 24 시간 시딩 후 Eppendorf 튜브에 AB-DeliverIN 시약 2 μl를 추가합니다.
- 다음, 같은 Eppendorf 튜브에 방지 hnRNPA1 항체 분류 Atto550 NHS 2 μg을 (0.5 μg / μl)을 추가하고 RT로 10-15 분 알을 품다.
- 부화하는 동안 미디어를 기음과 세포에 신선한 DMEM 매체 394 μl를 추가합니다.
참고 : 컨트롤 역할을 손길이 닿지 않은 셀 중 하나 챔버에 500 μl DMEM을 추가합니다.
- 부화 후, 항체 혼합물에 DMEM 100 μl를 추가 아래로 pipetting과에 의해 혼합, 500 μl의 총 볼륨 DMEM에있는 셀에 추가 할 수 있습니다.
- 항체 전달의 48 시간 후 미디어를 변경합니다.
참고 : 프로토콜은 FITC 긍정적 인 제어로 rIgG 표시를 반복했다.
3. 효율성을 결정하기 위해 라이브 및 고정 이미징
- 이미지 셀 이미지 transfected Atto550 NHS이라는 항체를 할 수있는 형광 현미경에 Cy3 필터를 사용하여 48 시간에 살고 있습니다.
- 라이브 영상이 완료되면, 미디어 및 수정 전지를 대기음.
- aspirating 미디어 후, 실온에서 15 분에 0.4 %의 Paraformaldehyde과 세포를 취급합니다. 세포에게 4 X 5 분마다 PBS로 씻는다. 그런 다음 DAPI 시약 및 수정 coverslip을 포함 장착 미디어와 세포를 탑재합니다. Axiovision 소프트웨어와 고정 세포의 transfection 효율을 측정합니다. Axiovision 소프트웨어가 손에 없으면, 단순히 3.7에서 계산에 손 플러그 결과하여 이미지에서 이벤트를 계산합니다. 또한, ImageJ 소프트웨어는이 계산에 사용할 수 있습니다.
- 첫째, 20x 확대에 원하는 이미지에 세포의 총 수를 계산하려면 "이벤트"측정을 사용합니다.
- 다음 아니었다 세포 수를 계산하려면 "이벤트"측정을 사용하여성공적으로 동일한 20x 배율 이미지의 항체와 transfected.
- 엑셀 스타일의 형식으로 측정 된 "이벤트"에 액세스하려면 "속성"을 클릭 "측정"탭을 클릭하고 확인을 클릭합니다 "테이블."
- 마지막으로, 두 이전에 측정 이벤트를 비교하여 transfection 효율을 결정하기 위해 다음과 같은 계산을 사용합니다 ((총 세포 - Untransfected 셀) / 총 전지) × 100 = Transfection 효율.
4. 대표 결과
untransfected의 라이브 이미지 (그림 3A)이 transfected (그림 3B) 뉴런에 비해 것은 항체의 라벨이 (각 그림에서 빨간색 또는 녹색) 명확하게 세포 (그림 3B, C, D)에서 관찰되는 알 수있다. 흡인에 따라 사이 항체 또는 세포의 표면에 점착성의를 제거하는 미디어와 세탁기, 표시된 항체는 여전히 뉴런 (그림 3C, D)에 존재한다. transfection 효율을 계산하기 위해 성공적으로 transfected되지 않은 세포에 비해 총 셀을 계산 Axiovision 소프트웨어를 사용합니다. 이 값은 전체 세포의 비율 (그림 4)로 transfection 효율을 확보 할 수있는 transfection 효율 공식을 체결했다.
그림 1. 아토 550 NHS 에스테르와 라벨 항체에 사용되는 절차의 흐름 다이어그램 라벨 항체을 집중하는 데 필요한 단계 다음은. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 문화의 라이브 셀에 표시된 항체를 transfect하는 데 사용되는 절차의 흐름 다이어그램.arge.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. transfected 뉴런 48 시간 다음 transfection의 이미지를 살고 있습니다.
그림 4. transfection 효율을 결정하기 위해 계산 이벤트와 이미지를 수정하고 헹구어.
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Discussion
특정 분자와 표현에 대한 가설을 테스트하기 위해, 유전자 및 기타 벡터는 일반적으로 세포로 transfected 수 있습니다. 이 절차의 독특한 측면은 쉽게 대상 세포에 항체를 transfect 할 수있는 능력입니다. 우리는 5 개의 실험을 중복의 각이 방법을 수행했습니다. Transfection 효율 결과는 모든 실험들과 비슷했다. 중요한 방법은 항체의 구조 나 기능을 변경하지 않고 셀에 항체의 항목을 수 있습니다. 또한, 라이브 뉴런의 형광 현미경의 사용과 함께, 우리는 일반적으로 55%을 초과 transfection 효율을 확인할 수 있습니다. 즉, 하나의 관심과 세포 내 표적의 항체 사이의 상호 작용에 직접 관련된 가설을 테스트 할 수 있습니다. 이곳에서 공부되지 않았지만, 팹 조각도 활용 될 수있다. 또한, 실험 등 염증성 크린 시토 킨을 추가로 문화 조건을 변경하는 expressi에 영향을 미치는 경우 검토하는 설계 할 수또는 세포 내 타겟의 현지화.
항체는 세포 항원을 타겟팅하는 방법을하는 것은 조사의 진행 공간입니다. 일반적인 이론은 세포 상해 따라 세포 항원을 대상 항원에 대한 항체 생산을 허용 적응 면역 반응에 노출되어 있음을 나타냅니다. SLE 환자의 hnRNPs에 대한 항체 반응이 가능성이 발생하는 방법의 예입니다. SLE 환자는 hnRNP의 P2에 항체를하고 면역 반응 14을 생성 할 수있는 곳 대상 세포의 apoptosis에 따라, hnRNP의 P2는 세포 표면으로 이송되어 있습니다. 이 또한 신경 질환에서 보여 줬던,있는 연구가 뉴런에서만 표면 항원은 면역 반응 병원성 15, 16 대상이 될 수 있습니다 것을 제안했습니다. 이 아이디어는 지금 도전을하고 있습니다. 흥미롭게도, 항체가 에피토프 특정 방식으로 뉴런을 입력 할 수있는 제안 이제 데이터가 있습니다. 예를 들어, 면역 성 망막증에nti-enolase 항체는 뉴런을 관통하고 enolase의 기능, 세포질 glycolytic 효소 17 변경. 또한, 고집이 사람 증후군의 모델, 안티 amphiphysin 항체 사전 시냅스 마커 및 변경된 GABA 출시 18 공동 언어, 생체에서 뉴런를 입력했습니다. 이 뉴런의 독특한 구조와 기능에 관한 수 있습니다. 자기 면역 질환의 pathogenesis 공부 할 계속으로 다음과 같은 중요한 문제를 해결 여기에 제시된 것과 같은 연구 더 나은 이해 9.
hnRNP A1은 세포 항원 5, 9입니다. 따라서, 우리는 우리 반 hnRNP A1 항체가 neuronal 부전에 기여 할 수 있는지 여부를 테스트 할 수 있도록 기술을 필요합니다. hnRNP A1에 autoantibodies는 5-7 MS와 햄 / TSP 환자 3, 9, 11에서 발견 되었기 때문에, 우리는 뉴런에 방지 hnRNP A1 및 제어 항체를 transfected. 우리는 항체가 세포를 입력 확인하고 다음microarray 분석은 (제어 IgG 및 컨트롤 등의 훼손되지 않은 뉴런을 모두 사용) 따라서 그 transfection이 안티 hnRNP A1 기능 9 변경하지 않은 확인, hnRNP A1 기능에 관한 그 유전자가 변경되었습니다했다. 중요한 것은, 더 microarray 분석은, spastin, 변이 유전자의 변경된 표현과 반 hnRNP A1 항체 반응 사이의 연관을 보여 주었다 MS와 햄 / TSP 환자 9 임상 표현형을 모방 한 것이 었지요. 이 항체 transfection은 세포 내 표적에 대한 항체가 세포 기능을 변경할 수 있는지 여부를 테스트하는 데 사용할 수 있습니다 것으로 나타났습니다. 여기에는 SLE, RA, 그리고 암 관련 paraneoplastic syndromes와 같은 다른자가 면역 질환의 번호와 유틸리티가 있습니다.
요약하면, 안정적으로 살아있는 세포에 항체를 transfect 할 수있는 능력은 항체 기능, 항체의 질문에 질문 할 수있는 기회 제공. 정상과 질병 상태에서 세포 내 표적 상호 작용과 대상의 국산화를 </ P>
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 연구 개발의 사무실, 의료 연구 서비스, 보훈학과에서 지원됩니다. 이 연구는 VA 공훈 검토 상 (MCL에)와 테네시 건강 과학 센터 다발성 경화증 연구 기금의 대학 재정 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent Microscope AxioObserver A1 | Zeiss | ||
| Axiovision version 4.2 | Zeiss | ||
| Anti-rhnRNPA1 | Abcam | Ab4791 | |
| FITC labeled anti-rIgG | OZ Biosciences | AI20100 | |
| Atto550 NHS ester | Sigma | 92835 | |
| Ab-DeliverIN | OZ Biosciences | AI20100 | |
| DMEM/F12 +10% FBS+1%antibiotics | Gibco | 11320-033 | |
| Poly-D-Lysine 8-well Culture Slides | BD | 354632 | |
| Multi-Purpose Rotator | Scientific Industries Inc | Model 151 | |
| DAPI Mounting Media | Millipore | S7113 | |
| PBS | Ambion | 9626 | |
| Dialyzer | Thermo Fisher Scientific | 66380 | |
| Amicon Ultra-0.5 | Millipore | UFC501096 | |
| Paraformaldehyde (4% solution) | Electron Microscopy Sciences | ||
| Nano-Drop | Thermo Fisher Scientific |
References
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