Tillverkning och tillämpning av Rose Bengal-kitosan Films i Laser Tissue Repair

Summary

Suturer behövs vanligen för att reparera vävnad under kirurgiska ingrepp. Däremot kan tillämpningen vara problematiskt eftersom de är invasiva och kan skada vävnad. Tillverkning och tillämpning metoder en ny vävnad bindemedlet här rapporteras. Denna adhesiva film laser-aktiverad och inte kräver användning av suturer.

Abstract

Fotokemisk vävnad bindning (PTB) är en suturfri teknik för vävnadsreparation, vilket uppnås genom att applicera en lösning av Rose Bengal (RB) mellan två vävnad kanter ^1,2. Dessa är sedan bestrålas med en laser som selektivt absorberas av RB. De resulterande fotokemiska reaktioner tvärbinder förment kollagenfibrer i vävnaden med minimal värmeproduktion ^3. I denna rapport har RB införlivats i tunna kitosan filmer att tillverka en ny vävnad lim som är laser-aktiverad. Adhesiva filmer, baserade på kitosan och innehållande ~ 0,1 vikt% RB, tillverkas och bundna till kalvtarm och råtta tibiala nerver genom en halvledarlaser (λ = 532 nm, Fluence ~ 110 J / cm ^2, fläckstorlek ~ 0,5 cm) . En enda kolumn tensiometer, gränssnitt med en persondator, används för att testa bindningsstyrkan. RB-kitosan adhesivbindningar stadigt till tarmen med en styrka av 15 ± 6 kPa (n = 30). Vidhäftningsstyrkan sjunker till 2 &plusmn, 2 kPa (n = 30) när lasern inte appliceras på bindemedlet. Anastomos av nerver tibiala kan också genomföras utan användning av suturer. Ett nytt kitosan bindemedel har tillverkats att obligationer fotokemiskt till vävnad och inte kräver suturer.

Protocol

1. Kitosan Självhäftande Framställning

1. Kitosan pulvret är lösligt i ättiksyralösning, för framställningen av en stamlösning av ättiksyra (2% volym / volym), tillsätt 10 ml isättika till 490 ml avjoniserat vatten (DI-H ₂ O).
2. För framställning av en stamlösning av Rose Bengal (RB) (0,01% vikt / volym) i ättiksyra, väger 5 mg RB i en injektionsflaska omlindad med aluminiumfolie för att undvika fotoblekning. Tillsätt 0,5 ml DI-H ₂ O för att lösa upp pulvret tillsätt sedan 49,5 ml ättiksyra stamlösningen (beskrivs i avsnitt 1,1).
3. För framställning av kitosan-lösning (1,7% vikt / volym), väger 0,85 g kitosan pulver (medel MW, 85% grad av acetylering) och tillsätt till 50 ml RB ättiksyralösning. Kontrollen framställdes genom upplösning av kitosan i ättiksyralösning utan RB.
4. Lägg en magnetisk omrörare till kitosanet blandningen och rör om vid rumstemperatur. För att säkerställa fullständig upplösning av komponenterna, rör kitosani ättiksyra + RB under två veckor och chitosan i ättiksyra under 5 dagar (kontroll). När kitosan löses, ökar lösningens pH från ~ 2,6 till ~ 3,9. Observera att RB är dåligt löslig i surt pH och det krävs en ökning av pH för lösningen och en förlängd omrörning tid att lösa.
5. Centrifugera lösningarna vid 3270 x g under 1 timme och samla upp supernatanten med användning av exempelvis, en steril 10 ml spruta. Se till att inte störa föroreningen pellets. Under detta steg är lösningen rengöras från makroskopiska orenheter och olösligt material.
6. Injicera (centrifugeras) kitosanlösning på en plan perpex platta med en steril spruta. Tjockleken av den torkade filmen beror på förhållandet mellan den utmatade mängden lösning och ytarean över vilken lösningen sprids. Säkerställ att lösningen är fri från luftbubblor och jämnt på plattan. För att få tunna filmer med ~ 13 um tjocklek, injicera ~ 1 ml lösning över 12 cm ² ytaområde (mått ~ 3x4 cm, figur 1a).
7. Täck plattan Perspex med en skärm, tillverkad av aluminiumfolie till exempel, för att undvika att fotoblekning av lösningen. Se till att tillräckligt ventilation garanteras att torka lösningen under skärmen.
8. Låt lösningen torka vid rumstemperatur (25 ° C) och tryck (1 atm) tills den resulterande filmen är olöslig i vatten och sväller inte makroskopiskt. Detta uppnås typiskt i 2 veckor.
9. Lossa filmerna försiktigt med en tunn och platt spatel: dessa filmer kan enkelt skalas bort Perspex plattan utan att skada dem.
10. Mät tjockleken hos filmerna med användning av en mikrometer.
11. Skär limmet i rektangulära remsor med en ren skarp sax och placera dem mellan sterila glasskivor att bevara sin platta form. Linda bilderna i aluminiumfolie för Ijusavskärmande och lagra dem i rumstemperatur. Märk lim med eller utan RB som "rose klister" eller "kitosan Adhesive "respektive.
12. Rosen adhesiva filmer kan steriliseras med användning av etanol (90%) eller med gammastrålning (0,1 kGy / h under 24 timmar) ^4,5.

2. Adhesiv optisk dämpning

1. Fäst rosen limmet inuti en kvarts kyvett.
2. Registrera sin försvagade spektrum i intervallet 400 till 800 nm med användning av en dubbel-stråle spektrofotometer ^4.
3. Förutsatt giltigheten av Beers lag, beräkna dämpningen längden av bindemedlet enligt följande: I = ₀ ^e-Ax där jag ₀ är den infallande strålens intensitet, 1 / A är dämpningen längd, och x är filmens tjocklek.
4. Upprepa steg från 2,1 till 2,3 för kitosanet bindemedlet att tjäna som en kontroll.

3 In Vitro Användning:. Laser Tissue Limning på Intestine

1. Skörd kalvtarm efter omedelbart djur eutanasi och förvara vid -80 ° C.
2. Före användning, tina och återfukta TIssue genom nedsänkning i _DI-H-2 O under 10 min.
3. HALVERA vävnaden i sektioner (2 x 1 cm) med en # 10 blad under ett operationsmikroskop (x10). Håll avsnitt fuktiga med DI-H ₂ O.
4. Ta snittet stubbar nära varandra (början till slut). Torka överflödigt vatten från ytan med hjälp bomull tips.
5. Placera en ros klisterremsan (10 x 6 mm) över snittet på serosa lagret med microforceps garanterar full kontakt med tarmen (figur 2).
6. Vävnaden vidhäftning rosen limmet aktiveras av en diod-pumpad halvledarlaser, som är kopplad till en optisk multimodfiber (kärndiameter 200 pm) ^4.
7. Ställ effektnivån hos lasern till 180 mW och bestråla limmet för ~ 6 minuter med en stråle punktstorlek ~ 5 mm, med de parametrar som anges i tabell 1. Spot-bestråla det adhesiva säkerställer att varje fläck bestrålas under ~ 5 sekunder innan du flyttar strålen till den intilliggande platsen. Thans förfarande garanterar att laserstrålen scannar hela ytan av de vidhäftande flera gånger.
8. För att bedöma styrkan vävnad bindning, klämma ett prov till en kalibrerad enda kolumn tensiometer (Instron, MA, USA) med mekaniska grepp. Flytta grepp på 22 mm / min tills de två vävnad stubbar separata ^4.
9. Placera en ros lim på vävnaden som beskrivs i steg 3,5. Undvik bestråla inte provet och mäta styrkan vävnad bindning såsom beskrivs i steg 3,8. Detta prov tjänar som en kontroll.

4 In Vivo Användning:. Tibialnerven Anastomos

1. Stillsam Wistar råtta med isofluran / O ₂ blandning (4% under induktion, 2% därefter) ^5. Subkutant injicera Buprenex (0,03 mg / kg) för att ge intraoperativ analgetisk aktivitet och lindra eventuella smärtor eller obehag.
2. Följande kirurgiska ingreppet bör utföras under ett operationsmikroskop (x10). Gör en sned hudsnitt ca 3 cm långa i dorso-laterala delen av höger lår och exponera tibialnerven med muskel-delning strategi genom sätesmusklerna ^2.
3. Delvis dissekera och trimma adventitia av tibialnerven med raka mikro-sax och absorbera överflödigt vatten med steril gasbinda eller tips bomull.
4. Skär tibial nerv med mikro-sax.
5. Placera en steril kitosan remsa (mått 5 x 4 mm) under tibialnerven med mikro-tång.
6. Ungefärlig nervstumparna end-to-end med mikro-tång över rosen klisterremsan.
7. Remsan vidhäftar helt nerven bildar en krage, som kan hjälpa till med rotationen av nerven under laserbestrålning av remsan.
8. Aktivera rosen bindemedlet med lasern som beskrivs i steg 3,6) och 3,7).
9. Trimma överflödiga steg limmet från kragen i det opererade nerven.
10. Stäng muskler och hud med fem 3-0 suturer ^5. Standard postoperativ återhämtning förfaranden bör följas även daglig tillsyn för sårruptur eller pus bildning och smärtstillande administration vid behov.

5. Representativa resultat

De filmer som erhålles är ljusa ros i färg, tunn och har en slät yta (fig. 1). De är också flexibla och kan rullas in rör med liten diameter utan att orsaka revor eller någon annan uppenbar skada (Figur 1B). Rosen bindemedlet har två absorptionstoppar vid 530 och 562 nm, det gröna lasern är således starkt absorberas av bindemedlet och motsvarande dämpning längd vid 532 nm är ~ 12 | im (figur 3). I motsats, dämpar kitosan filmer utan RB svagt lasern (1 / A ~ 162 ^ m), sannolikt på grund av spridning. Det framgår av spektra tomten att ingen signifikant aggregering av RB förekommer i filmerna.

Rosen adhesivbindningar stadigttill tarmen vid laserbestrålning (figur 2) uppnå en typisk maximal belastning vid brott av 0,9 ± 0,4 N (n = 30). Vidhäftningsstyrkan uppskattades som den maximala belastningen delat med den vidhäftande ytan, nämligen 15 ± 6 kPa (n = 30). Den icke-bestrålade ros bindemedel bundet betydligt mindre till vävnad (2 ± 2 kPa, n = 30, oparat t-test p <10 ^6). In vivo anastomos av tibialnerven uppnåddes framgångsrikt efter tillämpningen och bindning av den ökade bindemedlet i samband med grön laser. En vecka postoperativt, var det opererade nerv i kontinuitet och reparation styrka var 17 ± 9 kPa (n = 10).

Figur 1. A) RB-kitosanlösning gjuts på en plan platta Perspex (platta tjocklek ~ 5 mm). Rutat papper placeras under plattan för att underlätta den torra gjutna steg. Den vattenolösliga film erhålles två veckor efter gjutning. B) ros bindemedlet är flexibelt och kan rullas in i en liten cylinder.

Figur 2. Rosen bindemedlet är bundet till kalvtarm efter laserbestrålning. Likformig bestrålning anbringas på RB limmet under vävnads-bindning, men utvalda platser visas i denna bild för att illustrera fotoblekningsreaktion effekt lasern på limmet.

Figur 3. Absorptionsspektrumet (i godtyckliga enheter) av Rose limmet visar två toppar vid 530 och 562 nm. Den grön laser (λ = 532 nm) är således starkt absorberas av bindemedlet under laserexponering. Kitosan bindemedlet utan RB absorberar dåligt laserstrålen.

	n	2)	Effekt (W)	Tid (s)	Fluens (J / cm 2)	I (W / cm 2)	Max belastning / Area (kPa)
Lim + Laser	30	60 ± 10	0,18 ± 0,03	365 ± 5	~ 110	~ 0,9	15 ± 1
Lim	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

Tabell 1. Legend. n, provnummer, område, yta ros limmet (medelvärde ± största fel), Power, lasereffekt (medelvärde ± största fel), Tid, bestrålningstid (medelvärde ± största fel), Fluence, genomsnittlig laser fluens, jag, beräknade irradiance, Max belastning / Area, maximal belastning vid brott av den reparerade vävnaden dividerat med vidhäftande yta, (medelvärde ± SE).

Discussion

Rosen adhesiva tillverkning är baserad på en enkel torr gjuten processen, även om upplösningen av RB i surt pH kräver förlängd omrörning av kitosanlösningen. Det är viktigt att låta lösningen torka tills det blir en vattenolöslig film. Detta händer när vikten vattenhalten är ~ 10% i den torkade filmen ^6. Olösliga filmer erhålles vanligtvis 2 veckor efter torr-gjutning vid standardförhållanden av temperatur och tryck (~ 25 ° C och ~ 1 atm). Mekanismen av vävnad bindning är inte klart ännu, men det observerades att RB diffunderar från bindemedlet in i den intilliggande vävnaden, vilket gör att lasern till foto-aktivera det effektivt vid vävnadskontaktytan. Det kan spekuleras att RB förmåga att producera singlettsyre, vid ljusbestrålning, kan spela en roll vid tvärbindning vävnad kollagen och kitosan via sina aminogrupper ^7,8. En färsk studie om rosen limmet visade också att den maximala temperatur som uppnås under tissue-limning var ~ 32 ° C, stödja hypotesen om en fotokemisk process ^4. Andra suturfri tekniker för vävnadsreparation närvarande utreds av flera forskargrupper. Laser vävnad svetsning (LTW) till exempel har med framgång tillämpats inom ögonkirurgi av Pini m.fl. ^9. I allmänhet dock kan LTW orsaka säkerheter termiska skador som vävnad temperaturen kan nå 65-75 ° C under laserbestrålning. Cyanakrylatlim tillämpas också kliniskt för att stänga hudsår istället för suturer, men trots att de i allmänhet inte för inre organ reparation på grund av deras giftighet ^10. Även rosen lim (~ 15 kPa) har högre bindningsstyrka än fibrinlim (~ 8 kPa) ^11, cyanoakrylat lim är fortfarande den starkaste vidhäftningen (~ 150 kPa) ^12. Tjockleken på den ökade limmet kräver särskild uppmärksamhet under tillverkning: en tjock lim (≥ 20 um) skulle till exempel hindra lasernfrån att nå vävnadskontaktytan och skulle försvaga bindningsstyrkan på grund av överdriven absorption av lasern genom Rose Bengal. En tunn adhesiv (<10 ^ m), å andra sidan, skulle öka lasern irradians och fluens på limmet-vävnad. Emellertid bör försiktighet vidtas för att minska filmens tjocklek för att förhindra överdriven uppvärmning av vävnad under laserbestrålning. Rosen lim inducerar inga signifikanta cytotoxiska effekter på mänskliga fibroblaster ⁴ och har därmed en lovande användning reparation mjuk vävnad inne i kroppen, såsom tarmen och perifera nerver. Detta bindemedel kan också ha tillämpningar inom vävnadsteknik: Det kan integreras, exempelvis i ett bandage med extracellulära matriser för att reparera vävnad och förbättra sårläkning utan hjälp av suturer ^13. Det bör noteras att vi inte har observerat några betydande negativa effekter, inklusive lokal inflammation, som skall förknippas med detta förfarande.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rose Bengal	Sigma-Aldrich	632-69-9
Chitosan (medium MW)	Sigma-Aldrich	10318AJ
Glacial acetic acid	Sigma-Aldrich	08050051	2% v/v in DI water
Magnetic stirrer	Heidolph	MR Hei-Mix S
Centrifuge	Beckman Coulter Inc.	Allegra X-12R
Spectrophotometer	Varian Inc., Agilent	Cary 4000 UV-Visible
Laser	CNI Laser	MGL-532
Micrometer	Mitutoyo	Series 227
Surgical microscope	Carl Zeiss, Inc.	OPMI